Microdissezione dell'occhio del roditore

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo per la micro-dissezione oculare nei roditori. Il processo comporta l'enucleazione del bulbo oculare insieme alla membrana nittitante (cioè la terza palpebra). Questo è poi seguito dalla separazione delle conchiglie oculari posteriori e anteriori.

Abstract

La microdissezione oculare dell'occhio del roditore comporta la segmentazione del bulbo oculare enucleato con la membrana nittitante attaccata, o terza palpebra, per ottenere le cosce oculari anteriori e posteriori. Con questa tecnica, le sottoparti dell'occhio, tra cui il tessuto corneale, il tessuto neurale, il tessuto epiteliale pigmentato retinico (RPE) e il cristallino, possono essere ottenute per interi, crio-sezionamento e / o sospensioni monocellulari di uno specifico tessuto oculare. La presenza della terza palpebra presenta vantaggi unici e significativi, in quanto favorisce il mantenimento dell'orientamento dell'occhio, importante per comprendere la fisiologia oculare a seguito di qualsiasi intervento localizzato o in studi che coinvolgono l'analisi oculare relativa alla topografia spaziale dell'occhio.

In questo metodo, abbiamo enucleato il bulbo oculare alla presa insieme alla terza palpebra tagliando attentamente e lentamente i muscoli extraoculari e recidendo il nervo ottico. Il bulbo oculare è stato perforato attraverso il limbus corneale usando una microlama. L'incisione è stata utilizzata come punto di ingresso, consentendo di tagliare lungo la giunzione corneale-sclerale inserendo micro-forbici attraverso il punto di incisione. Piccoli e continui tagli lungo la circonferenza sono stati fatti fino a quando le coppe si sono separate. Questi potrebbero essere ulteriormente sezionati sbucciando delicatamente lo strato traslucido della retina neurale usando una pinza di sutura Colibri per ottenere la retina neurale e gli strati RPE. Inoltre, tre/quattro tagli equidistanti sono stati effettuati dalla periferia perpendicolarmente al centro ottico fino a raggiungere il nervo ottico. Questo aprì le coppe emisferiche a forma di fiore in modo che cadessero piatte e potessero essere facilmente montate. Questa tecnica è stata utilizzata nel nostro laboratorio per interi corneali e sezioni retiniche. La presenza della terza palpebra delinea l'orientamento naso-temporale, che consente lo studio di vari interventi di terapia cellulare post-trapianto e, quindi, la validazione fisiologica mirata vitale per la visualizzazione e la rappresentazione accurata in tali studi.

Introduzione

La dissezione oculare è una tecnica importante nella ricerca oftalmica e ha permesso ai ricercatori di accedere ai segmenti dell'occhio per studi mirati. In precedenza, i ricercatori oculari si affidavano al tessuto oculare di individui malati per i loro studi. Tuttavia, il numero progressivamente crescente di ceppi di roditori oftalmici modelli¹ nel corso degli anni ha diminuito la necessità di tessuto oculare umano. Questi ceppi murini hanno permesso una comprensione più profonda delle malattie oculari e degli interventi. Tuttavia, hanno anche generato la necessità di tecniche innovative di micro-dissezione oculare. Le dimensioni ridotte e l'area operativa limitata limitano fortemente l'accesso efficace alle sottoparti oculari. Inoltre, a causa dell'assemblaggio cellulare omogeneo delle conchiglie oculari posteriori e anteriori, è difficile condurre interventi mirati post-dissezione. Le attuali tecniche di microdissezione del laser² e della microdissezione chirurgica ^3,4 sono inadeguate a soddisfare tali requisiti della ricerca oculare. La micro-dissezione laser è molto efficace nell'analisi di singole cellule, ma il tessuto specifico deve essere micro-sezionato prima della procedura laser². La tecnica può isolare piccole regioni di interesse da un tessuto pre-sezionato per l'analisi molecolare. Pertanto, la tecnica non è adatta per la preparazione di interi supporti o per l'isolamento di strati oculari assialmente imballati per una visualizzazione ottimale.

Il metodo chirurgico è la tecnica più utilizzata; Questo metodo prevede l'immobilizzazione dell'occhio attraverso il nervo ottico⁵ e quindi l'esecuzione della dissezione. Questa pratica è ardua e può danneggiare qualsiasi tessuto fragile, poiché l'occhio sferico continua a muoversi durante la dissezione. Nonostante sia utile per isolare le varie sezioni degli strati retinici, la tecnica non può delimitare l'orientamento spaziale del tessuto al momento della dissezione.

Durante la dissezione, mantenere la presenza della membrana nittitante attaccata o della terza palpebra (Figura 1) presenta vantaggi unici e significativi. In questo metodo, in primo luogo, il bulbo oculare viene enucleato con la terza palpebra. Quindi, la terza palpebra viene utilizzata per immobilizzare l'occhio⁶ (Figura 2A). Questo è seguito perforando il bulbo oculare attraverso il limbus corneale e usando l'incisione come punto di ingresso (Figura 2B, C). Quindi, le conchiglie oculari vengono separate tagliando lungo la circonferenza anteriormente e posteriormente (Figura 2D-G). Sezionando ulteriormente la coppa oculare posteriore, lo strato traslucido della retina neurale può essere identificato e rimosso delicatamente. Vengono quindi effettuati tre o quattro tagli equidistanti nelle coppe emisferiche anteriori e posteriori ottenute, che consentono a queste coppe a forma di fiore di cadere piatte su un vetrino (Figura 2H).

La terza palpebra aiuta a maneggiare facilmente ed efficacemente durante la dissezione, garantendo così danni minimi al tessuto durante l'accesso ai vari strati oculari e durante la produzione di interi. Inoltre, la presenza della terza palpebra aiuta a individuare ed esaminare gli interventi localizzati durante la visualizzazione.

La procedura, nel nostro laboratorio, è stata eseguita su un ceppo di topo CBA/J o rd1 a P28 di qualsiasi sesso. La procedura può essere eseguita su qualsiasi ceppo, età o sesso dell'animale e non ha pregiudizi in base a queste caratteristiche.

Gli animali sono stati acquistati da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e mantenuti presso la Small Animal Facility (SAF) presso l'Istituto Nazionale di Immunologia (NII). Sono stati tenuti in gabbie ventilate individuali (IVC) e hanno ricevuto accesso ad libitum ad acqua e cibo acidificati in autoclave. Sono stati mantenuti a 21-23 °C e con un ciclo luce/buio di 14 h/10 h.

Di seguito è riportato un metodo chirurgico modificato per la micro-dissezione di un occhio di topo.

Protocollo

Questa procedura è stata approvata dall'Institutional Animal Ethics Committee del National Institute of Immunology, New Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'omologazione è IAEC#480/18. Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del regolamento del Comitato per il controllo e la supervisione degli esperimenti sugli animali, Ministero della pesca, della zootecnia e dei prodotti lattiero-caseari, governo indiano, sotto la supervisione di un veterinario professionista presso il SAF, NII.

1. Preparazione

1. Dilatare gli occhi dei roditori usando una goccia di 0,8% di tropicamide e 5% di soluzioni oftalmiche di fenilefrina in ciascun occhio. Posizionare l'animale in una zona buia per 30 minuti prima della procedura.
   NOTA: Non è richiesto un analgesico in quanto l'animale viene eutanasia immediatamente dopo aver completato i 30 minuti. L'adattamento scuro e la dilatazione degli occhi dell'animale consentono all'osservatore di verificare la presenza di lacrime oculari e danni prima della procedura. Inoltre, la dilatazione è vantaggiosa quando si lavora con il tessuto pigmentato del bulbo oculare.
2. Eutanasia l'animale somministrando per via intraperitoneale una dose 5x di anestesia. Una dose tipica è di 200 μL di PBS contenente 10 mg di ketamina e 1 mg di xilazina.
   NOTA: La dose per l'eutanasia dell'animale è ketamina a 400-500 mg/kg di peso corporeo e xilazina a 50 mg/kg di peso corporeo somministrata per via intraperitoneale. Per un topo tipico del peso di 20 g, la dose sarebbe di 200 μL di PBS contenente 10 mg di ketamina (100 μL di una soluzione madre di 100 mg/mL di ketamina) e 1 mg di xilazina (100 μL di una soluzione madre di 10 mg/ml di xilazina).
3. Conferma la completa mancanza di risposta a uno stimolo esaminando il riflesso del pedale. Anche l'assenza di battito cardiaco e respirazione sono indicatori importanti.
4. Posizionare il mouse in posizione sdraiata laterale per consentire l'accesso completo all'occhio.
5. Preparare una pinza da sutura Colibri, una pinza curva, una microlama (15°, 3 mm di dimensione), micro-forbici a molla e micro-forbici a molla angolata pronte per la procedura.

2. Enucleazione dell'occhio del topo insieme alla terza palpebra

1. Posizionare il mouse in posizione sdraiata laterale per consentire un accesso completo all'occhio. Aprire le palpebre esterne con la pinza per visualizzare in modo ottimale la terza palpebra.
   NOTA: La terza palpebra, nota anche come membrana nittitante, si trova verso l'angolo superiore della tangente nasale (Figura 1A).
2. Identificare la terza palpebra come una protuberanza traslucida minore con un bordo pigmentato (Figura 1B).
3. Posizionare una pinza curva attorno al bulbo oculare e pizzicare per liberare l'occhio da attacchi estranei. Ciò ridurrà al minimo il sanguinamento nell'occhio dal tessuto circostante.
4. Sostituire le pinze curve con micro-forbici a molla e tagliare intorno al bulbo oculare con la terza palpebra attaccata ad esso. Utilizzare piccoli tagli continui per rilasciare il bulbo oculare dagli attacchi del tessuto circostante.
5. Posizionare micro-forbici a molla curva sotto il bulbo oculare per liberare l'occhio tagliando il nervo ottico. Assicurarsi che il bulbo oculare sia completamente rilasciato dall'orbita oculare.

3. Eliminazione del tessuto estraneo

1. Posizionare l'occhio enucleato dal topo eutanasia in una capsula di Petri con tampone salino tamponato fosfato (PBS) a pH 7,4, con la capsula di Petri riempita in modo tale che il bulbo oculare sia immerso in PBS.
2. Immobilizzare il bulbo oculare enucleato del topo con la terza palpebra attaccata con una mano usando una pinza.
3. Sospendere il bulbo oculare in mezzo liquido per consentire una manipolazione più efficiente. Alcuni muscoli o tessuti extraoculari inizieranno a galleggiare lontano dal bulbo oculare. Rimuovili tagliandoli dal bulbo oculare usando micro-forbici a molla.
4. Tagliare e rimuovere il nervo ottico dalla base del bulbo oculare utilizzando micro-forbici per consentire una migliore separazione della retina per i preparati a montaggio intero.
   NOTA: Non è necessario rimuovere il nervo ottico per il sezionamento dei tessuti.
5. Lavare il bulbo oculare con PBS e trasferirlo in un tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% per un minimo di 2 ore a 4 °C per la fissazione dei tessuti.
   NOTA: La procedura può essere sospesa in questa fase lasciando il tessuto in PFA per un massimo di 12 ore a 4 °C. Tuttavia, per l'isolamento delle cellule vive, le fasi di fissazione non devono essere eseguite e l'intera procedura deve essere eseguita senza pause.

4. Dissezione dell'occhio enucleato per ottenere le conchiglie oculari anteriori e posteriori

1. Dopo la fissazione PFA (se si raccolgono cellule vive, procedere senza la fissazione del bulbo oculare), trasferire il bulbo oculare in una capsula di Petri contenente PBS e metterlo sotto un microscopio da dissezione per eseguire la procedura successiva.
2. Immobilizzare il bulbo oculare tenendo saldamente la terza palpebra con una pinza da sutura Colibri.
3. Fai una piccola incisione al limbus perforandolo usando una micro-lama. Il limbus è la giunzione corneale-sclerale. Fai l'incisione preferibilmente di fronte alla terza palpebra, creando così un punto di accesso per le micro-forbici a molla.
   NOTA: L'uso di una microlama di 15° e 3 mm di dimensione può fornire un migliore controllo sulla profondità di questa incisione.
4. Successivamente, utilizzando questa incisione come punto di partenza, con un paio di microforbici, eseguire piccoli e continui tagli lungo la circonferenza del limbus corneale-sclerale. Per prima cosa, completa un semicerchio di tagli a partire dal punto di incisione fino alla terza palpebra. Quindi, completate il semicerchio rimanente di tagli sull'altro lato. Infine, fai un taglio intorno alla terza palpebra per separare la coppa posteriore e la coppa anteriore.
   NOTA: A seconda della coppa oculare di interesse, la membrana nittitante può essere lasciata attaccata all'oculare anteriore o posteriore.
5. Rimuovere la lente dalla coppa posteriore usando una pinza per ottenere la coppa posteriore che comprende la retina neurale e gli strati dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). La lente, la coppa posteriore e la coppa anteriore dell'occhio sono, quindi, separate.
   NOTA: Se si lavora con tessuti non fissi, le coppe anteriore e posteriore possono ora essere digerite enzimaticamente per ottenere una sospensione unicellulare corneale o retinica.
6. Per fissare i tessuti, trasferire queste coppette in un tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di PFA al 4% per 12 ore a 4 °C.
   NOTA: Dopo la fissazione, il tessuto può essere incorporato in un mezzo appropriato e la criosezione o il sezionamento della paraffina possono essere eseguiti per ottenere sezioni corneali o retiniche.

5. Isolamento della retina neurale e degli strati RPE

1. Reintrodurre la coppa posteriore nella capsula di Petri contenente tampone PBS per immergere il tessuto.
2. Verificare la presenza della retina neurale. Questo può essere visualizzato come uno strato opaco sullo strato RPE pigmentato, che è attaccato alla circonferenza periferica della tazza.
3. Tenere la terza palpebra con una pinza per immobilizzare la coppa posteriore e staccare la retina neurale partendo dalla periferia usando un secondo paio di pinze.
   NOTA: Movimenti molto delicati e leggeri della mano sono altamente raccomandati per non danneggiare il tessuto. All'uscita del nervo ottico, le forbici a molla curve possono essere inserite sotto la retina neurale e un taglio può essere effettuato per liberare completamente gli strati se la retina neurale rimane attaccata come illustrato nella Figura 3. Facoltativamente, liberare o staccare la retina con tratti delicati usando una spazzola morbida. Tuttavia, non sarebbe opportuno farlo se si raccoglie la retina per l'istologia.
   NOTA: La retina neurale e lo strato di RPE pigmentato con la terza palpebra sono, quindi, ottenuti.

6. Segmentazione degli strati retinici e RPE per wholemount

1. Reintrodurre le coppe anteriore e posteriore nella capsula di Petri contenente tampone PBS e posizionare il piatto sotto il microscopio da dissezione.
2. Immobilizzare la coppa anteriore tenendo premuto la terza palpebra.
3. Utilizzare micro-forbici a molla angolate per effettuare un taglio di circa 3/4 del diametro della concia oculare accanto alla terza palpebra, tagliando dalla periferia perpendicolarmente verso il centro ottico.
4. Mantieni una presa sulla terza palpebra e fai un taglio accanto al primo taglio.
5. Fai un taglio simile tra il secondo taglio e la terza palpebra.
   NOTA: Tre o quattro tagli equidistanti aprono le coppe emisferiche in una forma di fiore, che cade piatta e può essere facilmente montata.
6. Immobilizzare la coppa posteriore tenendo premuta la terza palpebra.
7. Seguire gli stessi passaggi indicati per effettuare i tagli (passi 6.3-6.5) sulla coppa anteriore per effettuare tre o quattro tagli equidistanti sulla coppa posteriore.
   NOTA: Per l'istologia della retina neurale isolata nel passaggio 5, eseguire tagli simili per assicurarsi che cada piatta su una superficie. Non fare tagli molto profondi al centro della tazza, in quanto ciò potrebbe far cadere le sezioni fogliari a pezzi o separarsi facilmente.
8. Eseguire la colorazione e montare integralmente i tessuti per una visualizzazione efficace ^7,8.
   NOTA: La presenza della membrana nittitante funge da indicatore fisico costante del lato nasale della coppa oculare nei wholemount. Aiuta a demarcare il lato dorsale / ventrale della coppa oculare, poiché la terza palpebra del bulbo oculare indica l'orientamento nasale / ventrale.

Risultati

Un intero tessuto corneale dell'occhio di topo rd1 è stato preparato per studiare la potenziale linfo-angiogenesi nel tessuto anteriore/corneale in uno stato patologico. Il tessuto congiuntivale attaccato dalla terza palpebra ha agito come un controllo positivo, poiché la cornea manca di vasi linfatici. Per lo studio, il tessuto corneale è stato sezionato con la congiuntiva ed è stato fissato con il 4% di PFA, seguito da permeabilizzazione e blocco. Il tessuto è stato quindi colorato con un anticorpo primario contro...

Discussione

La microdissezione oculare si è rivelata un compito difficile a causa delle piccole dimensioni e della forma sferica dell'occhio del roditore e l'occhio del roditore richiede tecniche innovative per una manipolazione efficiente⁸.

Nell'attuale metodo dimostrato, il bulbo oculare del topo enucleato è ottenuto con la terza palpebra attaccata per una manipolazione efficace e facile. Utilizzando la terza palpebra, il bulbo oculare può essere immobilizzato completamente, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare;  India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
CBA/J inbred mice	The Jackson Laboratory	Stock No. 000654
Cefotaxime (Taxim)	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma ; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet)	Reckitt Benckiser , India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma ; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD ; US	REF 303060
Isoflurane ( Forane)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant