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Method Article
* Questi autori hanno contribuito in egual misura
La velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il marker ideale per valutare la funzionalità renale. Tuttavia, il metodo di misurazione standard che utilizza l'iniezione di inulina con analisi seriale del sangue e delle urine non è pratico. Questo articolo delinea un metodo pratico per misurare la GFR transdermica nei suinetti.
La misurazione transdermica della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è stata utilizzata per valutare la funzionalità renale negli animali coscienti. Questa tecnica è ben consolidata nei roditori per studiare il danno renale acuto e la malattia renale cronica. Tuttavia, la misurazione della GFR utilizzando il sistema transdermico non è stata convalidata nei suini, una specie con un sistema renale simile a quello umano. Quindi, abbiamo studiato l'effetto della sepsi sulla GFR transdermica in suini neonatali anestetizzati e ventilati meccanicamente. La sepsi polimicrobica è stata indotta dalla legatura e puntura cecale (CLP). Il sistema di misurazione transdermica della GFR costituito da un sensore di fluorescenza miniaturizzato è stato collegato alla pelle rasata del maiale per determinare la clearance della sinistrina coniugata con fluoresceina-isotiocianato (FITC), un tracciante GFR iniettato per via endovenosa. I nostri risultati mostrano che a 12 ore post-CLP, la creatinina sierica è aumentata con una diminuzione della GFR. Questo studio dimostra, per la prima volta, l'utilità dell'approccio transdermico GFR nel determinare la funzionalità renale nei suini neonatali ventilati meccanicamente.
Una valutazione pratica e quantitativa della funzionalità renale è la misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR), che indica quanto bene i reni filtrano il sangue in base al principio di clearance1. Un metodo precedente di misurazione della GFR prevedeva l'iniezione endovenosa di composti esogeni come l'inulina o la sinistrina, conducendo misurazioni seriali dei livelli plasmatici/urinari per rilevarne la clearance 2,3. Questo metodo è macchinoso e richiede la raccolta seriale di campioni di plasma e urina4. Un'alternativa è la misurazione dei prodotti metabolici endogeni come la creatinina. Tuttavia, questo richiede tempo e, a volte, è impreciso, in quanto non solo viene filtrato dal glomerulo ma anche secreto dai tubuli 5,6. Inoltre, il livello di creatinina è influenzato dal sesso, dall'età, dalla dieta e dalla massa muscolare 7,8,9.
Una misura più precisa, minimamente invasiva e ampiamente utilizzata della GFR è l'uso di monitor GFR transdermici, che misurano la GFR in tempo reale negli animali 4,10. La sinistrina, un marcatore renale esogeno altamente solubile e liberamente filtrato, è marcata con fluoresceina-isotiocianato (FITC). Questo composto coniugato viene iniettato per via endovenosa e la funzionalità renale in tempo reale può essere valutata senza raccogliere campioni di sangue e urina11. L'uso della misurazione transdermica della GFR è stato convalidato nei roditori12, nei cani 13 e nei gatti14, ma non nei suini.
Le specie suine condividono diverse caratteristiche anatomiche e fisiologiche con l'uomo, rendendole animali ideali per lo studio di varie malattie umane15. L'uso dei maiali nella ricerca biomedica traslazionale è diventato sempre più popolare e preferito rispetto ai modelli di roditori perché imita la fisiologia umana e la fisiopatologia16. I maiali neonatali sono di interesse per comprendere i meccanismi delle malattie uniche per i pazienti pediatrici17. Inoltre, i recenti progressi nel trapianto di organi da suino a organo umano sollecitano ad ampliare gli strumenti diagnostici per gli studi preclinici e clinici 18,19,20,21. Questo documento, per la prima volta, fornisce una guida per l'uso del dispositivo transdermico nella misurazione della GFR nei suini neonatali.
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Le procedure sono scritte secondo gli standard nazionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Tennessee Health Science Center (UTHSC).
NOTA: I suinetti nel gruppo sperimentale sono sottoposti a legatura cecale e puntura, mentre il gruppo fittizio subisce solo l'apertura dell'addome senza legatura o puntura cecale. I suinetti di entrambi i gruppi sono tenuti sotto anestesia per 12 ore dopo la procedura per consentire il tempo sufficiente per la sepsi e il danno renale acuto (AKI) nel gruppo sperimentale. La misurazione transdermica della GFR avverrà a 8 ore dopo la procedura per un totale di 12 ore.
1. Fornitura e stabulazione dei suinetti
2. Preparazione preoperatoria
3. Anestesia
4. Tracheostomia
NOTA: Questo esperimento non è di sopravvivenza, quindi viene eseguita una tracheotomia per stabilire una via aerea per la ventilazione meccanica. La tracheostomia è una procedura semplice e veloce, al contrario dell'intubazione endotracheale, che è impegnativa nei suinetti data la loro anatomia della testa e delle vie aeree superiori24,25. Inoltre, il laringospasmo è comunemente riportato durante l'intubazione, con conseguente periodo prolungato di ipossia e ipercarbia che può compromettere i risultati26.
5. Incannulamento dei vasi femorali
6. Mantenimento di anestesia, fluidi e gas ematici
7. Gruppo di esperimento; legatura cecale e perforazione (CLP) 25,28,29
NOTA: Per i suinetti nel gruppo sperimentale, eseguire il CLP per indurre la sepsi polimicrobica28 e monitorare l'animale per 12 ore dopo l'intervento chirurgico per consentire il tempo sufficiente per la sepsi grave. La registrazione GFR transdermica inizia a 8 ore dopo la legatura cecale per consentire 4 ore di registrazione.
8. Gruppo fittizio
9. Configurazione del dispositivo GFR transdermico
10. Preparazione e iniezione di FITC-sinistrina
11. Registrazione transdermica GFR
12. Misurazione GFR
13. Eutanasia dei maialini
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In questa sezione, presentiamo per la prima volta i dati rappresentativi dell'uso della GFR transdermica nei suini neonatali. Abbiamo usato un modello di legatura cecale e puntura che ha precedentemente dimostrato di ridurre la funzionalità renale28. Di conseguenza, abbiamo ipotizzato che nei nostri suini CLP, ci dovrebbe essere un calo acuto della GFR corrispondente all'AKI, e questo dovrebbe essere rilevato sul dispositivo GFR transdermico come aumento del tempo di clearance (t1/2), ...
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Questo articolo descrive i passaggi pratici per determinare la funzionalità renale nei suini utilizzando i monitor GFR transdermici miniaturizzati e la sinistrina FITC in un modello di suino neonatale anestetizzato ventilato meccanicamente. Articoli precedenti hanno stabilito protocolli sperimentali transdermici GFR nei roditori11,12,14, ma non esistono protocolli nei suini.
Recentemente, c'è stata ...
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Nessuno.
Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health R01 DK120595 e R01 DK127625 assegnate al Dr. Adebiyi. Il contenuto di questo documento è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. Grazie al Dr. Daniel Schock-Kusch, direttore del sito presso MediBeacon GmbH, per i suoi consigli.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alpha - Chloralose | Sigma-Aldrich | C0128-25G | Used for maintanining anesthesia |
Black braided silk 3-0 | Surgical Specialties | SP117 | Silk tie for blood vessel traction and ligation |
Centrifugation machine AccuSpin 8C | Fischer Scientific | 75-008-821 | Used to extract plasma from whole blood sample |
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed | Progressive Medical International | 1109021995 | Inserted through tracheostomy |
FITC-Sinistrin 1.0 g | MediBeacon Inc. | FTCF S001 | Store at room temp and protect from light |
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer | Instrumentation Laboratory | 5700 | For bedside blood gas analysis |
Heating Pad medium size 20 in x 29 in | Adroit Medical Systems | V029 | Connects to heat therapy pump |
HTP-Heat Therapy Pump | Adroit Medical Systems | HTP | Allows you to set temperature as needed. |
IDEXX Catalyst One | IDEXX Laboratories | 89-92525-00 | Plasma creatinine analysis |
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr | Millar | SPR-524 | Inserted in femoral artery |
IV adminstration set with flow regulator | True Care | TCRTCBINF033G | Used to connect IV fluid bag to vein catheter |
Ketamine | Covetrus | 68317 | Used for induction of Anesthesia |
MediBeacon analysis software version 3.0 | MediBeacon Inc. | N/A | Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve |
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGVR33RS | Syringe filter for chloralose injection |
Neonate/Infant Ventilator | Sechrist Millennium | 20409 | Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube |
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) | Covetrus | 72934 | Used for euthanasia |
Ringer Lactate 500 mL bag | Baxter | 2B2323Q | Maintanence fluid infusion |
Sterile Gloves | Henry Schein | 104-5920 | Used by operator during surgery |
Sterile Gown | Halyard Health | 95021 | Used by operator during surgery |
Steril Towel | Medline | 42131704 | Used as drape to maintaine sterile field when operating |
Suture 3-0 silk reverse cutting needle | Ethicon | NC1842168 | Used for suturing abdominal wall layers |
Transdermal Mini GFR Monitor | MediBeacon Inc. | TDM004 | Battery and USB connector included in package |
Transdermal monitor adhesive patch | MediBeacon Inc. | PTC-SM001 | Doubl sided adhesive patch for GFR probe |
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds | Fisher Scientific | NC9303017 | To secure endotracheal tube |
Venous Catheter size PE/5 | Micro medical tubing | BB31695 | For femoral vein cannulation |
Xylazine | Covetrus | 61035 | Used for induction of anesthesia |
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