التشريح المجهري لعين القوارض

Summary

تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتشريح الدقيق للعين في القوارض. تتضمن العملية استئصال مقلة العين جنبا إلى جنب مع الغشاء النيكتيتي (أي الجفن الثالث). ثم يتبع ذلك فصل كؤوس العين الخلفية والأمامية.

Abstract

يتضمن تشريح العين الدقيقة لعين القوارض تجزئة مقلة العين المنزوعة النواة مع الغشاء المتصل ، أو الجفن الثالث ، للحصول على أكواب العين الأمامية والخلفية. باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على الأجزاء الفرعية للعين ، بما في ذلك أنسجة القرنية والأنسجة العصبية والأنسجة الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) والعدسة ، من أجل التركيب الكامل ، والتقسيم بالتبريد ، و / أو معلقات الخلية المفردة لنسيج عيني معين. يقدم وجود الجفن الثالث مزايا فريدة ومهمة ، لأنه يفيد في الحفاظ على اتجاه العين ، وهو أمر مهم لفهم فسيولوجيا العين بعد أي تدخل موضعي أو في الدراسات التي تنطوي على تحليل العين المتعلق بالتضاريس المكانية للعين.

في هذه الطريقة ، قمنا باستئصال مقلة العين في التجويف جنبا إلى جنب مع الجفن الثالث عن طريق قطع عضلات العين بعناية وببطء وقطع العصب البصري. تم ثقب مقلة العين من خلال حافة القرنية باستخدام microblade. تم استخدام الشق كنقطة دخول ، مما يسمح بالقطع على طول تقاطع القرنية الصلبة عن طريق إدخال مقص دقيق من خلال نقطة الشق. تم إجراء جروح صغيرة ومستمرة على طول المحيط حتى انفصلت الكؤوس. يمكن تشريحها بشكل أكبر عن طريق تقشير الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية برفق باستخدام ملقط خياطة كوليبري للحصول على الشبكية العصبية وطبقات RPE. علاوة على ذلك ، تم إجراء ثلاثة / أربعة قطع متساوية البعد من المحيط بشكل عمودي على المركز البصري حتى تم الوصول إلى العصب البصري. فتح هذا الكؤوس نصف الكروية في شكل زهرة بحيث سقطت مسطحة ويمكن تركيبها بسهولة. تم استخدام هذه التقنية في مختبرنا لتركيب القرنية بالكامل وأقسام الشبكية. يحدد وجود الجفن الثالث الاتجاه الأنفي الصدغي ، والذي يسمح بدراسة تدخلات العلاج بالخلايا المختلفة بعد الزرع ، وبالتالي ، التحقق الفسيولوجي المستهدف الحيوي للتصور والتمثيل الدقيق في مثل هذه الدراسات.

Introduction

تشريح العين هو تقنية مهمة في أبحاث العيون وقد سمح للباحثين بالوصول إلى أجزاء العين للدراسات المستهدفة. في السابق ، اعتمد باحثو العين على أنسجة العين من الأفراد المرضى في دراساتهم. ومع ذلك ، فإن العدد المتزايد تدريجيا من سلالات نماذج القوارض العينية¹ على مر السنين قد قلل من الحاجة إلى أنسجة العين البشرية. سمحت سلالات الفئران هذه بفهم أعمق لأمراض العين والتدخلات. ومع ذلك ، فقد ولدوا أيضا الحاجة إلى تقنيات مبتكرة للتشريح الدقيق للعين. الحجم الصغير ومساحة التشغيل المحدودة يعيقان بشدة الوصول الفعال إلى الأجزاء الفرعية للعين. علاوة على ذلك ، نظرا للتجميع الخلوي المتجانس لأكواب العين الخلفية والأمامية ، من الصعب إجراء تدخلات مستهدفة بعد التسلخ. تقنيات التشريح المجهري الحالية لليزر² والتشريح المجهري الجراحي ^3,4 غير كافية لتلبية متطلبات أبحاث العين. التشريح الدقيق بالليزر فعال جدا في تحليل الخلية الواحدة ، ولكن يجب تشريح الأنسجة المحددة قبل إجراء الليزر². يمكن لهذه التقنية عزل المناطق الصغيرة ذات الأهمية من الأنسجة التي تم تشريحها مسبقا للتحليل الجزيئي. وبالتالي ، فإن هذه التقنية ليست مناسبة لإعداد حوامل كاملة أو لعزل طبقات العين المعبأة محوريا من أجل التصور الأمثل.

الطريقة الجراحية هي التقنية الأكثر استخداما. تتضمن هذه الطريقة شل حركة العين عبر العصب البصري⁵ ثم إجراء التشريح. هذه الممارسة شاقة ويمكن أن تلحق الضرر بأي نسيج هش ، حيث تستمر العين الكروية في التحرك أثناء التشريح. على الرغم من كونها مفيدة لعزل الأقسام المختلفة لطبقات الشبكية ، إلا أن هذه التقنية لا يمكنها تحديد الاتجاه المكاني للأنسجة عند التشريح.

أثناء التشريح ، فإن الحفاظ على وجود الغشاء المرفق أو الجفن الثالث (الشكل 1) يقدم مزايا فريدة ومهمة. في هذه الطريقة ، أولا ، يتم استئصال مقلة العين بالجفن الثالث. ثم ، يتم استخدام الجفن الثالث لشل حركة العين⁶ (الشكل 2 أ). يتبع ذلك ثقب مقلة العين من خلال حافة القرنية واستخدام الشق كنقطة دخول (الشكل 2B ، C). بعد ذلك ، يتم فصل النظارات عن طريق قطع على طول المحيط الأمامي والخلفي (الشكل 2D-G). من خلال تشريح فنجان العين الخلفي بشكل أكبر ، يمكن تحديد الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية وتقشيرها بلطف. ثم يتم إجراء ثلاث أو أربع قطع متساوية البعد في الكؤوس الأمامية والخلفية نصف الكروية التي تم الحصول عليها ، والتي تسمح لهذه الأكواب على شكل زهرة بالسقوط بشكل مسطح على شريحة (الشكل 2H).

يساعد الجفن الثالث في التعامل السهل والفعال أثناء التشريح ، وبالتالي ضمان الحد الأدنى من الضرر للأنسجة أثناء الوصول إلى طبقات العين المختلفة وعند إنتاج حوامل كاملة. علاوة على ذلك ، يساعد وجود الجفن الثالث في تحديد وفحص التدخلات الموضعية أثناء التصور.

تم إجراء الإجراء ، في مختبرنا ، على سلالة فأر CBA / J أو rd1 في P28 من أي جنس. يمكن إجراء الإجراء على أي سلالة أو عمر أو جنس وليس له تحيز وفقا لهذه الخصائص.

تم شراء الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) وصيانتها في مرفق الحيوانات الصغيرة (SAF) في المعهد الوطني لعلم المناعة (NII). تم احتجازهم في أقفاص فردية جيدة التهوية (IVC) وحصلوا على إمكانية الوصول إلى الماء والغذاء المعقم المحمض. تم الحفاظ عليها عند 21-23 درجة مئوية ومع دورة ضوء / مظلمة 14 ساعة / 10 ساعات.

فيما يلي طريقة جراحية معدلة للتشريح الدقيق لعين الفأر.

Protocol

تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية التابعة للمعهد الوطني لعلم المناعة ، نيودلهي. الرقم المرجعي التسلسلي للموافقة هو IAEC # 480/18. تم إجراء التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التنظيمية للجنة الرقابة والإشراف على التجارب على الحيوانات ، وزارة مصايد الأسماك وتربية الحيوانات ومنتجات الألبان ، حكومة الهند ، تحت إشراف طبيب بيطري محترف في SAF ، NII.

1. التحضير

1. تمدد عيون القوارض باستخدام قطرة من 0.8 ٪ تروبيكاميد و 5 ٪ من محاليل العيون فينيليفرين في كل عين. ضع الحيوان في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل الإجراء.
   ملاحظة: لا يلزم وجود مسكن حيث يتم القتل الرحيم للحيوان فور الانتهاء من 30 دقيقة. يسمح التكيف المظلم وتوسيع عيون الحيوان للمراقب بالتحقق من دموع العين والأضرار قبل العملية. بالإضافة إلى ذلك ، يكون التمدد مفيدا أثناء العمل مع أنسجة مقلة العين المصطبغة.
2. القتل الرحيم للحيوان عن طريق إعطاء جرعة 5x من التخدير داخل الصفاق. الجرعة النموذجية هي 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 10 ملغ من الكيتامين و 1 ملغ من الزيلازين.
   ملاحظة: جرعة القتل الرحيم للحيوان هي الكيتامين عند 400-500 ملغم / كغم من وزن الجسم والزيلازين عند 50 ملغم / كغم من وزن الجسم يعطى داخل الصفاق. بالنسبة للفأر النموذجي الذي يزن 20 جم ، ستكون الجرعة 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10 ملغ من الكيتامين (100 ميكرولتر من محلول مخزون 100 ملغ / مل من الكيتامين) و 1 ملغ من الزيلازين (100 ميكرولتر من محلول مخزون من 10 ملغ / مل زيلازين).
3. تأكد من عدم الاستجابة الكاملة للحافز من خلال فحص منعكس الدواسة. عدم وجود نبضات القلب والتنفس هي أيضا مؤشرات مهمة.
4. ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي للسماح بالوصول الكامل إلى العين.
5. قم بإعداد ملقط خياطة كوليبري ، والملقط المنحني ، وشفرة دقيقة (بحجم 15 درجة ، 3 مم) ، ومقص زنبركي صغير ، ومقص صغير زنبركي بزاوية جاهز للإجراء.

2. استئصال عين الفأر مع الجفن الثالث

1. ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي للسماح بالوصول الكامل إلى العين. افتح الجفون الخارجية بالملقط لتصور الجفن الثالث على النحو الأمثل.
   ملاحظة: يقع الجفن الثالث ، المعروف أيضا باسم الغشاء النخاعي ، باتجاه الزاوية العليا من الظل الأنفي (الشكل 1 أ).
2. حدد الجفن الثالث على أنه نتوء شفاف طفيف مع حدود مصطبغة (الشكل 1 ب).
3. ضع ملقط منحني حول مقلة العين ، واضغط لتحرير العين من المرفقات الدخيلة. هذا سوف يقلل من النزيف في العين من الأنسجة المحيطة.
4. استبدل الملقط المنحني بمقص زنبركي دقيق ، واقطع حول مقلة العين مع الجفن الثالث المتصل به. استخدم جروحا صغيرة مستمرة لتحرير مقلة العين من مرفقات الأنسجة المحيطة.
5. ضع مقصا صغيرا زنبركيا منحنيا تحت مقلة العين لتحرير العين عن طريق قطع العصب البصري. تأكد من تحرير مقلة العين بالكامل من محجر العين.

3. تطهير الأنسجة الدخيلة

1. ضع العين المنزوعة النواة من الفأر الرحيم في طبق بتري مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند درجة الحموضة 7.4 ، مع ملء طبق بتري بحيث يتم غمر مقلة العين في برنامج تلفزيوني.
2. شل حركة مقلة العين المنزوعة النواة للفأر بالجفن الثالث المرفق بيد واحدة باستخدام الملقط.
3. مقلة العين في وسط سائل للسماح بمعالجة أكثر كفاءة. ستبدأ بعض العضلات أو الأنسجة خارج العين في الطفو بعيدا عن مقلة العين. قم بإزالتها عن طريق قطعها عن مقلة العين باستخدام مقص زنبركي صغير.
4. قم بقص وإزالة العصب البصري من قاعدة مقلة العين باستخدام مقص دقيق للسماح بفصل أفضل للشبكية للاستعدادات الكاملة.
   ملاحظة: ليس من الضروري إزالة العصب البصري لتقسيم الأنسجة.
5. اغسل مقلة العين باستخدام برنامج تلفزيوني ، وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة لا تقل عن 2 ساعة عند 4 درجات مئوية لتثبيت الأنسجة.
   ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء مؤقتا في هذه الخطوة عن طريق ترك الأنسجة في PFA لمدة تصل إلى 12 ساعة عند 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، لعزل الخلايا الحية ، لا ينبغي تنفيذ خطوات التثبيت ، ويجب تنفيذ الإجراء بأكمله دون توقف.

4. تشريح العين المنزوعة النواة للحصول على أكواب العين الأمامية والخلفية

1. بعد تثبيت PFA (في حالة جمع الخلايا الحية ، تابع دون تثبيت مقلة العين) ، انقل مقلة العين إلى طبق بتري يحتوي على PBS ، وضعه تحت مجهر تشريح لتنفيذ الإجراء اللاحق.
2. شل حركة مقلة العين عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث بإحكام باستخدام ملقط كوليبري للخياطة.
3. قم بعمل شق صغير في الحافة عن طريق ثقبه باستخدام شفرة صغيرة. الحافة هي تقاطع القرنية الصلبوية. اجعل الشق مفضلا عن الجفن الثالث ، مما يجعل نقطة وصول للمقص الصغير الربيعي.
   ملاحظة: قد يوفر استخدام شفرة صغيرة بحجم 15 درجة و 3 مم تحكما أفضل في عمق هذا الشق.
4. بعد ذلك ، باستخدام هذا الشق كنقطة انطلاق ، مع زوج من المقصات الدقيقة ، قم بعمل جروح صغيرة ومستمرة على طول محيط طرف القرنية الصلبة. أولا ، أكمل نصف دائرة من الجروح بدءا من نقطة الشق إلى الجفن الثالث. ثم أكمل نصف دائرة القطع المتبقية على الجانب الآخر. أخيرا ، قم بعمل قطع حول الجفن الثالث لفصل الكأس الخلفي والكأس الأمامي.
   ملاحظة: اعتمادا على فنجان العين محل الاهتمام ، يمكن ترك الغشاء النيكتيتي متصلا إما بفنجان العين الأمامي أو الخلفي.
5. قم بإزالة العدسة من الكأس الخلفي باستخدام الملقط للحصول على الكأس الخلفي الذي يتكون من طبقات الشبكية العصبية وظهارة الشبكية الصبغية (RPE). وبالتالي ، يتم فصل العدسة والكأس الخلفي والكوب الأمامي للعين.
   ملاحظة: في حالة العمل مع الأنسجة غير الثابتة ، يمكن الآن هضم الكؤوس الأمامية والخلفية إنزيميا للحصول على تعليق القرنية أو الشبكية أحادي الخلية.
6. لتثبيت الأنسجة ، انقل هذه الأكواب إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ PFA لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: بعد التثبيت ، يمكن تضمين الأنسجة في وسط مناسب ، ويمكن إجراء التقسيم بالتبريد أو تقسيم البارافين للحصول على أقسام القرنية أو الشبكية.

5. عزل الشبكية العصبية وطبقات RPE

1. أعد إدخال الكوب الخلفي في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS لغمر الأنسجة.
2. تحقق من وجود شبكية العين العصبية. يمكن تصور ذلك كطبقة معتمة على طبقة RPE المصطبغة ، والتي يتم توصيلها عند المحيط المحيطي للكوب.
3. امسك الجفن الثالث بالملقط لشل حركة الكأس الخلفي ، وانزع الشبكية العصبية بدءا من المحيط باستخدام زوج ثان من الملقط.
   ملاحظة: يوصى بشدة بحركات اليد اللطيفة والطفيفة جدا حتى لا تتلف الأنسجة. عند مخرج العصب البصري، يمكن إدخال مقص الزنبرك المنحني تحت الشبكية العصبية، ويمكن إجراء قطع لتحرير الطبقات تماما إذا ظلت الشبكية العصبية متصلة كما هو موضح في الشكل 3. اختياريا ، حرر أو افصل شبكية العين بضربات لطيفة باستخدام فرشاة ناعمة. ومع ذلك ، لن يكون من المناسب القيام بذلك إذا تم جمع شبكية العين من أجل الأنسجة.
   ملاحظة: يتم الحصول على شبكية العين العصبية وطبقة RPE المصطبغة مع الجفن الثالث.

6. تجزئة طبقات الشبكية و RPE للتركيب الكامل

1. أعد إدخال الكؤوس الأمامية والخلفية في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن PBS المؤقت ، وضع الطبق تحت مجهر التشريح.
2. شل حركة الكوب الأمامي عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث.
3. استخدم مقصا صغيرا بزاوية زنبركية لعمل قطع يبلغ حوالي 3/4 قطر فنجان العين بجوار الجفن الثالث ، مع القطع من المحيط بشكل عمودي باتجاه المركز البصري.
4. حافظ على قبضة على الجفن الثالث ، وقم بعمل قطع بجانب القطع الأول.
5. قم بعمل قطع مماثل بين القطع الثاني والجفن الثالث.
   ملاحظة: ثلاث أو أربع قطع متساوية البعد تفتح الأكواب نصف الكروية على شكل زهرة ، والتي تسقط بشكل مسطح ويمكن تركيبها بسهولة.
6. شل حركة الكوب الخلفي عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث.
7. اتبع نفس الخطوات المعطاة لإجراء التخفيضات (الخطوات 6.3-6.5) على الكوب الأمامي لإجراء ثلاث أو أربع جروح متساوية البعد على الكوب الخلفي.
   ملاحظة: بالنسبة لأنسجة الشبكية العصبية المعزولة في الخطوة 5 ، قم بإجراء جروح مماثلة للتأكد من سقوطها على السطح. لا تقم بعمل جروح عميقة جدا في وسط الكوب ، لأن ذلك قد يجعل أقسام الأوراق تتفتت أو تنفصل بسهولة.
8. أداء تلطيخ ، وتركيب الأنسجة بالكامل لتصور فعال^7،8.
   ملاحظة: يعمل وجود الغشاء النخاعي كمؤشر مادي ثابت للجانب الأنفي من فنجان العين في حوامل كاملة. يساعد على ترسيم الجانب الظهري / البطني من فنجان العين ، حيث يشير الجفن الثالث لفنجان العين إلى الاتجاه الأنفي / البطني.

النتائج

تم إعداد مجموعة كاملة من أنسجة عين الفأر / القرنية rd1 لدراسة تكوين الأوعية اللمفاوية المحتملة في الأنسجة الأمامية / القرنية في حالة مرضية. كان نسيج الملتحمة المرفق من الجفن الثالث بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، لأن القرنية تفتقر إلى الأوعية اللمفاوية. بالنسبة للدراسة ، تم تشريح أنسجة القرنية با...

Discussion

تم العثور على تشريح العين المجهري لتكون مهمة صعبة بسبب صغر حجم وشكل كروية لعين القوارض ، وتتطلب عين القوارض تقنيات مبتكرة للتعامل الفعال⁸.

في الطريقة الموضحة الحالية ، يتم الحصول على مقلة عين الفأر المنزوعة النواة مع الجفن الثالث المتصل للتعامل الفعال والسهل. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare;  India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
CBA/J inbred mice	The Jackson Laboratory	Stock No. 000654
Cefotaxime (Taxim)	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma ; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet)	Reckitt Benckiser , India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma ; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD ; US	REF 303060
Isoflurane ( Forane)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant