Kemirgen Gözün Mikrodiseksiyonu

Özet

Bu yazıda kemirgenlerde oküler mikrodiseksiyon için bir protokol sunulmaktadır. İşlem, göz küresinin niktitasyon zarı (yani üçüncü göz kapağı) ile birlikte enükleasyonunu içerir. Bunu daha sonra arka ve ön göz kapaklarının ayrılması izler.

Özet

Kemirgen gözünün oküler mikro diseksiyonu, ön ve arka göz kapaklarını elde etmek için enüklee edilmiş göz küresinin bağlı niktitasyon zarı veya üçüncü göz kapağı ile segmentasyonunu içerir. Bu teknikle, kornea dokusu, sinir dokusu, retinal pigment epitel (RPE) dokusu ve lens dahil olmak üzere gözün alt kısımları, belirli bir oküler dokunun bütünlemeleri, kriyo-kesitleme ve / veya tek hücreli süspansiyonları için elde edilebilir. Üçüncü göz kapağının varlığı, herhangi bir lokalize müdahaleyi takiben veya gözün uzamsal topografisi ile ilgili oküler analizi içeren çalışmalarda göz fizyolojisini anlamak için önemli olan gözün oryantasyonunun korunmasına fayda sağladığı için benzersiz ve önemli avantajlar sunar.

Bu yöntemde, göz dışı kasları dikkatlice ve yavaşça keserek ve optik siniri keserek üçüncü göz kapağı ile birlikte yuvadaki göz küresini enüklee ettik. Göz küresi bir mikrobıçak kullanılarak kornea limbusundan delindi. Kesi, giriş noktası olarak kullanıldı ve kesi noktasından mikro makas yerleştirilerek kornea-skleral bileşke boyunca kesime izin verildi. Bardaklar ayrılana kadar çevre boyunca küçük ve sürekli kesimler yapıldı. Bunlar, nöral retina ve RPE katmanlarını elde etmek için Colibri dikiş forseps kullanılarak nöral retinanın yarı saydam tabakasının hafifçe soyulmasıyla daha da diseke edilebilir. Ayrıca, optik sinire ulaşılana kadar periferden optik merkeze dik olarak üç/dört eşit uzaklıkta kesim yapıldı. Bu, yarım küre şeklindeki bardakları çiçek şeklinde açtı, böylece düz düştüler ve kolayca monte edilebildiler. Bu teknik laboratuvarımızda kornea kepçeleri ve retina kesitleri için kullanılmıştır. Üçüncü göz kapağının varlığı, nakil sonrası çeşitli hücre tedavisi müdahalelerinin incelenmesine izin veren nazal-temporal oryantasyonu ve dolayısıyla bu tür çalışmalarda görselleştirme ve doğru temsil için hayati önem taşıyan hedeflenen fizyolojik doğrulamayı tanımlar.

Giriş

Oküler diseksiyon, oftalmik araştırmalarda önemli bir tekniktir ve araştırmacıların hedeflenen çalışmalar için gözün segmentlerine erişmelerine izin vermiştir. Daha önce, oküler araştırmacılar, çalışmaları için hastalıklı bireylerin oküler dokusuna güveniyorlardı. Bununla birlikte, yıllar içinde oftalmik kemirgen modellerinin¹ suşlarının sayısının giderek artması, insan oküler dokusuna olan ihtiyacı azaltmıştır. Bu fare suşları, oküler hastalık ve müdahalelerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, oküler mikro-diseksiyonun yenilikçi tekniklerine de ihtiyaç duymuşlardır. Küçük boyut ve sınırlı operasyon alanı, oküler alt parçalara etkili erişimi ciddi şekilde kısıtlar. Ayrıca, posterior ve anterior vizör kapaklarının homojen hücresel montajı nedeniyle, diseksiyon sonrası hedefe yönelik müdahalelerin yapılması zordur. Lazer² ve cerrahi mikrodiseksiyon ^3,4'ün mevcut mikrodiseksiyon teknikleri^, oküler araştırmaların bu gereksinimlerini karşılamada yetersizdir. Lazer mikro-diseksiyonu tek hücreli analizde çok etkilidir, ancak spesifik dokunun lazer prosedürü^2'den önce mikro diseke edilmesi gerekir. Teknik, moleküler analiz için küçük ilgi alanlarını önceden disseke edilmiş bir dokudan izole edebilir. Bu nedenle, teknik tüm montajların hazırlanması veya optimum görselleştirme için eksenel olarak paketlenmiş oküler tabakaların izolasyonu için uygun değildir.

Cerrahi yöntem en çok kullanılan tekniktir; Bu yöntem, gözün optik sinir⁵ yoluyla hareketsiz hale getirilmesini ve daha sonra diseksiyonun yapılmasını içerir. Bu uygulama zordur ve diseksiyon sırasında küresel göz hareket etmeye devam ettiği için herhangi bir kırılgan dokuya zarar verebilir. Retina tabakalarının çeşitli bölümlerini izole etmek için faydalı olmasına rağmen, teknik diseksiyon üzerine dokunun uzamsal yönelimini belirleyemez.

Diseksiyon sırasında, bağlı niktitasyon zarının veya üçüncü göz kapağının varlığını korumak (Şekil 1) benzersiz ve önemli avantajlar sunar. Bu yöntemde öncelikle üçüncü göz kapağı ile göz küresi enüklee edilir. Daha sonra, üçüncü göz kapağı gözü^immobilize etmek için kullanılır 6 (Şekil 2A). Bunu göz küresinin kornea limbusundan delinmesi ve insizyonun giriş noktası olarak kullanılması izler (Şekil 2B,C). Daha sonra vizör kapakları ön ve arka çevre boyunca kesilerek ayrılır (Şekil 2D-G). Arka vizör adaptörünü daha da diseke ederek, nöral retinanın yarı saydam tabakası tanımlanabilir ve nazikçe soyulabilir. Daha sonra elde edilen yarım küre şeklindeki ön ve arka bardaklarda üç veya dört eşit mesafeli kesim yapılır, bu da bu çiçek şeklindeki bardakların bir slayt üzerine düz bir şekilde düşmesine izin verir (Şekil 2H).

Üçüncü göz kapağı, diseksiyon sırasında kolay ve verimli bir şekilde kullanılmasına yardımcı olur, böylece çeşitli oküler tabakalara erişirken ve bütünsel montajlar üretirken dokuya minimum hasar verir. Ayrıca, üçüncü göz kapağının varlığı, görselleştirme sırasında lokalize müdahalelerin bulunmasına ve incelenmesine yardımcı olur.

Prosedürümüz, laboratuarımızda, herhangi bir cinsiyetin P28'inde bir CBA / J veya rd1 fare suşu üzerinde gerçekleştirilmiştir. Prosedür, hayvanın herhangi bir suşu, yaşı veya cinsiyeti üzerinde yapılabilir ve bu özelliklere göre önyargısı yoktur.

Hayvanlar ticari kaynaklardan temin edildi ( bakınız Malzeme Tablosu) ve Ulusal İmmünoloji Enstitüsü'ndeki (NII) Küçük Hayvan Tesisi'nde (SAF) muhafaza edildi. Bireysel havalandırmalı kafeslerde (IVC) tutuldular ve asitleştirilmiş otoklavlanmış suya ve yiyeceğe ad libitum erişimi aldılar. 21-23 ° C'de ve 14 saat / 10 saat açık / karanlık döngüsünde tutuldular.

Aşağıda verilen, bir fare gözünün mikro diseksiyonu için modifiye edilmiş bir cerrahi yöntemdir.

Protokol

Bu prosedür, Yeni Delhi Ulusal İmmünoloji Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır. Onayın seri referans numarası IAEC#480/18'dir. Deneyler, Hindistan Hükümeti, Hayvanlar Üzerinde Deneylerin Kontrol ve Denetimi Komitesi, Balıkçılık, Hayvancılık ve Süt Ürünleri Bakanlığı'nın düzenleme yönergelerine uygun olarak, SAF, NII'deki profesyonel bir Veterinerin gözetiminde gerçekleştirilmiştir.

1. Hazırlık

1. Her gözde% 0.8 tropikamid% 5 fenilefrin oftalmik çözeltileri kullanarak kemirgen gözlerini genişletin. İşlemden önce hayvanı 30 dakika boyunca karanlık bir alana yerleştirin.
   NOT: Hayvan 30 dakikayı tamamladıktan hemen sonra ötenazi yapıldığından analjezik gerekli değildir. Karanlık adaptasyon ve hayvanın gözlerinin genişlemesi, gözlemcinin işlemden önce oküler gözyaşlarını ve hasarı kontrol etmesini sağlar. Ek olarak, pigmentli göz küresi dokusu ile çalışırken dilatasyon avantajlıdır.
2. İntraperitoneal olarak 5x anestezi dozu uygulayarak hayvanı ötenazileştirin. Tipik bir doz, 10 mg ketamin ve 1 mg ksilazin içeren 200 μL PBS'dir.
   NOT: Hayvanı ötenazi için doz, intraperitoneal olarak verilen 400-500 mg / kg vücut ağırlığında ketamin ve 50 mg / kg vücut ağırlığında ksilazindir. 20 g ağırlığındaki tipik bir fare için doz, 10 mg ketamin (100 mg / mL ketamin stok çözeltisinin 100 μL'si) ve 1 mg ksilazin (10 mg / mL ksilazin stok çözeltisinin 100 μL'si) içeren 200 μL PBS olacaktır.
3. Pedal refleksini inceleyerek bir uyarana tam yanıt eksikliğini onaylayın. Kalp atışı ve solunum olmaması da önemli göstergelerdir.
4. Göze tam erişime izin vermek için fareyi yanal yassılığa yerleştirin.
5. Colibri dikiş forsepsleri, kavisli forsepsler, bir mikro bıçak (15 °, 3 mm boyutunda), yaylı mikro makas ve açılı yaylı mikro makasları prosedür için hazır hazırlayın.

2. Üçüncü göz kapağı ile birlikte fare gözünün enükleasyonu

1. Göze tam erişim sağlamak için fareyi yanal yatışa yerleştirin. Üçüncü göz kapağını en iyi şekilde görselleştirmek için forseps ile dış göz kapaklarını açın.
   NOT: Niktitasyon zarı olarak da bilinen üçüncü göz kapağı, burun teğetinin üst köşesine doğru yerleştirilmiştir (Şekil 1A).
2. Üçüncü göz kapağını pigmentli bir sınıra sahip minör yarı saydam bir çıkıntı olarak tanımlayın (Şekil 1B).
3. Göz küresinin etrafına kavisli forseps yerleştirin ve gözü yabancı ataşmanlardan kurtarmak için çimdikleyin. Bu, çevredeki dokudan göze kanamayı en aza indirecektir.
4. Kavisli forsepsleri yaylı mikro makasla değiştirin ve göz küresinin etrafını üçüncü göz kapağı takılı olarak kesin. Göz küresini çevreleyen doku eklerinden serbest bırakmak için küçük sürekli kesikler kullanın.
5. Optik siniri keserek gözü serbest bırakmak için kavisli yaylı mikro makası göz küresinin altına yerleştirin. Göz küresinin göz yuvasından tamamen serbest bırakıldığından emin olun.

3. Yabancı dokunun temizlenmesi

1. Ötanize edilmiş fareden gelen enüklee edilmiş gözü, pH 7.4'te fosfat tamponlu salin (PBS) tamponlu bir Petri kabına yerleştirin ve Petri kabı, göz küresi PBS'ye batırılacak şekilde doldurulur.
2. Forseps kullanarak farenin enüklee edilmiş göz küresini, bağlı üçüncü göz kapağı ile bir elinizle hareketsiz hale getirin.
3. Daha verimli kullanım için göz küresini sıvı ortamda askıya alın. Bazı ekstraoküler kaslar veya dokular göz küresinden uzaklaşmaya başlayacaktır. Yaylı mikro makas kullanarak göz küresini keserek çıkarın.
4. Tüm montaj preparatları için retinanın daha iyi ayrılmasını sağlamak için mikro makas kullanarak optik siniri göz küresinin tabanından kesin ve çıkarın.
   NOT: Doku kesiti için optik sinirin çıkarılması gerekli değildir.
5. Göz küresini PBS ile yıkayın ve doku fiksasyonu için 4 ° C'de en az 2 saat boyunca 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: İşlem bu aşamada, dokuyu 4 °C'de 12 saate kadar PFA'da bırakarak duraklatılabilir. Bununla birlikte, canlı hücrelerin izolasyonu için, fiksasyon adımları uygulanmamalı ve tüm prosedürün duraklamadan yapılması gerekir.

4. Ön ve arka kapakları elde etmek için enüklee gözün diseksiyonu

1. PFA fiksasyonundan sonra (canlı hücreler toplanıyorsa, göz küresinin sabitlenmesi olmadan devam edin), göz küresini PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve sonraki prosedürü gerçekleştirmek için diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
2. Colibri dikiş forsepsleri ile üçüncü göz kapağını sıkıca tutarak göz küresini hareketsiz hale getirin.
3. Bir mikro bıçak kullanarak delerek limbusta küçük bir kesi yapın. Limbus kornea-skleral kavşaktır. Kesisi tercihen üçüncü göz kapağının karşısında yapın, böylece yay mikro makası için bir erişim noktası oluşturun.
   NOT: 15° ve 3 mm boyutunda bir mikrobıçak kullanmak, bu insizyonun derinliği üzerinde daha iyi kontrol sağlayabilir.
4. Daha sonra, bu insizyonu bir başlangıç noktası olarak kullanarak, bir çift mikro makasla kornea-skleral limbusun çevresi boyunca küçük ve sürekli kesikler yapın. İlk olarak, kesi noktasından başlayarak üçüncü göz kapağına kadar yarım daire şeklinde bir kesik tamamlayın. Ardından, diğer taraftaki kalan yarım daire şeklindeki kesimleri tamamlayın. Son olarak, arka fincan ve ön fincanı ayırmak için üçüncü göz kapağının etrafında bir kesim yapın.
   NOT: İlgilenilen vizör adaptörüne bağlı olarak, niktitasyon zarı ön veya arka vizör adaptörüne bağlı bırakılabilir.
5. Nöral retina ve retinal pigment epitel (RPE) katmanlarını içeren posterior fincanı elde etmek için forseps kullanarak lensi posterior bardaktan çıkarın. Lens, arka fincan ve gözün ön fincanı böylece ayrılır.
   NOT: Sabit olmayan dokularla çalışıyorsanız, ön ve arka kaplar artık kornea veya retinal tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için enzimatik olarak sindirilebilir.
6. Dokuları sabitlemek için, bu bardakları 4 ° C'de 12 saat boyunca 1 mL% 4 PFA içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: Fiksasyon sonrası doku uygun bir ortama gömülebilir ve kornea veya retina kesitleri elde etmek için kriyoseksiyon veya parafin kesitleme yapılabilir.

5. Nöral retina ve RPE tabakalarının izolasyonu

1. Dokuyu batırmak için arka kabı PBS tamponu içeren Petri kabına tekrar yerleştirin.
2. Nöral retinanın varlığını kontrol edin. Bu, kabın periferik çevresine tutturulmuş pigmentli RPE tabakası üzerinde opak bir tabaka olarak görselleştirilebilir.
3. Arka kabı hareketsiz hale getirmek için üçüncü göz kapağını forseps ile tutun ve ikinci bir çift forseps kullanarak çevreden başlayarak nöral retinayı soyun.
   NOT: Dokuya zarar vermemek için elin çok nazik ve hafif hareketleri şiddetle tavsiye edilir. Optik sinir çıkışında, kavisli yay makası nöral retinanın altına yerleştirilebilir ve nöral retina Şekil 3'te gösterildiği gibi bağlı kalırsa katmanları tamamen serbest bırakmak için bir kesim yapılabilir. İsteğe bağlı olarak, yumuşak bir fırça kullanarak retinayı yumuşak darbelerle serbest bırakın veya çıkarın. Ancak retinanın histoloji için toplanması durumunda bunu yapmak uygun olmaz.
   NOT: Böylece üçüncü göz kapağına sahip nöral retina ve pigmentli RPE tabakası elde edilir.

6. Retinal ve RPE katmanlarının bütünler için segmentasyonu

1. Ön ve arka kapları PBS tamponu içeren Petri kabına tekrar sokun ve çanağı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
2. Üçüncü göz kapağını basılı tutarak ön kabı hareketsiz hale getirin.
3. Üçüncü göz kapağının yanındaki vizör adaptörünün çapının yaklaşık 3 / 4'ünü kesmek için açılı yaylı mikro makas kullanın, çevreden optik merkeze dik olarak kesin.
4. Üçüncü göz kapağını tutun ve ilk kesimin yanında bir kesim yapın.
5. İkinci kesim ile üçüncü göz kapağı arasında benzer bir kesim yapın.
   NOT: Bu tür üç veya dört eşit mesafeli kesim, yarım küre şeklindeki bardakları düz düşen ve kolayca monte edilebilen bir çiçek şekline açar.
6. Üçüncü göz kapağını basılı tutarak arka bardağı hareketsiz hale getirin.
7. Arka kapta üç veya dört eşit mesafeli kesim yapmak için ön kapta kesimleri (adım 6.3-6.5) yapmak için verilen adımları izleyin.
   NOT: 5. adımda izole edilen nöral retinanın histolojisi için, bir yüzeye düz düşmesini sağlamak için benzer kesimler yapın. Bardağın ortasına çok derin kesimler yapmayın, çünkü bu yaprak bölümlerinin kolayca parçalanmasına veya ayrılmasına neden olabilir.
8. Boyama işlemini gerçekleştirin ve etkili görselleştirme için dokuları tamamen monte edin ^7,8.
   NOT: Niktitasyon zarının varlığı, tüm montajlarda vizör adaptörünün burun tarafının sabit bir fiziksel göstergesi olarak işlev görür. Göz kapağının üçüncü göz kapağı nazal / ventral oryantasyonu gösterdiği için göz kapağının dorsal / ventral tarafını ayırmaya yardımcı olur.

Sonuçlar

Hastalıklı bir durumda anterior/kornea dokusundaki potansiyel lenf-anjiyogenezi incelemek için rd1 fare gözü/kornea dokusunun tamamı hazırlandı. Üçüncü göz kapağından bağlanan konjonktival doku, kornea lenfatik damarlardan yoksun olduğu için pozitif bir kontrol görevi gördü. Çalışma için kornea dokusu konjonktiva ile diseke edildi ve% 4 PFA ile sabitlendi, ardından permeabilizasyon ve blokaj yapıldı. Doku daha sonra lenfatik endotel belirtecine (LYVE1)⁹ karşı primer b...

Tartışmalar

Oküler mikrodiseksiyonun, kemirgen gözünün küçük boyutu ve küresel şekli nedeniyle zor bir görev olduğu bulunmuştur ve kemirgen gözü, etkili kullanım için yenilikçi teknikler gerektirir⁸.

Mevcut gösterilen yöntemde, enüklee fare göz küresi, etkili ve kolay kullanım için takılı üçüncü göz kapağı ile elde edilir. Üçüncü göz kapağını kullanarak, göz küresi tamamen hareketsiz hale getirilebilir, bu da diseksiyonun kolaylıkla ve m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare;  India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
CBA/J inbred mice	The Jackson Laboratory	Stock No. 000654
Cefotaxime (Taxim)	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma ; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet)	Reckitt Benckiser , India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma ; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD ; US	REF 303060
Isoflurane ( Forane)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant