機械的換気仔豚における糸球体濾過率の経皮吸収型測定

要約

糸球体濾過率(GFR)は、腎機能を評価するための理想的なマーカーです。しかし、イヌリン注射と連続血液および尿分析を用いた標準的な測定方法は実用的ではありません。この記事では、子豚のGFRを経皮的に測定する実用的な方法について説明します。

要約

糸球体濾過率(GFR)の経皮測定は、意識のある動物の腎機能を評価するために使用されています。この技術は、急性腎障害および慢性腎臓病を研究するためにげっ歯類で十分に確立されています。しかし、経皮吸収系を用いたGFR測定は、ヒトと同様の腎系を持つ種であるブタでは検証されていません。そこで,麻酔・機械的換気を施した新生児ブタの経皮GFRに対する敗血症の影響を調査した。多微生物敗血症は、盲腸結紮および穿刺(CLP)によって誘発された。小型化された蛍光センサーからなる経皮GFR測定システムをブタの剃毛皮膚に取り付けて、静脈注射されたGFRトレーサーであるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合シニストリンのクリアランスを測定しました。私たちの結果は、CLPの12時間後に、血清クレアチニンがGFRの減少とともに増加したことを示しています。この研究は、機械的に換気された新生児ブタの腎機能を決定する際の経皮GFRアプローチの有用性を初めて実証しました。

概要

腎機能の実用的かつ定量的な評価は、糸球体濾過率(GFR)測定であり、これは、クリアランス原理¹に基づいて腎臓がどれだけうまく血液をろ過するかを示します。GFRを測定する以前の方法では、イヌリンやシニストリンなどの外因性化合物を静脈内注射し、血漿/尿レベルの連続測定を行ってクリアランスを検出します^2,3。この方法は煩雑であり、血漿および尿試料の連続収集を必要とする⁴。別の方法は、クレアチニンなどの内因性代謝最終産物の測定です。しかしながら、これは糸球体によって濾過されるだけでなく、尿細管によっても分泌されるので、時間がかかり、時には不正確である^5,6。さらに、クレアチニンレベルは、性別、年齢、食事、および筋肉量の影響を受けます^7,8,9。

GFRのより正確で、低侵襲で、広く使用されている測定値は、動物のリアルタイムGFRを測定する経皮GFRモニターの使用です^4,10。シニストリンは、溶解性が高く、自由にろ過される外因性腎マーカーであり、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識されています。このコンジュゲート化合物を静脈内注射し、血液や尿サンプルを収集することなくリアルタイムの腎機能を評価できます¹¹。経皮GFR測定の使用は、げっ歯類¹²、イヌ¹³、およびネコ¹⁴で検証されていますが、ブタでは検証されていません。

ブタ種は人間といくつかの解剖学的および生理学的特徴を共有しており、さまざまな人間の病気を研究するのに理想的な動物となっています¹⁵。トランスレーショナル生物医学研究におけるブタの使用は、ヒトの生理学および病態生理学を模倣するため、げっ歯類モデルよりもますます人気があり、好まれるようになっています¹⁶。新生児ブタは、小児患者に特有の疾患のメカニズムを理解することに関心があります¹⁷。さらに、ブタからヒトへの臓器移植の最近の進歩は、前臨床試験および臨床試験のための診断ツールを拡大する衝動を生じさせる18,19,20,21。この論文は、新生児ブタのGFRを測定する際の経皮デバイスの使用に関するガイドを初めて提供します。

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プロトコル

手順は、実験動物の世話と使用に関する国家基準に従って書かれており、テネシー大学健康科学センター(UTHSC)の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。

注:実験群の子豚は盲腸結紮と穿刺を受けますが、偽群は盲腸結紮や穿刺なしで腹部の開口部のみを受けます。両方のグループの子豚は、敗血症と急性腎障害(AKI)が実験グループで発生するのに十分な時間を確保するために、手順後12時間麻酔下に保たれます。経皮GFR測定は、手順後8時間で合計12時間続きます。

1.子豚の供給と住居

1. 3〜5日齢の新生児子豚を提供できる地元の養豚場を特定します。週の初めに分娩をスケジュールして、子豚が7日以上経過する前に実験を完了します。
   注:サプライヤーは、この実験のために月曜日に3〜5頭の子豚を提供しました。金曜日までに、子豚は実験を受けたでしょう。同性を使用し、ほぼ同じ年齢を使用することは、交絡因子を避けるために不可欠です。
2. 子豚が到着したら、個体識別情報(耳タグや体重と年齢を含む記録など)があることを確認してください。
3. 認可された獣医師の世話の下で実験動物ケアユニット(LACU)に子豚を収容します。動物は、良好な衛生状態を維持するために水で簡単に洗える頑丈なコンクリートの床を備えた広々としたペンにグループとして収容されます。
4. 重いボールなどの家具を追加して、環境を豊かにし、刺激を与えます。
5. LACUが、衛生、栄養、温度制御、換気、照明を制御することによる昼夜のサイクルなどの重要な要素を含む最適な環境条件を提供することを確認してください。
6. 獣医師に体重測定を含む子豚を毎日チェックしてもらい、子豚が病気に見えるかどうかを研究者に知らせ、実験から除外する必要があるかもしれません。
7. 環境に順応するために子豚を少なくとも1日間放置すると、ストレスを最小限に抑えることができます。

2.術前の準備

1. 実験を開始する前に、手術ステーションを準備してください。これには、加熱パッド、カテーテル、人工呼吸器、気管内チューブ、ヘパリン化生理食塩水、およびリンゲル乳酸液のバッグが含まれます。
   注:子豚は体温調節容量が低く、血行動態を変化させる低体温になりやすい^22,23。したがって、加熱パッドがウォームアップするのに十分な時間を確保することが不可欠です。
2. 10 mg/mLのα-クロラロースを生理食塩水と混合し、混合物が透明になるまで調製します。冷却時に薬が結晶化するのを防ぐために、溶液を過熱しないでください。子豚に投与する前にシリンジフィルター(サイズ0.22μm)で濾過する。
3. 動物の体重に基づいて麻酔薬を作成します-ケタミン:20 mg / kgおよびキシラジン:2.2 mg / kg。麻酔を維持するためにαクロラロース(5 mL / kg)を使用してください。.
   注:αクロラロースは、吸入と比較した場合のIV投与の容易さのために使用されます
   麻酔薬は、気管内チューブを介して送達される麻酔器と適切な清掃システムを必要とするため、後者である。

3.麻酔

1. 過度のストレスを避けるために、子豚にとって馴染みのある環境である豚舎で麻酔の誘導を行います。
2. 子豚を後ろ足でそっとつまみ、23 G 3/4針を使用して、ケタミン:20 mg / kgとキシラジン:2.2 mg / kgを半膜症/半腱様筋の後脚に投与します。.
3. 薬が有効になるまで数分待ちます。動物が動けなくなるほど十分にリラックスし、眼瞼反射と顎の緊張が失われ、手術ステーションへの簡単で安全な輸送を可能にすることにより、適切な麻酔レベルを確認します。眼瞼反射を目の内側の角に触れて評価します。まばたきがないことは、適切な麻酔を示します。

4.気管切開術

注:この実験は非生存であるため、気管切開を行って機械的換気のための気道を確立します。気管切開術は、頭と上気道の解剖学的構造を考えると子豚では困難な気管内挿管とは対照的に、迅速で簡単な手順です^24,25。さらに、喉頭痙攣は挿管中に一般的に報告され、その結果、長期間の低酸素症と高炭水化物が発生し、結果を損なう可能性があります²⁶。

1. 子豚を背側横臥状態にします。硬く感じる甲状腺軟骨の隆起を触診して、輪状甲状軟骨を特定します。滅菌ドレープを適用する前に、ポビドンヨードと70%エタノールを使用して領域を滅菌します。
2. 外科用ブレードを使用して、甲状軟骨の尾端より下に2〜3 cmの腹側正中線切開を行います。
3. 湾曲した蚊止血剤を使用して、輪状甲状腺膜と最初のいくつかの気管輪が視覚化されるまで、上にある皮下組織と筋肉(胸骨と皮膚大腸菌)を鈍く解剖します。解剖するときは、血管を傷つけないように注意してください。
4. 輪状甲状腺膜および気管輪²⁴の明確な視野を得てから、一対の長ミクスター直角鉗子を使用して構造を上昇させる。
   1. 小さなはさみで、輪状甲状腺膜または最初の気管輪に小さな切り込みを入れます。カットを水平に~0.5cmまで伸ばして、3.0mmの気管内チューブを通過させます。
   2. チューブを5 cmのマークに挿入します。チューブを固定する前に、両側の胸部拡張と呼吸音を確認してください。
5. 気管の周りにアンビリカルテープを通して、気管を所定の位置に固定します。チューブをジョーの付け根に固定するために追加のテープが使用されます。
6. 人工呼吸器のスイッチを入れ、気管内チューブを接続し、特定のノブを回します(例:.SIMVノブ、PEEPノブなど)をクリックして、次のベースライン設定を選択します。圧力制御モード: 同期断続的機械換気 (SIMV); ピーク吸気圧 (PIP) - 15。 呼気終末陽圧 (PEEP)-5; レート-20; アイタイム - 0.6。最初の血液ガス分析に続いて、適切な酸素供給と換気を維持することを目的として、血液ガスの結果に応じて人工呼吸器の設定を調整します。

5.大腿血管カニュレーション

1. 静脈アクセスと侵襲的血圧モニタリングのために大腿血管に注意を切り替える前に、気道と換気を確立します。大腿動脈は、ザルトリウス筋とグラシリス筋の間の溝で脈拍を感じることによって識別され、静脈は動脈のすぐ内側にあります。
2. 子豚が背側の横臥位に横たわっている間に、ポビドンヨードとエタノールを使用して鼠径部を滅菌し、適切なサイズのドレープを適用します。
3. 外科用ブレードを使用して、鼠径部のしわから始まり、大腿骨管に沿って遠位に伸びる3〜4 cmの縦方向の切開を作成します。
4. 蚊の湾曲した鉗子とはさみを使用して、それぞれ鈍く鋭い解剖を行い、大腿神経血管束のレベルまで解剖します。束はグラシリス筋²⁷の体の奥深くにあります。大腿動脈と静脈を2〜3 cmかけて円周方向に解剖し、カニューレ挿入を可能にします。必要に応じて小さな側枝を結睭化します。
5. 動脈と静脈の近位端と遠位端の両方に3.0シルクタイを適用して、牽引を適用します。遠位絹縫合糸を静脈と動脈の両方に結び、血管を結紮します。
6. 大腿静脈から始めて、絹のネクタイの遠位および近位の牽引を維持し、次にマイクロハサミを使用して静脈切開を作成します。
7. 次に、静脈ピックカテーテルイントロデューサーを使用して、内径x外径0.86mmx1.32mmの事前に測定されたポリウレタンカテーテルを挿入しながら血管を開きます。挿入したら、近位3.0シルク縫合糸を結び、カテーテルを固定します。カテーテルを3 mLのヘパリン化生理食塩水(1 U / mL)で洗い流します。この溶液は、50mLの生理食塩水に0.5mLのヘパリンを加えることによって作ることができる。
8. 上記と同じアプローチを使用して侵襲的血圧カテーテルを挿入し、動脈切開を作成し、カテーテルを通過させます。
   注:動脈にアクセスする際の失血を最小限に抑えるには、遠位および近位の牽引力を維持することが不可欠です。
9. カテーテルが固定されたら、生理食塩水に浸したガーゼでその部位を覆い、必要に応じて、感染を防ぐために3.0シルク縫合糸を使用して皮膚を縫合することができます。

6.麻酔、体液、血液ガスの維持

1. 顎の緊張と眼瞼反射を使用して実験全体を通して麻酔の深さを監視し、必要に応じてα-クロラロースを静脈内投与して、動物を深い麻酔下に維持します。.50 mg / kgの初期負荷用量を使用し、さらにボーラスする場合は20 mg / kgを使用します。.
2. リンゲル乳酸塩を実験全体を通して4 mL / kg / hの速度で維持液として注入します。たとえば、子豚の体重が3 kgの場合、輸液速度は12 mL / hです。
3. ベッドサイドガス分析では、ヘパリン化血液ガスシリンジで動脈血サンプルを採取し、分析機にサンプルを提示します。 動脈血ガスオプションを選択し、アナライザーが採血針を提示するまで~2〜3秒待ちます。
   1. 血液サンプルを含む注射器の端に針を慎重に挿入します。分析装置が必要なサンプルを吸引し、シリンジを回収するのを待ちます。機械が血液ガスを分析し、結果を提示できるようにします。
   2. 結果に基づいて、pHを7.35〜7.45、二酸化炭素分圧(PCO2)を35〜45 mmHg、酸素分圧(PaO2)を80〜150 mmHgに維持するように人工呼吸器を調整します。設定は人工呼吸器の種類によって異なりますが、主に低酸素症や高炭酸ガス血症を補うために適切なノブを使用して呼吸数を増減する必要があります。
4. 3mLの血液を薄緑色のチューブ(リチウムヘパリン)に引き込みます。サンプルを2000 xg で15分間遠心分離し、4°Cに維持して血漿を抽出します。完了すると、血漿はベッドサイドケミストリーアナライザーで血清クレアチニンレベルをすぐに分析するか、後で分析するために-80°Cで保存できます。
5. 直腸プローブ温度計を使用して温度を継続的に監視し、子豚の温度を101〜103°Fに維持するように加熱パッドの温度を調整します。

7.実験グループ;盲腸結紮および穿孔(CLP)^25,28,29

注:実験群の子豚の場合、CLPを実行して多微生物敗血症を誘発し²⁸ 、術後12時間動物を監視して、重度の敗血症が続くのに十分な時間を確保します。経皮GFR記録は、盲腸結紮後8時間で開始され、4時間の記録を可能にします。

1. ブタの盲腸は左傍腰椎窩³⁰にあるため、外科用ブレードを使用して5〜6 cmの左傍正中垂直切開を作成します。表在性上腹部血管の損傷を避けて、腹壁層を解剖します。
2. 腹膜層を切開したら、リトラクターを使用して腹腔内構造へのアクセスを改善します。
3. 腹部の左上の象限にあるらせん状結腸を特定します。らせん状の結腸を尾側と背側にたどって、盲腸を見つけます。回腸は、盲腸の基部でらせん状結腸に結合しているのが見られます。
4. 回盲部接合部のちょうど遠位に盲腸を結睭化します(図1)。
5. 18 Gの針を使用して、盲腸に7つの穴を開け、腹膜領域に糞便を押し出します。
6. 単純な中断または連続ステッチを使用して、3.0シルク縫合糸で腹部を層状に閉じます。可能であれば、ステープラーを使用してスキン層を閉じることもできます。

8.偽グループ

1. 上記の手順7.2〜7.4に従います。盲腸を特定したら、そのまま戻し、同様に腹壁を閉じます。
2. 偽グループの子豚を12時間監視して、麻酔への長期暴露に起因する交絡バイアスを排除します。.

9.経皮GFRデバイスのセットアップ

1. 盲腸結紮の8時間後、GFRの経皮測定を開始する準備をします。
2. MB サービス ソフトウェア バージョン 3.0 を使用して、GFR デバイスのサンプリング レートを調整します。簡単に言うと、USBコネクタを使用して経皮GFRデバイスをコンピューターソフトウェアに接続します。ソフトウェアを開き、[ 接続]をクリックして、タイミングを4000ミリ秒に調整します。 [書き込み ] をクリックして設定を保存します。
   注:これにより、合計サンプリング時間が最大6時間になります。ブタでは、経皮GFRは4時間で完了する。最大 12 時間のサンプリングが必要な実験の場合は、[8000 ミリ秒] オプションを選択します。
3. 透明な窓のある両面粘着パッチをデバイスに取り付けます。デバイスを片側に取り付け、発光ダイオードがクリアウィンドウの上に重なってトレーサーを検出できるようにします。
4. 外側胸壁の上にある領域を剃ります。バッテリをデバイスに取り付け、すぐに粘着パッチをデバイスを所定の位置に貼り付けて、しっかりと固定されていることを確認します(図2)。子豚は深く麻酔されているため、デバイスを所定の位置に保持するためのテープは不要になる場合があります。
   注意: 粘着パッチだけで固定できます。ただし、動物が操作されたり、活動的になったり、麻酔が中断されたりする可能性のある手順では、テープを貼ることが重要になる場合があります。包帯はまた、代替アプローチ³¹であり得る。
5. FITCシニストリンを投与する前に、3〜5分のベースライン記録が必要です。.

10. FITCシニストリンの調製および注射

1. FITCシニストリンと生理食塩水の混合物を最終濃度50 mg/mLまで調製します。子豚に投与される用量は20 mg / kgです。.FITCシニストリンは粉末状で供給されます。
   注:FITCシニストリンは、耳介静脈に挿入された末梢静脈カテーテルを介して投与することもできます。FITCシニストリンを大腿静脈静脈カテーテルを通してプッシュボーラスとして投与することにより、高いピークレベルを達成することが不可欠です。
2. 薬の入った注射器を3方向ストップコックの片側に取り付け、生理食塩水をストップコックの反対側にフラッシュします。FITCシニストリンを押し、すぐに5 mLの生理食塩水ボーラスを続けてから、子豚の静脈への三方ストップコックを閉じます。

11.経皮GFR記録

1. デバイスを子豚に4時間取り付けたままにします。この間、モーションアーチファクトを避けるために、20 mg / kgの濃度のα-クロラロースを断続的に使用して子豚を麻酔下に保ちます。.
2. 4時間の終わりに、デバイスを取り外し、すぐにバッテリーを外します。

12. GFR測定

1. サプライヤーが提供するUSBコネクタを使用して、経皮GFRデバイスをコンピューターに接続します。
2. 読み取りソフトウェアを開いて、デバイスからデータを取得します。接続、読み取り、名前の変更、保存のシーケンスをクリックして、生データを保存します。マニュアルの指示に従って、保存されたデータを分析ソフトウェアで処理および評価します。
3. 簡単に説明すると、ソフトウェアVer.3.0を開き、データをインポートします。自動マーカーを使用して、オフセット、開始、および終了位置を調整します。必要に応じてアーティファクトを削除し、[フィット] をクリックします。これにより、FITCシニストリンクリアランスを数分(t1/2)で示す読み出しが得られます。その後、t1/2 を使用して、以下のように tGFR^32,33 を計算します。
   
   注:メーカーと相談したところ、ブタに使用される変換係数は20(体重の20%が細胞外空間であることを示す)であり、ラットでは21.33(tGFR(mL /分)およびマウスでは14,616.8(μL /分のtGFR)です。これは、GFRが細胞外液^34,35の関数として正確に測定され、細胞外液³⁶が体重に依存するためです³⁶。

13.子豚の安楽死

1. さらなる生化学的分析のために、CLPの12時間後に3mLの血液を収集します。
2. 20%ペントバルビタールナトリウムとフェニトインナトリウムの予備混合混合物0.2 mL / kgを静脈内投与することにより、子豚を安楽死させます。.
3. 子豚を遺体安置所に連れて行く前に、組織病理学的研究のために正しい腎臓を収穫してください。

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結果

このセクションでは、新生児ブタにおける経皮GFRの使用からの代表的なデータを初めて提示します。我々は、腎機能を低下させることが以前に示されている盲腸結紮および穿刺モデルを使用した²⁸。したがって、CLPブタでは、AKIに対応するGFRの急激な低下があり、これを経皮GFR装置上でクリアランス時間の増加(t_1/2)として検出し、ブタでの使用を検証するべきである...

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ディスカッション

この論文では、機械的に換気され、麻酔をかけられた新生児ブタモデルで、小型経皮GFRモニターとFITCシニストリンを使用してブタの腎機能を決定するための実用的なステップについて説明します。以前の論文では、げっ歯類^11,12,14で実験的経皮GFRプロトコルが確立されていますが、ブタにはプロトコルは存在しません。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha - Chloralose	Sigma-Aldrich	C0128-25G	Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0	Surgical Specialties	SP117	Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C	Fischer Scientific	75-008-821	Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed	Progressive Medical International	1109021995	Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g	MediBeacon Inc.	FTCF S001	Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer	Instrumentation Laboratory	5700	For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in	Adroit Medical Systems	V029	Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump	Adroit Medical Systems	HTP	Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One	IDEXX Laboratories	89-92525-00	Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr	Millar	SPR-524	Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator	True Care	TCRTCBINF033G	Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine	Covetrus	68317	Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0	MediBeacon Inc.	N/A	Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm	Millipore Sigma	SLGVR33RS	Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator	Sechrist Millennium	20409	Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol)	Covetrus	72934	Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag	Baxter	2B2323Q	Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves	Henry Schein	104-5920	Used by operator during surgery
Sterile Gown	Halyard Health	95021	Used by operator during surgery
Steril Towel	Medline	42131704	Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle	Ethicon	NC1842168	Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor	MediBeacon Inc.	TDM004	Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch	MediBeacon Inc.	PTC-SM001	Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds	Fisher Scientific	NC9303017	To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5	Micro medical tubing	BB31695	For femoral vein cannulation
Xylazine	Covetrus	61035	Used for induction of anesthesia