JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو العلامة المثالية لتقييم وظائف الكلى. ومع ذلك ، فإن طريقة القياس القياسية باستخدام حقن الأنسولين مع تحليل الدم والبول التسلسلي غير عملية. تحدد هذه المقالة طريقة عملية لقياس GFR عبر الجلد في الخنازير.

Abstract

تم استخدام القياس عبر الجلد لمعدل الترشيح الكبيبي (GFR) لتقييم وظائف الكلى في الحيوانات الواعية. هذه التقنية راسخة في القوارض لدراسة إصابة الكلى الحادة وأمراض الكلى المزمنة. ومع ذلك ، لم يتم التحقق من صحة قياس GFR باستخدام النظام عبر الجلد في الخنازير ، وهو نوع له نظام كلوي مشابه للبشر. ومن ثم ، قمنا بالتحقيق في تأثير الإنتان على GFR عبر الجلد في الخنازير حديثي الولادة المخدرة والتهوية الميكانيكية. تم تحفيز الإنتان متعدد الميكروبات عن طريق ربط وثقب cecal (CLP). تم إرفاق نظام قياس GFR عبر الجلد الذي يتكون من مستشعر مضان مصغر بجلد الخنزير المحلوق لتحديد إزالة الفلوريسئين-أيزوثيوسيانات (FITC) السينيسترين المترافق ، وهو متتبع GFR عن طريق الوريد. تظهر نتائجنا أنه في 12 ساعة بعد CLP ، زاد الكرياتينين في الدم مع انخفاض في GFR. توضح هذه الدراسة ، لأول مرة ، فائدة نهج GFR عبر الجلد في تحديد وظيفة الكلى في الخنازير حديثي الولادة ذات التهوية الميكانيكية.

Introduction

التقييم العملي والكمي لوظيفة الكلى هو قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) ، والذي يوضح مدى جودة تصفية الكلى للدم بناء على مبدأ التخليص1. طريقة سابقة لقياس GFR تستلزم الحقن في الوريد للمركبات الخارجية مثل الأنسولين أو sinistrin ، وإجراء قياسات متسلسلة لمستويات البلازما / المسالك البولية للكشف عن تخليصها 2,3. هذه الطريقة مرهقة ، وتتطلب الجمع التسلسلي لعينات البلازما والبول4. البديل هو قياس المنتجات النهائية الأيضية الذاتية مثل الكرياتينين. ومع ذلك ، فإن هذا يستغرق وقتا طويلا ، وفي بعض الأحيان ، غير دقيق ، حيث لا يتم ترشيحه بواسطة الكبيبة فحسب ، بل يتم إفرازه أيضا بواسطة الأنابيب 5,6. علاوة على ذلك ، يتأثر مستوى الكرياتينين بالجنس والعمر والنظام الغذائي وكتلة العضلات7،8،9.

مقياس أكثر دقة وأقل توغلا واستخداما على نطاق واسع ل GFR هو استخدام شاشات GFR عبر الجلد ، والتي تقيس GFR في الوقت الفعلي في الحيوانات 4,10. Sinistrin ، علامة كلوية خارجية عالية الذوبان ومرشحة بحرية ، موسومة بالفلوريسئين-أيزوثيوسيانات (FITC). يتم حقن هذا المركب المترافق عن طريق الوريد ، ويمكن تقييم وظائف الكلى في الوقت الفعلي دون جمع عينات الدم والبول11. تم التحقق من صحة استخدام قياس GFR عبر الجلد في القوارض 12 والكلاب13 والقطط14 ، ولكن ليس في الخنازير.

تشترك أنواع الخنازير في العديد من الخصائص التشريحية والفسيولوجية مع البشر ، مما يجعلها مثالية لدراسة الأمراض البشرية المختلفة15. أصبح استخدام الخنازير في البحوث الطبية الحيوية الانتقالية شائعا بشكل متزايد ومفضلا على نماذج القوارض لأنه يحاكي علم وظائف الأعضاء البشرية والفيزيولوجيا المرضية16. تهتم الخنازير الوليدية بفهم آليات الأمراض الفريدة لمرضى الأطفال17. علاوة على ذلك ، فإن التقدم الأخير في زراعة الخنازير إلى الأعضاء البشرية يضع الرغبة في توسيع أدوات التشخيص للتجارب قبل السريرية والسريرية18،19،20،21. تقدم هذه الورقة ، لأول مرة ، دليلا لاستخدام الجهاز عبر الجلد في قياس GFR في الخنازير الوليدية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت كتابة الإجراءات وفقا للمعايير الوطنية لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تينيسي (UTHSC).

ملاحظة: تتعرض الخنازير في المجموعة التجريبية لربط وثقب cecal ، في حين أن المجموعة الوهمية تخضع فقط لفتح البطن دون ربط cecal أو ثقب. يتم الاحتفاظ بالخنازير في كلا المجموعتين تحت التخدير لمدة 12 ساعة بعد الإجراء لإتاحة الوقت الكافي للإنتان وإصابة الكلى الحادة (AKI) في المجموعة التجريبية. سيتبع ذلك قياس GFR عبر الجلد في 8 ساعات بعد الإجراء لمدة 12 ساعة.

1. توريد الخنازير والإسكان

  1. حدد مزرعة خنازير محلية يمكنها توفير خنازير حديثي الولادة تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام. حدد موعدا للتسليم في وقت مبكر من الأسبوع لإكمال التجربة قبل أن يزيد عمر أي خنازير صغيرة عن 7 أيام.
    ملاحظة: قدم المورد ثلاثة إلى خمسة خنازير يوم الاثنين لهذه التجربة. بحلول يوم الجمعة ، كانت الخنازير قد خضعت للتجربة. يعد استخدام نفس الجنس والعمر القريب من نفس العمر أمرا ضروريا لتجنب العوامل المربكة.
  2. عند وصول الخنزير الصغير ، تأكد من أن لديهم هوية فردية (على سبيل المثال ، علامة أذن وسجل يتضمن الوزن والعمر).
  3. ضع الخنازير في وحدة رعاية المختبر (LACU) تحت رعاية طبيب بيطري مرخص. يتم إيواء الحيوانات كمجموعة في حظيرة واسعة ذات أرضية خرسانية صلبة يمكن غسلها بسهولة بالماء للحفاظ على الصرف الصحي الجيد.
  4. أضف قطعة أثاث مثل كرة ثقيلة للسماح بالإثراء والتحفيز البيئي.
  5. تأكد من أن وحدة LACU توفر الظروف البيئية المثلى ، بما في ذلك العناصر الرئيسية التالية: الصرف الصحي ، والتغذية ، والتحكم في درجة الحرارة ، والتهوية ، ودورة النهار والليل من خلال التحكم في الإضاءة.
  6. اطلب من الطبيب البيطري فحص الخنزير الصغير يوميا ، بما في ذلك قياس الوزن ، لإبلاغ المحقق إذا ظهر أي خنزير صغير مريضا ، مما قد يستلزم استبعاده من التجربة.
  7. اترك الخنازير لمدة 1 يوم على الأقل للتأقلم مع البيئة ، مما يساعد على تقليل التوتر.

2. التحضير قبل الجراحة

  1. جهز المحطة الجراحية قبل بدء التجربة. يتضمن ذلك وسادة تدفئة ، وقسطرة ، وجهاز تهوية ، وأنبوب قصبة هوائية ، ومحلول ملحي هيبارين ، وكيس من سائل اللاكتات الجرس.
    ملاحظة: الخنازير لديها قدرة تنظيم حراري ضعيفة وعرضة لانخفاض حرارة الجسم مما يغير ديناميكا الدم22,23. لذلك ، من الضروري إتاحة الوقت الكافي لتسخين وسادة التدفئة.
  2. تحضير 10 ملغ/مل من كلورالوز α عن طريق خلطه مع محلول ملحي على حرارة 60 درجة مئوية حتى يصبح الخليط صافيا. لا تسخن المحلول لتجنب تبلور الدواء عند التبريد. تصفية مع مرشح حقنة (حجم 0.22 ميكرومتر) قبل إعطاء الخنازير.
  3. أعد دواء مخدرا على أساس وزن الحيوان - الكيتامين: 20 ملغم / كغم والزيلازين: 2.2 ملغم / كغم. استخدم α كلورالوز (5 مل / كجم) للحفاظ على التخدير.
    ملاحظة: يستخدم α -chloralose بسبب سهولة الإعطاء الوريدي عند مقارنته بالاستنشاق
    التخدير ، حيث يتطلب الأخير آلة تخدير ونظام كسح مناسب يتم تسليمه عبر أنبوب القصبة الهوائية.

3. التخدير

  1. إجراء تحريض التخدير في قلم الخنزير ، وهي بيئة مألوفة للخنازير ، لتجنب الإجهاد غير المبرر.
  2. قطف الخنزير الصغير برفق من الأرجل الخلفية واستخدم الكيتامين: 20 ملغ/كغ والزيلازين: 2.2 ملغ/كغ في الساق الخلفية عند العضلة نصف الغشائية/نصف الوترية، باستخدام إبرة 23 غ 3/4.
  3. انتظر بضع دقائق حتى تصبح الأدوية سارية المفعول. تحقق من مستوى التخدير الكافي من خلال التأكد من استرخاء الحيوان بدرجة كافية ليكون غير متحرك ، مع فقدان منعكس الجفن ونغمة الفك للسماح بسهولة النقل الآمن إلى محطة الجراحة. تقييم منعكس الجفن عن طريق لمس الزاوية الداخلية للعين. غياب الوميض يشير إلى التخدير الكافي.

4. فغر القصبة الهوائية

ملاحظة: هذه التجربة غير قابلة للبقاء على قيد الحياة ، لذلك يتم إجراء بضع القصبة الهوائية لإنشاء مجرى هوائي للتهوية الميكانيكية. القصبة الهوائية هو إجراء سريع وسهل ، على عكس التنبيب الرغامي ، وهو أمر صعب في الخنازير بالنظر إلى تشريح الرأس ومجرى الهواء العلوي24,25. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الإبلاغ عن تشنج الحنجرة بشكل شائع أثناء التنبيب ، مما يؤدي إلى فترة طويلة من نقص الأكسجة وفرط الكربوهيدرات التي قد تضر بالنتائج26.

  1. ضع الخنزير الصغير في التمدد الظهري. التعرف على غضروف الغدة الدرقية عن طريق ملامسة بروز غضروف الغدة الدرقية الذي يشعر بالصلابة. تعقيم المنطقة باستخدام البوفيدون اليود و 70 ٪ من الإيثانول قبل تطبيق ستارة معقمة.
  2. باستخدام شفرة جراحية ، قم بعمل شق خط الوسط البطني 2-3 سم أدنى من الطرف الذيلي للغضروف الدرقي.
  3. باستخدام مرقئ البعوض المنحني ، قم بتشريح الأنسجة والعضلات تحت الجلد بصراحة (القصية والإشريكية القولونية الجلدية) حتى يتم تصور غشاء الغدة الدرقية وحلقات القصبة الهوائية القليلة الأولى. عند التشريح ، كن حذرا لتجنب إصابة أي أوعية دموية.
  4. احصل على رؤية واضحة لغشاء الغدة الدرقية وحلقات القصبة الهوائية24 ، ثم استخدم زوجا من ملقط الزاوية اليمنى الطويل لرفع الهياكل.
    1. باستخدام مقص صغير ، قم بعمل قطع صغير في غشاء الغدة الدرقية أو حلقة القصبة الهوائية الأولى. قم بتمديد القطع أفقيا إلى ~ 0.5 سم لتمرير أنبوب القصبة الهوائية 3.0 مم.
    2. أدخل الأنبوب إلى علامة 5 سم. تأكد من توسيع الصدر الثنائي وأصوات التنفس قبل تأمين الأنبوب.
  5. مرر الشريط السري حول القصبة الهوائية لتثبيتها في مكانها. يتم استخدام شريط إضافي لتثبيت الأنبوب بقاعدة الفك.
  6. قم بتشغيل جهاز التنفس الصناعي ، وقم بتوصيل الأنبوب الرغامي ، ولف المقابض المحددة (على سبيل المثال. مقابض SIMV ، مقابض PEEP ، إلخ) لتحديد إعدادات خط الأساس التالية. وضع التحكم في الضغط: التهوية الميكانيكية المتقطعة المتزامنة (SIMV) ؛ ذروة ضغط الشهيق (PIP) - 15 ؛ ضغط الزفير النهائي الإيجابي (PEEP) - 5 ؛ معدل- 20 ؛ أنا الوقت - 0.6. بعد التحليل الأول لغازات الدم ، اضبط إعدادات جهاز التنفس الصناعي وفقا لنتائج غازات الدم ، بهدف الحفاظ على الأوكسجين والتهوية الكافيين.

5. قنية وعاء الفخذ

  1. قم بإنشاء مجرى الهواء والتهوية ، قبل تحويل الانتباه إلى الأوعية الفخذية للوصول الوريدي ومراقبة ضغط الدم الغازية. يتم التعرف على الشريان الفخذي من خلال الشعور بنبض في الأخدود بين عضلات سارتوريوس و gracilis ، ويمكن العثور على الوريد فقط الإنسي للشريان.
  2. بينما يكون الخنزير الصغير مستلقيا في وضع راقد ظهري ، قم بتعقيم منطقة الفخذ باستخدام بوفيدون اليود والإيثانول ، وقم بتطبيق ثنى بحجم مناسب.
  3. استخدم شفرة جراحية لإنشاء شق طولي 3-4 سم ، يبدأ من الجمجمة عند الثنية الأربية ويمتد بعيدا على طول قناة الفخذ.
  4. تطبيق تشريح حاد وحاد ، وذلك باستخدام ملقط البعوض المنحني ومقص ، على التوالي ، لتشريح وصولا إلى مستوى حزمة الأوعية الدموية العصبية الفخذية. يمكن العثور على الحزمة في عمق جسم عضلة gracillis27. تشريح الشريان الفخذي والوريد محيطيا على مدار 2-3 سم للسماح بالقنية. ربط الفروع الجانبية الصغيرة إذا لزم الأمر.
  5. ضع ربطة عنق حريرية 3.0 على كل من الشريان والأطراف القريبة والبعيدة للشريان والوريد لتطبيق الجر. اربط خياطة الحرير البعيدة على كل من الوريد والشريان ، وربط الأوعية.
  6. بدءا من الوريد الفخذي ، حافظ على الجر البعيد والقريب على الروابط الحريرية ثم استخدم مقصا دقيقا لإنشاء بضع الوريد.
  7. بعد ذلك ، استخدم مقدمة قسطرة اختيار الوريد لفتح الوعاء أثناء إدخال قسطرة البولي يوريثين المقاسة مسبقا بقطر داخلي × قطر خارجي يبلغ 0.86 مم × 1.32 مم. بمجرد إدخاله ، اربط خياطة الحرير 3.0 القريبة لتثبيت القسطرة. اغسل القسطرة ب 3 مل من محلول ملحي هيبارين (1 وحدة / مل). يمكن صنع هذا المحلول بإضافة 0.5 مل من الهيبارين إلى 50 مل من المحلول الملحي العادي.
  8. أدخل قسطرة ضغط الدم الغازية باستخدام نفس النهج أعلاه لإنشاء بضع الشرايين وتمرير القسطرة.
    ملاحظة: الحفاظ على الجر البعيد والقريب أمر ضروري لتقليل فقدان الدم عند الوصول إلى الشريان.
  9. بمجرد تأمين القسطرة ، قم بتغطية الموقع بشاش مبلل بالمحلول الملحي ، وإذا لزم الأمر ، يمكن خياطة الجلد باستخدام خياطة حريرية 3.0 لمنع العدوى.

6. الحفاظ على التخدير والسوائل وغازات الدم

  1. مراقبة عمق التخدير طوال التجربة ، باستخدام نغمة الفك ومنعكس الجفن ، وتطبيق α كلورالوز ، عن طريق الوريد ، حسب الحاجة للحفاظ على الحيوان تحت التخدير العميق. استخدم جرعة تحميل أولية تبلغ 50 مجم / كجم ، و 20 مجم / كجم لمزيد من البلعة.
  2. قم ببث لاكتات الرنين بمعدل 4 مل / كجم / ساعة طوال التجربة كسائل صيانة. على سبيل المثال ، إذا كان وزن الخنزير الصغير 3 كجم ، فإن معدل ضخ السوائل هو 12 مل / ساعة.
  3. لتحليل الغازات بجانب السرير ، اسحب عينة دم شريانية في حقنة غاز الدم الهيبارين وقدم العينة إلى آلة التحليل. حدد الخيار غازات الدم الشرياني ، وانتظر ~ 2-3 ثانية حتى يقدم المحلل إبرة سحب الدم.
    1. أدخل الإبرة بعناية في نهاية المحقنة التي تحتوي على عينة الدم. انتظر حتى يقوم المحلل بشفط العينة المطلوبة وسحب المحقنة. اسمح للجهاز بتحليل غازات الدم وتقديم النتائج.
    2. بناء على النتائج ، اضبط جهاز التنفس الصناعي للحفاظ على درجة الحموضة بين 7.35-7.45 ، والضغط الجزئي لثاني أكسيد الكربون (PCO2) بين 35-45 مم زئبق ، والضغط الجزئي للأكسجين (PaO2) بين 80-150 مم زئبق. تختلف الإعدادات بناء على نوع جهاز التنفس الصناعي ، ولكنها تتضمن إلى حد كبير زيادة أو تقليل معدل التنفس باستخدام المقابض المناسبة للتعويض عن نقص الأكسجة و / أو فرط ثنائي أكسيد الكربون.
  4. اسحب 3 مل من الدم إلى أنبوب أخضر فاتح (هيبارين الليثيوم). جهاز طرد مركزي للعينة عند 2000 ×جم لمدة 15 دقيقة ، مع الحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية لاستخراج البلازما. بمجرد الانتهاء ، يمكن تحليل البلازما على الفور لمستوى الكرياتينين في الدم باستخدام محلل الكيمياء بجانب السرير أو تخزينها في -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقا.
  5. راقب درجة الحرارة باستمرار باستخدام مقياس حرارة مسبار المستقيم واضبط درجة حرارة وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الخنزير الصغير بين 101 إلى 103 درجة فهرنهايت.

7. مجموعة التجربة. ربط وانثقاب cecal (CLP) 25،28،29

ملاحظة: بالنسبة للخنازير الصغيرة في مجموعة التجربة ، قم بإجراء CLP للحث على تعفن الدم متعدد الميكروبات28 ومراقبة الحيوان لمدة 12 ساعة بعد الجراحة لإتاحة الوقت الكافي لحدوث تعفن الدم الشديد. يبدأ تسجيل GFR عبر الجلد في 8 ساعات بعد ربط cecal للسماح ب 4 ساعات من التسجيل.

  1. استخدم شفرة جراحية لإنشاء شق عمودي متوسط أيسر 5-6 سم ، حيث يقع الأعور في الخنازير في الحفرة القطنية اليسرى30. تشريح طبقات جدار البطن ، وتجنب إصابة الأوعية الشرسوفية السطحية.
  2. بمجرد شق الطبقة البريتونية ، استخدم المبعدة لتحسين الوصول إلى الهياكل الداخلية.
  3. تحديد القولون الحلزوني في الربع الأيسر العلوي من البطن. تتبع القولون الحلزوني ، ذيليا وظهريا ، لتحديد موقع الأعور. يرى الدقاق ينضم إلى القولون الحلزوني في قاعدة الأعور.
  4. قم بربط الأعور بعيدا عن التقاطع اللفائفي الأعور (الشكل 1).
  5. باستخدام إبرة 18 G ، قم بعمل سبعة ثقوب في الأعور وقذف البراز في المنطقة البريتونية.
  6. أغلق البطن في طبقات بخياطة حريرية 3.0 باستخدام غرز بسيطة متقطعة أو مستمرة. يمكن أيضا استخدام دباسة لإغلاق طبقة الجلد إذا كانت متوفرة.

8. مجموعة الشام

  1. اتبع الخطوات 7.2-7.4 على النحو الوارد أعلاه. بعد تحديد الأعور ، ضعه مرة أخرى دون أن يمسه وأغلق جدار البطن بالمثل.
  2. راقب الخنازير في المجموعة الوهمية لمدة 12 ساعة للقضاء على أي تحيز مربك يعزى إلى التعرض الطويل للتخدير.

9. إعداد جهاز GFR عبر الجلد

  1. بعد 8 ساعات من ربط cecal ، استعد لبدء القياس عبر الجلد ل GFR.
  2. استخدم الإصدار 3.0 من برنامج خدمة MB لضبط معدل أخذ العينات على جهاز GFR. باختصار ، قم بتوصيل جهاز GFR عبر الجلد ببرنامج الكمبيوتر باستخدام موصل USB. افتح البرنامج ، وانقر فوق اتصال ، واضبط التوقيت على 4000 مللي ثانية. انقر فوق كتابة لحفظ الإعدادات.
    ملاحظة: هذا يعطي ما يصل إلى 6 ساعات من إجمالي وقت أخذ العينات. في الخنازير ، يتم الانتهاء من GFR عبر الجلد في 4 ساعات. بالنسبة للتجارب التي تتطلب أخذ عينات حتى 12 ساعة ، اختر خيار 8000 مللي ثانية.
  3. قم بتوصيل اللاصقات اللاصقة على الوجهين بنافذة واضحة بالجهاز. قم بتوصيل الجهاز بجانب واحد ، مما يضمن أن الصمام الثنائي الباعث للضوء يغطي النافذة الواضحة للسماح باكتشاف التتبع.
  4. احلق المنطقة التي تغطي الجدار الصدري الجانبي. قم بتوصيل البطارية بالجهاز وألصق الرقعة اللاصقة على الفور مع الجهاز في مكانه وتأكد من تأمينه جيدا (الشكل 2). نظرا لأن الخنازير يتم تخديرها بعمق ، فقد يكون الشريط غير ضروري لتثبيت الجهاز في مكانه.
    ملاحظة: الرقعة اللاصقة وحدها كافية للتأمين. ومع ذلك ، في الإجراءات التي يتم فيها التلاعب بالحيوان ، أو يصبح نشطا ، أو حيث قد يتعطل التخدير ، قد يكون من المهم وضع شريط. قد تكون الضمادة أيضا نهجا بديلا31.
  5. مطلوب تسجيل خط الأساس من 3-5 دقائق قبل إعطاء FITC-sinistrin.

10. إعداد وحقن FITC-sinistrin

  1. تحضير خليط من FITC-sinistrin مع محلول ملحي إلى تركيز نهائي قدره 50 ملغ / مل. الجرعة المعطاة للخنزير الصغير هي 20 مجم / كجم. يتم توفير FITC-sinistrin في شكل مسحوق.
    ملاحظة: يمكن أيضا إعطاء FITC-sinistrin من خلال قسطرة وريدية محيطية يتم إدخالها في الوريد الأذني. من الضروري تحقيق مستوى ذروة مرتفع عن طريق إعطاء FITC-sinistrin كبلعة دفع عبر القسطرة الوريدية الفخذية.
  2. قم بتوصيل المحقنة بالدواء على جانب واحد من قضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات وتدفق محلول ملحي على الجانب الآخر من قضيب التوقف. ادفع FITC-sinistrin واتبعه على الفور بلعة ملحية سعة 5 مل قبل إغلاق قضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات على الوريد الخنزير.

11. تسجيل GFR عبر الجلد

  1. الحفاظ على الجهاز متصلا بالخنزير الصغير لمدة 4 ساعات. خلال هذا الوقت ، حافظ على الخنزير الصغير تحت التخدير باستخدام جرعات متقطعة من كلورالوز α بتركيز 20 مجم / كجم لتجنب أي قطعة أثرية للحركة.
  2. في نهاية 4 ساعات ، قم بإزالة الجهاز وافصل البطارية على الفور.

12. قياس GFR

  1. قم بتوصيل جهاز GFR عبر الجلد بالكمبيوتر باستخدام موصل USB الذي يوفره المورد.
  2. افتح برنامج القراءة لاسترداد البيانات من الجهاز. احفظ البيانات الأولية بالنقر فوق التسلسل: الاتصال والقراءة وإعادة التسمية والحفظ. وفقا للتعليمات الواردة في الدليل ، قم بمعالجة وتقييم البيانات المحفوظة في برنامج التحليل.
  3. باختصار ، افتح البرنامج الإصدار 3.0 واستورد البيانات. اضبط مواضع الإزاحة والبداية والنهاية باستخدام العلامات الآلية. قم بإزالة القطع الأثرية إذا لزم الأمر ، وانقر فوق ملائم. يعطي هذا قراءة توضح خلوص FITC-sinistrin في دقائق (t1/2). يتم استخدام t1 / 2 لاحقا لحساب tGFR32,33 على النحو التالي:
    figure-protocol-14557
    ملاحظة: بالتشاور مع الشركة المصنعة ، فإن عامل التحويل المستخدم للخنازير هو 20 (مما يشير إلى أن 20٪ من وزن الجسم هو مساحة خارج الخلية) ، مقابل 21.33 في الفئران (tGFR في مل / دقيقة) و 14,616.8 في الفئران (tGFR في ميكرولتر / دقيقة). وذلك لأن GFR يقاس بدقة كدالة للسائل خارج الخلية 34,35 ، والذي بدوره يعتمد على وزن الجسم36.

13. القتل الرحيم خنزير صغير

  1. جمع 3 مل من الدم بعد 12 ساعة من CLP لمزيد من التحليل الكيميائي الحيوي.
  2. القتل الرحيم للخنزير الصغير عن طريق إعطاء 0.2 مل / كجم من خليط مخلوط مسبقا من 20٪ بنتوباربيتال الصوديوم والفينيتوين الصوديوم عن طريق الوريد.
  3. حصاد الكلى المناسبة لدراسة الأنسجة قبل أخذ الخنزير الصغير إلى المشرحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في هذا القسم ، نقدم لأول مرة البيانات التمثيلية من استخدام GFR عبر الجلد في الخنازير الوليدية. استخدمنا نموذج ربط وثقب cecal الذي ثبت سابقا أنه يقلل من وظائف الكلى28. وفقا لذلك ، افترضنا أنه في خنازير CLP الخاصة بنا ، يجب أن يكون هناك انخفاض حاد في GFR المقابل ل AKI ، ويجب اكتشاف ذلك على ج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تصف هذه الورقة الخطوات العملية لتحديد وظائف الكلى في الخنازير باستخدام أجهزة مراقبة GFR المصغرة عبر الجلد و FITC-sinistrin في نموذج خنزير حديثي الولادة المخدر والتهوية ميكانيكيا. أنشأت الأوراق السابقة بروتوكولات GFR التجريبية عبر الجلد في القوارض11،12،14

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

اي.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R01 DK120595 و R01 DK127625 الممنوحة للدكتور أديبيي. محتوى هذه الورقة هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. شكرا للدكتور دانيال شوك كوش ، مدير الموقع في MediBeacon GmbH ، على نصيحته.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alpha - ChloraloseSigma-AldrichC0128-25GUsed for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0Surgical SpecialtiesSP117Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8CFischer Scientific75-008-821Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffedProgressive Medical International1109021995Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 gMediBeacon Inc.FTCF S001Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzerInstrumentation Laboratory5700For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 inAdroit Medical SystemsV029Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy PumpAdroit Medical SystemsHTPAllows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst OneIDEXX Laboratories89-92525-00Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5FrMillarSPR-524Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulatorTrue CareTCRTCBINF033GUsed to connect IV fluid bag to vein catheter
KetamineCovetrus68317Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0MediBeacon Inc.N/ASoftware program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µmMillipore SigmaSLGVR33RSSyringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant VentilatorSechrist Millennium20409Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol)Covetrus72934Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bagBaxter2B2323QMaintanence fluid infusion
Sterile GlovesHenry Schein104-5920Used by operator during surgery
Sterile GownHalyard Health95021Used by operator during surgery
Steril TowelMedline42131704Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needleEthiconNC1842168Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR MonitorMediBeacon Inc.TDM004Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patchMediBeacon Inc.PTC-SM001Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 ydsFisher ScientificNC9303017To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5Micro medical tubingBB31695For femoral vein cannulation
XylazineCovetrus61035Used for induction of anesthesia

References

  1. Pasala, S., Carmody, J. B. How to use... serum creatinine, cystatin C and GFR. Archives of Disease in Childhood Education and Practice Edition. 102 (1), 37-43 (2017).
  2. Smith, H. W. The Kidney: Structure and Function in Health and Disease. , Oxford University Press, USA. (1951).
  3. Gutman, Y., Gottschalk, C. W., Lassiter, W. E. Micropuncture study of inulin absorption in the rat kidney. Science. 147 (3659), 753-754 (1965).
  4. Ellery, S. J., Cai, X., Walker, D. D., Dickinson, H., Kett, M. M. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in small rodents: through the skin for the win. Nephrology. 20 (3), 117-123 (2015).
  5. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
  6. Wendt, M., Waldmann, K. H., Bickhardt, K. Comparative studies of the clearance of inulin and creatinine in swine. Zentralblatt fur Veterinarmedizin. Reihe A. 37 (10), 752-759 (1990).
  7. Schwartz, G. J., Brion, L. P., Spitzer, A. The use of plasma creatinine concentration for estimating glomerular filtration rate in infants, children, and adolescents. Pediatric Clinics of North America. 34 (3), 571-590 (1987).
  8. Boer, D. P., de Rijke, Y. B., Hop, W. C., Cransberg, K., Dorresteijn, E. M. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatric Nephrology. 25 (10), 2107-2113 (2010).
  9. Guignard, J. P., Drukker, A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine. Pediatrics. 103 (4), 49(1999).
  10. Friedemann, J., Schock-Kusch, D., Shulhevich, Y. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in conscious laboratory animals: state of the art and future perspectives. Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications IX. 10079, 63-71 (2017).
  11. Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), e53767(2016).
  12. Scarfe, L., et al. Transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58520(2018).
  13. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  14. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734(2014).
  15. Almond, G. W. Research applications using pigs. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 12 (3), 707-716 (1996).
  16. Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
  17. Ayuso, M., Irwin, R., Walsh, C., Van Cruchten, S., Van Ginneken, C. Low birth weight female piglets show altered intestinal development, gene expression, and epigenetic changes at key developmental loci. FASEB Journal. 35 (4), 21522(2021).
  18. Pierson, R. N. Progress toward pig-to-human xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1871-1873 (2022).
  19. Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1889-1898 (2022).
  20. Reardon, S. First pig kidneys transplanted into people: what scientists think. Nature. 605 (7911), 597-598 (2022).
  21. Lu, T., Yang, B., Wang, R., Qin, C. Xenotransplantation: current status in preclinical research. Frontiers in Immunology. 10, 3060(2019).
  22. Pattison, R. J., English, P. R., MacPherson, O., Roden, J. A., Birnie, M. Hypothermia and its attempted control in newborn piglets. Proceedings of the British Society of Animal Production. 1990, 81(1972).
  23. Tucker, B. S., Petrovski, K. R., Kirkwood, R. N. Neonatal piglet temperature changes: effect of intraperitoneal warm saline injection. Animals. 12 (10), 1312(2022).
  24. Alcalá Rueda, I., et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 278 (8), 3081-3090 (2021).
  25. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques, Third Edition. , CRC Press/Taylor & Francis Group. Boca Raton. (2016).
  26. Steinbacher, R., von Ritgen, S., Moens, Y. P. Laryngeal perforation during a standard intubation procedure in a pig. Laboratory Animals. 46 (3), 261-263 (2012).
  27. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Göttingen minipig: intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. Journal of Visualized Experiments. (52), e2652(2011).
  28. Soni, H., Adebiyi, A. Early septic insult in neonatal pigs increases serum and urinary soluble Fas ligand and decreases kidney function without inducing significant renal apoptosis. Renal Failure. 39 (1), 83-91 (2017).
  29. Bütz, D. E., Morello, S. L., Sand, J., Holland, G. N., Cook, M. E. The expired breath carbon delta value is a marker for the onset of sepsis in a swine model. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 29 (4), 606-613 (2014).
  30. Turner, A. S., McIlwraith, C. W. Techniques in Large Animal Surgery. , Lea & Febiger. (1989).
  31. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734(2014).
  32. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  33. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (10), 2997-3001 (2009).
  34. Peters, A. M. Expressing glomerular filtration rate in terms of extracellular fluid volume. Nephrology Dialysis Transplantation. 7 (3), 205-210 (1992).
  35. Groth, S., Christensen, A. B., Nielsen, H. CdTe-detector registration of 99mTc-DTPA clearance. European Journal of Nuclear Medicine. 8 (6), 242-244 (1983).
  36. Guyton, A. C., Hall, J. E. The body fluid compartments: extracellular and intracellular fluids; interstitial fluid and edema. Textbook of Medical Physiology. 9, 306-308 (2000).
  37. Luis-Lima, S., et al. Iohexol plasma clearance simplified by dried blood spot testing. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 33 (9), 1597-1603 (2018).
  38. Kobayashi, E., Hishikawa, S., Teratani, T., Lefor, A. T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. Transplantation Research. 1 (1), 8(2012).
  39. Swindle, M. M., et al. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  40. Ibrahim, Z., et al. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2006).
  41. Judge, E. P., et al. Anatomy and bronchoscopy of the porcine lung. A model for translational respiratory medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (3), 334-343 (2014).
  42. Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (11), 2305-2313 (2009).
  43. Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
  44. Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Medicine Experimental. 4 (1), 22(2016).
  45. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
  46. Frennby, B., Sterner, G. Contrast media as markers of GFR. European Radiology. 12 (2), 475484(2002).
  47. Burchardi, H., Kaczmarczyk, G. The effect of anaesthesia on renal function. European Journal of Anaesthesiology. 11 (3), 163-168 (1994).
  48. Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. American Journal of Veterinary Research. 68 (8), 807811(2007).
  49. Arant, B. S. Functional immaturity of the newborn kidney-paradox or prostaglandin. Homeostasis, Nephrotoxicity, and Renal Anomalies in the Newborn. , Springer. Boston, MA. 271-278 (1986).
  50. Gattineni, J., Baum, M. Developmental changes in renal tubular transport-an overview. Pediatric Nephrology. 30 (12), 2085-2098 (2015).
  51. Gu, X., Yang, B. Methods for assessment of the glomerular filtration rate in laboratory animals. Kidney Diseases. , 1-11 (2022).
  52. Mullins, T. P., Tan, W. S., Carter, D. A., Gallo, L. A. Validation of non-invasive transcutaneous measurement for glomerular filtration rate in lean and obese C57BL/6J mice. Nephrology. 25 (7), 575-581 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved