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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Resumo

Este protocolo visa estabelecer um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação de integrinas β2, utilizando anticorpos notificadores de mudança conformacional e citometria de fluxo de alto rendimento. O método também pode servir como um guia para outros métodos de triagem de alto rendimento baseados em anticorpos. As integrinas β2 são moléculas de adesão leucocitárias específicas que são cruciais na resposta imune. Os neutrófilos dependem da ativação da integrina para sair da corrente sanguínea, não apenas para combater infecções, mas também para estar envolvidos em múltiplas doenças inflamatórias. O controle da ativação das integrinas β2 apresenta uma abordagem viável para o tratamento de doenças inflamatórias associadas a neutrófilos. Nesse protocolo, um anticorpo monoclonal, mAb24, que se liga especificamente ao headpiece de alta afinidade das integrinas β2, é utilizado para quantificar a ativação da integrina β2 em neutrófilos humanos primários isolados. N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) é usado como um estímulo para ativar integrinas β2 neutrófilos. Um citômetro de fluxo de alto rendimento capaz de executar automaticamente amostras de placas de 384 poços foi usado neste estudo. Os efeitos de 320 produtos químicos na inibição da integrina β2 são avaliados dentro de 3 h. Moléculas que têm como alvo direto integrinas β2 ou moléculas-alvo na via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina iniciada pelo receptor acoplado à proteína G podem ser identificadas através desta abordagem.

Introdução

Muitas doenças inflamatórias são caracterizadas pela infiltração de neutrófilos no local do edema ou lesão1. Para infiltração desses tecidos, os neutrófilos devem completar a cascata de recrutamento de neutrófilos, que envolve parada no endotélio, extravasamento através da parede do vaso e recrutamento para o tecido2. Os neutrófilos circulantes necessitam da ativação da integrina β2 para completar essa cascata, especialmente para a fase de parada. Assim, drogas inibidoras de integrinas que reduzem a adesão, o extravasamento e o recrutamento de neutrófilos podem efetivamente tratar doenças inflamatórias 3,4.

As integrinas β2 já foram alvo de doenças inflamatórias anteriormente. O efalizumabe, um anticorpo monoclonal que tem como alvo direto a integrina αLβ2, foi desenvolvido para o tratamento da psoríase5. Entretanto, o efalizumabe foi suspenso devido ao seu efeito colateral letal - leucoencefalopatia multifocal progressiva resultante da reativação do vírus JC 6,7. Novas terapias anti-inflamatórias baseadas em integrinas devem considerar a manutenção das funções anti-infecciosas dos leucócitos para minimizar os efeitos colaterais. Os efeitos colaterais do efalizumabe podem ser devidos à circulação prolongada de anticorpos monoclonais na corrente sanguínea, o que poderia inibir as funções imunes em longo prazo8. Um estudo recente mostra que o efalizumabe medeia ligações cruzadas αLβ2 e a internalização indesejada de integrinas α4, fornecendo uma explicação alternativa para os efeitos colaterais9. Assim, antagonistas de pequenas moléculas de curta duração poderiam evitar esse problema.

Um método de alto rendimento para triagem de antagonistas de integrinas β2 de pequenas moléculas usando neutrófilos humanos é apresentado aqui. A ativação da integrina β2 requer mudanças conformacionais do ectodomínio da integrina para obter acesso e aumentar sua afinidade de ligação ao seu ligante. No modelo canônico de switchblade, o ectodomínio de integrina dobrado-fechado primeiro se estende a uma conformação estendida-fechada e, em seguida, abre seu cabeçote para uma conformação estendida-aberta totalmente ativada10,11,12,13. Há também uma via alternativa que parte do dobrado-fechado para o dobrado-aberto e estendido-aberto, eventualmente 14,15,16,17,18,19. O anticorpo conformação-específico mAb24 liga-se a um epítopo no domínio β2-I-like humano quando a cabeça do ectodomínio está aberta20,21,22,23.

Aqui, mAb24-APC é usado para determinar se as integrinas β2 estão ativadas. Para ativar neutrófilos e integrinas, N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), um peptídeo quimiotático curto derivado de bactérias que pode ativar integrinas β2 de neutrófilos24, é usado como estímulo nesse protocolo. Quando fMLP se liga ao Fpr1 em neutrófilos, cascatas de sinalização a jusante envolvendo proteínas G, fosfolipase Cβ e γ de fosfoinositida 3-quinase são ativadas. Esses eventos de sinalização acabam resultando na ativação da integrina através da via de sinalização de dentro para fora18,25. Além de antagonistas de pequenas moléculas que se ligam diretamente às integrinas β2 e impedem mudanças conformacionais da ativação da integrina26, compostos que podem inibir componentes da via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina β2 também seriam detectados com este método. Os citômetros de fluxo automatizados permitem a triagem de alto rendimento. A identificação de novos antagonistas pode não apenas aprofundar nossa compreensão da fisiologia das integrinas, mas também fornecer informações translacionais sobre a terapia anti-inflamatória baseada em integrina.

Protocolo

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis não identificados após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UConn Health, seguindo os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os doadores assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os critérios de inclusão/exclusão deste estudo foram cuidadosamente desenvolvidos para garantir a adequação dos participantes e minimizar potenciais riscos. Os participantes elegíveis tinham idade entre 18 e 65 anos, de qualquer etnia, fluentes na língua inglesa e capazes de fornecer consentimento informado. Os participantes excluídos incluíram aqueles incapazes de fornecer consentimento informado para si mesmos, tais como aqueles que exigem um representante legalmente autorizado, indivíduos com menos de 18 anos ou mais de 65 anos, indivíduos encarcerados e mulheres grávidas. Além disso, os participantes tinham que estar livres do uso de medicamentos anti-inflamatórios e condições inflamatórias. Infecções atuais ou condições inflamatórias crônicas ou agudas em curso também foram critérios de exclusão. Finalmente, os indivíduos com uma história actual ou recente da infecção COVID-19 eram inelegíveis para o estudo. Esses critérios foram elaborados para garantir a segurança e adequação dos participantes, minimizando potenciais fatores de confusão que poderiam impactar os resultados do estudo.

1. Preparação dos reagentes

  1. Meio neutrófilo: Preparar o meio neutrófilo adicionando albumina sérica humana a 2% ao RPMI-1640 sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais).
  2. Solução de fMLP: Prepare a solução de fMLP diluindo-a 100 vezes a partir da solução de armazenamento de dimetilsulfóxido de fMLP (DMSO) de 10 mM (consulte Tabela de Materiais) com RPMI 1640 sem vermelho de fenol, resultando em uma solução de fMLP de 100 μM.
  3. Solução de anticorpos: Diluir 120 μL do anticorpo monoclonal conjugado com aloficocianina (APC) mAb24 (mAb24-APC) (ver Tabela de Materiais), que relata a conformação de alta afinidade da integrina β2, em 10 mL de meio neutrófilo, criando uma solução de 1,2 μg/mL de mAb24-APC.
  4. Biblioteca de compostos: Diluir a biblioteca de compostos inicial com uma concentração de 10 mM a 1 mM adicionando 5 μL da biblioteca de 10 mM (ver Tabela de Materiais) a 45 μL de DMSO em placas de 384 poços usando o manipulador de líquidos. Posteriormente, transfira 5 μL por poço da biblioteca composta de 1 mM para uma placa vazia de 384 poços usando o manipulador de líquidos.
  5. Conforme ilustrado na Figura 1, quatro colunas ( 1, 2, 23, 24) continham apenas DMSO, mas nenhum composto, servindo como controles positivo e negativo na triagem. Diluir ainda mais cada poço adicionando 45 μL de RPMI-1640 sem vermelho fenol, resultando em uma concentração final de 100 μM para todos os compostos.

2. Isolamento de neutrófilos do sangue humano

  1. Usando uma pipeta sorológica, coloque cuidadosamente 4 mL de sangue sobre 8 mL de um meio de gradiente de densidade comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) em um tubo centrífugo de 15 mL (Figura 2A).
  2. Centrifugar o sangue a 550 × g durante 30-50 minutos a 20 °C. Desacelerar o rotor gradualmente (fator de desaceleração de 1).
    NOTA: A separação bem sucedida dos neutrófilos (banda 2 na Figura 2B) das hemácias pode variar entre os doadores. Para a maioria dos doadores, uma centrifugação de 30 min é suficiente. No entanto, para alguns doadores, um adicional de 10-30 minutos de centrifugação pode ser necessário se a separação não for bem-sucedida (Figura 2C).
  3. Remova cuidadosamente o plasma (o líquido amarelo no topo) e as células mononucleares (a faixa turva superior; PBMC band na Figura 2B) utilizando uma pipeta de 1 mL.
  4. Coletar neutrófilos da banda turva inferior (banda de neutrófilos na Figura 2B) e aproximadamente 3-4 mL abaixo do líquido claro em um tubo centrífugo de 15 mL contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Misture suavemente a suspensão de neutrófilos, invertendo-a 2-3 vezes.
  5. Centrifugar a suspensão a 400 × g durante 10 min a 20 °C e, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante por decantação.
  6. Ressuspender suavemente o pellet com 5 mL de PBS e centrifuga-lo a 300 × g por 5 min a 20 °C.
  7. Remova o sobrenadante por decantação e elimine cuidadosamente qualquer sobrenadante residual ao redor da boca do tubo e na parede do tubo usando sucção a vácuo. Ressuspender o pellet em 1 mL de meio neutrófilo.
  8. Conte os números celulares usando um hemocitômetro. Tipicamente, 1 a 4 × 107 neutrófilos foram obtidos a partir de 8 mL de sangue humano.
    NOTA: Pode haver contaminação de hemácias na suspensão de neutrófilos. As hemácias não afetam significativamente a maioria dos ensaios e podem prevenir a ativação/priming neutrofílico27. As hemácias precisam ser lisadas antes da contagem para obter uma concentração precisa de neutrófilos. Adicionar 10 μL da suspensão celular a 891 μL de água deionizada por 10-30 s para lisar as hemácias, em seguida, adicionar 99 μL de 10× PBS para equilibrar a pressão osmótica, evitando a lise dos neutrófilos.
  9. Ajustar a densidade celular para 6,25 × 105 células/mL adicionando meio neutrófilo.

3. Preparação da placa de 384 poços

  1. Em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, combinar 1 mL da solução de anticorpos (1,2 μg/mL mAb24-APC) com 0,2 mL de meio neutrófilo para criar uma solução de 1 μg/mL de mAb24-APC. Em seguida, adicione 25 μL dessa mistura aos poços de controle negativo em uma placa de 384 poços (os poços azuis da Figura 1).
  2. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, misturar 9 mL da solução de anticorpos com 21,6 μL da solução de fMLP (100 μM) e 1,7784 mL de meio neutrófilo para criar uma solução contendo 1 μg/mL de mAb24-APC e 200 nM de fMLP. Em seguida, adicione 25 μL dessa mistura aos poços de controle positivo e teste em uma placa de 384 poços (os poços vermelho e azul na Figura 1).
  3. Transfira 5 μL das soluções compostas de 100 μM da placa de biblioteca de compostos para a placa de 384 poços usando uma pipeta multicanal.
  4. Centrifugar o líquido durante 1 min a 500 × g, à temperatura ambiente.
    NOTA: Para centrifugar placas, é necessário um rotor de caçamba oscilante e caçambas de placa.

4. Tratamento de células

  1. Adicionar 20 μL da suspensão de neutrófilos a cada poço usando uma pipeta de 16 canais (faixa de 5-50 μL, para cada coluna da placa de 384 poços). Misture suavemente 5-10 vezes usando a pipeta, mantendo um intervalo de tempo consistente entre cada pipetagem.
    NOTA: As concentrações finais nos poços são as seguintes: neutrófilos 2,5 × 105 células/mL (todos os poços); mAb24-APC 0,5 μg/mL (todos os poços); fMLP 100 nM (poços de controle positivo e teste); compostos de 10 μM (poços de teste).
  2. Incubar a placa num agitador a 300 rpm, à temperatura ambiente (TR), durante 10 min.
  3. Fixar as células adicionando 3 μL de paraformaldeído (PFA) a 16% em cada poço usando uma pipeta de 16 canais (concentração final de PFA ~0,91%). Em seguida, incube no gelo por 10 min.
    NOTA: Recomenda-se manter um intervalo de tempo consistente entre colunas diferentes ao adicionar neutrófilos e PFA. Isso garante que os neutrófilos em cada poço tenham o mesmo tempo de incubação com fMLP e mAb24-APC.

5. Citometria de fluxo

  1. Ligue o citômetro de fluxo (consulte Tabela de Materiais) e verifique se o computador conectado ao instrumento também está ligado.
  2. Certifique-se de que o recipiente de fluido de bainha esteja cheio e que o recipiente de resíduos esteja vazio e devidamente conectado ao instrumento.
  3. Coloque a placa de 384 poços no carregador de amostras do citômetro de fluxo. Certifique-se de que o poço A1 da placa esteja alinhado com a marca A1 na carregadeira.
  4. Abra o software e crie um novo experimento. Selecione bem 384 e escolha os fluoróforos desejados. Em seguida, clique em Configuração da placa, arraste para selecionar todos os poços e, em seguida, clique em Amostra. Ative a opção "Alta taxa de transferência" e selecione Alta no painel de taxas.
    1. Na caixa de volume, digite 50. Selecione amostras em colunas ímpares e, em seguida, ative a opção "Agitação". Finalmente, nomeie os exemplos no painel direito.
  5. Clique em Plot e gate. Em seguida, clique no botão Aplicar (duas setas em um círculo preenchido com verde) e, posteriormente, clique no botão de reprodução (forma de triângulo). Aguarde alguns segundos para observar algumas células do primeiro poço e, em seguida, clique no botão de pausa .
    1. Ajuste as tensões FSC e SSC para garantir a visualização adequada das células no gráfico. Clique em Aquisição e, em seguida, clique no botão play (forma de triângulo) para iniciar o ensaio.
  6. O citômetro de fluxo coletará sequencialmente ~50 μL de 1000-3000 neutrófilos de cada poço. Levará aproximadamente 3 h para completar toda a placa de 384 poços.
  7. Depois de concluir todos os exemplos, exporte os arquivos .fcs para a próxima etapa.

6. Análise dos dados

  1. Abra o software de análise de dados de citometria de fluxo (consulte Tabela de Materiais). Selecione e arraste a pasta que contém todos os arquivos .fcs para a janela do software e, em seguida, solte para importar os dados para o software.
  2. Clique duas vezes em uma amostra, com base em FSC e SSC28,29,30 na janela pop-up, como mostra a Figura 3. Selecione as linhas fechadas e arraste-as para a pasta e, em seguida, solte para aplicar o limite a todas as amostras nessa pasta.
  3. Calcule e exporte a intensidade de fluorescência mediana (MFI) APC de neutrófilos de cada poço usando a função de editor de tabelas do software. Clique em Adicionar coluna na guia Editar . Selecione Mediana na guia Estatística , escolha os neutrófilos da população fechada e selecione APC como parâmetro. Clique no botão OK .
  4. Retorne à guia "Editor de tabela", selecione Todas as amostras na guia "Grupo" e pressione o botão Criar tabela . Uma nova janela aparecerá exibindo a tabela criada. Salve-o como um arquivo de texto, CSV ou Excel.
  5. Abra a tabela exportada, calcule o valor médio e o desvio padrão da IFM APC para as amostras controle positivo e negativo (Figura 4).
  6. Calcule o fator Z (Z') da placa usando a equação:
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    onde σ p e σ n são os desvios-padrão dos controles positivo e negativo, respectivamente, e μp e μn são as médias dos controles positivo e negativo, respectivamente31.
    NOTA: O fator Z' indica a separação das distribuições de controle positivo e negativo. Um Z' de 0 significa nenhuma separação, enquanto um Z' de 0,5 indica separação igual. Como mencionado em um estudo anterior31, Z' > 0,5 indica um excelente ensaio para triagem de compostos. Um Z' na faixa de 0,5 a 0 é aceitável, mas pode identificar apenas acertos fortes no ensaio, o que exigirá validação adicional em ensaios secundários.
  7. Considerar compostos como "acertos" para triagem quando a IFM APC de neutrófilos tratados com compostos for menor que três vezes o desvio padrão da MFI de controle positivo subtraída da MFI de controle positivo (P = 0,0013, representada pela linha pontilhada na Figura 4).

Resultados

Dados de uma triagem representativa de placas de 384 poços (Figura 4) revelaram que os controles negativos tinham uma MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, enquanto os controles positivos tinham uma MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. O fator Z' para esta placa é de aproximadamente 0,33, que está dentro de uma faixa aceitável31. No entanto, Z' requer validação adicional em ensaios secundários.

Para normalizar os dados, todos os valores foram...

Discussão

O início e o término da estimulação e coloração de neutrófilos são determinados pela adição de neutrófilos e do PFA fixador. Portanto, garantir o mesmo intervalo de tempo entre a pipetagem de neutrófilos ou PFA em cada coluna é fundamental. Isso garante que o tempo de estimulação e coloração dos neutrófilos de cada poço permaneça consistente. Devido ao curto tempo de vida dos neutrófilos, todo o experimento, desde a coleta de sangue de doadores até a conclusão da citometria de fluxo, deve ser reali...

Divulgações

Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Evan Jellison e à Sra. Li Zhu no núcleo de citometria de fluxo da UConn Health por sua assistência com a citometria de fluxo, à Dra. Lynn Puddington no Departamento de Imunologia da UConn Health por seu apoio aos instrumentos, à Sra. Slawa Gajewska e ao Dr. Paul Appleton no núcleo de pesquisa clínica da UConn Health por sua ajuda na obtenção de amostras de sangue. Agradecemos ao Dr. Christopher "Kit" Bonin e ao Dr. Geneva Hargis da UConn School of Medicine por sua ajuda com a redação científica e edição deste manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), EUA, um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da American Heart Association (18CDA34110426) e um fundo de startups da UConn Health. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
16-channel pipettesThermo4661090NInstrument
384-well plateGreiner784201Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24BioLegend363410Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform Agilent16050-102384 multi-channel liquid handler
CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
FlowJoBecton, Dickinson & CompanyNASoftware
Human Serum Albumin Solution (25%)GeminiBio800-120Reagents
LifitegrastThermofisher 50-208-2121Reagents
Nexinhib20Tocris6089Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)SigmaF3506Reagents
Paraformaldehyde 16% solutionElectron Microscopy Sciences15710Reagents
Plate bucketsEppendorfUL155Accessory
Plate shaker Fisher88-861-023Instrument
PolymorphPrepPROGEN1895 (previous 1114683)Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)Prestwick Chemical LibrariesVer19_3841520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol redGibco11-835-030Reagents
Swing-bucket rotor EppendorfA-4-62Rotor
ZE5 Cell AnalyzerBio-Rad LaboratoriesModel ZE5Instrument

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