Микродиссекция глаза грызуна

Резюме

В данной работе представлен протокол микродиссекции глаза у грызунов. Процесс включает энуклеацию глазного яблока вместе с мигательной мембраной (т.е. третьим веком). Затем следует разделение заднего и переднего наглазников.

Аннотация

Глазное микрорассечение глаза грызуна включает сегментацию энуклеированного глазного яблока с прикрепленной мигательной мембраной или третьим веком для получения переднего и заднего наглазников. С помощью этого метода подчасти глаза, включая ткань роговицы, нервную ткань, ткань пигментного эпителия сетчатки (RPE) и хрусталик, могут быть получены для цельных суспензий, криосекций и/или одноклеточных суспензий конкретной ткани глаза. Наличие третьего века представляет собой уникальные и значительные преимущества, поскольку оно способствует поддержанию ориентации глаза, что важно для понимания физиологии глаза после любого локализованного вмешательства или в исследованиях, включающих глазной анализ, связанный с пространственной топографией глаза.

В этом методе мы энуклеировали глазное яблоко в глазнице вместе с третьим веком, осторожно и медленно разрезая экстраокулярные мышцы и разрывая зрительный нерв. Глазное яблоко было проткнуто через лимб роговицы с помощью микролезвия. Разрез был использован в качестве точки входа, что позволило разрезать вдоль роговицы-склерального соединения путем введения микроножниц через точку разреза. Небольшие и непрерывные надрезы по окружности делались до тех пор, пока чашечки не разошлись. Они могут быть дополнительно рассечены путем осторожного отслаивания полупрозрачного слоя нервной сетчатки с помощью щипцов для наложения швов Colibri для получения слоев нервной сетчатки и RPE. Далее от периферии перпендикулярно к зрительному центру делали три/четыре равноудаленных разреза до тех пор, пока не был достигнут зрительный нерв. Это открыло полусферические чашечки в форме цветка, так что они упали плашмя и могли быть легко установлены. Этот метод был использован в нашей лаборатории для целых срезов роговицы и сетчатки. Наличие третьего века очерчивает носово-временную ориентацию, что позволяет изучать различные вмешательства клеточной терапии после трансплантации и, таким образом, целенаправленную физиологическую валидацию, жизненно важную для визуализации и точного представления в таких исследованиях.

Введение

Вскрытие глаза является важным методом в офтальмологических исследованиях и позволило исследователям получить доступ к сегментам глаза для целевых исследований. Ранее офтальмологи полагались на глазную ткань больных людей для своих исследований. Однако постепенно растущее число штаммов офтальмологических моделей грызунов¹ с годами уменьшило потребность в глазной ткани человека. Эти штаммы мышей позволили глубже понять глазные заболевания и вмешательства. Тем не менее, они также породили потребность в инновационных методах микродиссекции глаза. Малый размер и ограниченная область операции серьезно ограничивают эффективный доступ к подразделению глаза. Кроме того, из-за однородной клеточной сборки задних и передних глазных чашек трудно проводить целенаправленные вмешательства после рассечения. Современные методы микродиссекции лазера² и хирургической микродиссекции ^3,4 недостаточны для удовлетворения таких требований глазных исследований. Лазерная микродиссекция очень эффективна при анализе отдельных клеток, но конкретная ткань должна быть микрорассечена перед лазерной процедурой². Этот метод может изолировать небольшие области, представляющие интерес, из предварительно рассеченной ткани для молекулярного анализа. Таким образом, этот метод не подходит для подготовки цельных креплений или для изоляции окулярных слоев в осевой части для оптимальной визуализации.

Хирургический метод является наиболее широко используемым методом; Этот метод включает в себя иммобилизацию глаза через зрительный нерв⁵ с последующим вскрытием. Эта практика трудна и может повредить любую хрупкую ткань, так как сферический глаз продолжает двигаться во время рассечения. Несмотря на то, что он полезен для изоляции различных участков слоев сетчатки, этот метод не может разграничить пространственную ориентацию ткани при рассечении.

Во время диссекции сохранение присутствия прикрепленной мигательной мембраны или третьего века (рис. 1) представляет собой уникальные и значительные преимущества. В этом методе сначала глазное яблоко энуклеируется третьим веком. Затем третье веко используется для иммобилизации глаза⁶ (рис. 2А). Затем следует прокалывание глазного яблока через лимб роговицы и использование разреза в качестве точки входа (рис. 2B, C). Затем наглазники разделяют, разрезая по окружности спереди и сзади (рис. 2D-G). Рассекая заднюю чашку глаза, можно идентифицировать полупрозрачный слой нервной сетчатки и аккуратно отслаивать. Затем в полученных полусферических передних и задних чашечках делаются три или четыре равноудаленных разреза, которые позволяют этим чашечкам в форме цветка падать плашмя на предметное стекло (рис. 2H).

Третье веко способствует простому и эффективному обращению во время рассечения, тем самым обеспечивая минимальное повреждение тканей при доступе к различным глазным слоям и при производстве цельных креплений. Кроме того, наличие третьего века помогает обнаружить и изучить локализованные вмешательства во время визуализации.

Процедура в нашей лаборатории была выполнена на штамме мыши CBA / J или rd1 на P28 любого пола. Процедура может быть выполнена на любом штамме, возрасте или поле животного и не имеет смещения в соответствии с этими характеристиками.

Животные были закуплены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержались в Центре мелких животных (SAF) в Национальном институте иммунологии (NII). Они содержались в индивидуальных вентилируемых клетках (IVC) и получали свободный доступ к подкисленной автоклавной воде и пище. Они поддерживались при температуре 21-23 °C и с циклом светлый/темный 14 ч / 10 ч.

Ниже приведен модифицированный хирургический метод микрорассечения мышиного глаза.

протокол

Эта процедура была одобрена Институциональным комитетом по этике животных Национального института иммунологии в Нью-Дели. Серийный номер официального утверждения - IAEC#480/18. Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных Министерства рыболовства, животноводства и молочного животноводства правительства Индии под наблюдением профессионального ветеринара SAF, NII.

1. Подготовка

1. Расширьте глаза грызунов, используя каплю 0,8% тропикамида и 5% офтальмологического раствора фенилэфрина в каждый глаз. Перед процедурой поместите животное в темное место на 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающее средство не требуется, так как животное усыпляется сразу после завершения 30 минут. Темная адаптация и расширение глаз животного позволяют наблюдателю проверить наличие глазных разрывов и повреждений перед процедурой. Кроме того, расширение полезно при работе с пигментированной тканью глазного яблока.
2. Усыпить животное путем внутрибрюшинного введения 5-кратной дозы анестезии. Типичная доза составляет 200 мкл PBS, содержащего 10 мг кетамина и 1 мг ксилазина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доза для эвтаназии животного составляет кетамин в дозе 400-500 мг / кг массы тела и ксилазин в дозе 50 мг / кг массы тела, вводимый внутрибрюшинно. Для типичной мыши весом 20 г доза будет составлять 200 мкл PBS, содержащего 10 мг кетамина (100 мкл исходного раствора 100 мг / мл кетамина) и 1 мг ксилазина (100 мкл исходного раствора 10 мг / мл ксилазина).
3. Подтвердите полное отсутствие реакции на раздражитель, исследуя педальный рефлекс. Отсутствие сердцебиения и дыхания также являются важными показателями.
4. Поместите мышь в боковое лежачее положение, чтобы обеспечить полный доступ к глазу.
5. Подготовьте к процедуре щипцы для наложения швов, изогнутые щипцы, микролезвие (размером 15°, 3 мм), пружинные микроножницы и угловые пружинные микроножницы.

2. Энуклеация глаза мыши вместе с третьим веком

1. Поместите мышь в боковое лежачее положение, чтобы обеспечить полный доступ к глазу. Откройте наружные веки щипцами, чтобы оптимально визуализировать третье веко.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Третье веко, также известное как мигательная мембрана, расположено по направлению к верхнему углу касательной носа (рис. 1А).
2. Определите третье веко как незначительный полупрозрачный выступ с пигментированной границей (рис. 1B).
3. Поместите изогнутые щипцы вокруг глазного яблока и зажмите, чтобы освободить глаз от посторонних прикреплений. Это сведет к минимуму кровотечение в глаз из окружающих тканей.
4. Замените изогнутые щипцы пружинными микроножницами и разрежьте вокруг глазного яблока с прикрепленным к нему третьим веком. Используйте небольшие непрерывные разрезы, чтобы освободить глазное яблоко от окружающих тканевых прикреплений.
5. Поместите изогнутые пружинные микроножницы под глазное яблоко, чтобы освободить глаз, перерезав зрительный нерв. Следите за тем, чтобы глазное яблоко полностью освободилось от глазницы.

3. Очистка от посторонних тканей

1. Поместите энуклеированный глаз от усыпленной мыши в чашку Петри с буфером с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) при pH 7,4, при этом чашка Петри заполнена таким образом, чтобы глазное яблоко было погружено в PBS.
2. Обездвижить энуклеированное глазное яблоко мыши с прикрепленным третьим веком одной рукой с помощью щипцов.
3. Подвешивайте глазное яблоко в жидкой среде, чтобы обеспечить более эффективное обращение. Некоторые экстраокулярные мышцы или ткани начнут отплывать от глазного яблока. Удалите их, отрезав от глазного яблока с помощью пружинных микроножниц.
4. Разрежьте и удалите зрительный нерв от основания глазного яблока с помощью микроножниц, чтобы обеспечить лучшее отделение сетчатки для цельных препаратов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять зрительный нерв для рассечения тканей.
5. Промойте глазное яблоко PBS и перенесите его в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл 4% параформальдегида (PFA), в течение как минимум 2 ч при 4 ° C для фиксации тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе процедуру можно приостановить, оставив ткань в PFA на срок до 12 часов при 4 °C. Однако для выделения живых клеток не следует выполнять этапы фиксации, а всю процедуру нужно выполнять без пауз.

4. Рассечение энуклеированного глаза для получения переднего и заднего наглазников

1. После фиксации PFA (если сбор живых клеток продолжается без фиксации глазного яблока), перенесите глазное яблоко в чашку Петри, содержащую PBS, и поместите его под препарирующий микроскоп для выполнения последующей процедуры.
2. Обездвижьте глазное яблоко, крепко удерживая третье веко щипцами для наложения швов Colibri.
3. Сделайте небольшой разрез на лимбе, проткнув его с помощью микролезвия. Лимб - это роговично-склеральное соединение. Делать надрез желательно напротив третьего века, тем самым делая точку доступа для пружинных микроножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микролезвия размером 15° и 3 мм может обеспечить лучший контроль над глубиной этого разреза.
4. Затем, используя этот разрез в качестве отправной точки, с помощью микроножниц сделайте небольшие и непрерывные надрезы по окружности роговицы-склерального лимба. Сначала сделайте полукруг разрезов, начиная от точки разреза до третьего века. Затем завершите оставшийся полукруг надрезов с другой стороны. Наконец, сделайте разрез вокруг третьего века, чтобы отделить заднюю чашечку и переднюю чашку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от интересующего наглазника, мигательная мембрана может быть оставлена прикрепленной либо к переднему, либо к заднему наглазнику.
5. Извлеките хрусталик из задней чашки с помощью щипцов, чтобы получить заднюю чашечку, состоящую из слоев нервной сетчатки и пигментного эпителия сетчатки (RPE). Таким образом, хрусталик, задняя чашка и передняя чашка глаза разделены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с нефиксированными тканями передняя и задняя чашечки теперь могут быть ферментативно переварены для получения одноклеточной суспензии роговицы или сетчатки.
6. Для фиксации тканей перенесите эти чашки в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл 4% PFA, в течение 12 часов при 4 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации ткань может быть помещена в соответствующую среду, а криосекция или парафиновая секция могут быть выполнены для получения срезов роговицы или сетчатки.

5. Выделение нейронных слоев сетчатки и РПЭ

1. Повторно введите заднюю чашку в чашку Петри, содержащую буфер PBS, чтобы погрузить ткань.
2. Проверьте наличие невральной сетчатки. Это можно визуализировать в виде непрозрачного слоя на пигментированном слое РПЭ, который прикреплен по периферической окружности чашки.
3. Удерживайте третье веко щипцами, чтобы обездвижить заднюю чашечку, и отклеивайте нервную сетчатку, начиная с периферии, с помощью второй пары щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется очень нежные и легкие движения руки, чтобы не повредить ткани. На выходе зрительного нерва изогнутые пружинные ножницы могут быть вставлены под нервную сетчатку, и можно сделать разрез, чтобы полностью освободить слои, если нервная сетчатка остается прикрепленной, как показано на рисунке 3. По желанию освободите или отсоедините сетчатку мягкими движениями с помощью мягкой щетки. Однако это было бы нецелесообразно делать, если собирают сетчатку для гистологии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, получают нервную сетчатку и пигментированный слой RPE с третьим веком.

6. Сегментация слоев сетчатки и СИЗО для цельных креплений

1. Повторно введите переднюю и заднюю чашки в чашку Петри, содержащую буфер PBS, и поместите чашку под препарирующий микроскоп.
2. Иммобилизуйте переднюю чашку, удерживая третье веко.
3. Используйте угловые пружинные микроножницы, чтобы сделать разрез около 3/4 диаметра наглазника рядом с третьим веком, разрезая периферию перпендикулярно оптическому центру.
4. Удерживайте третье веко и сделайте надрез рядом с первым срезом.
5. Сделайте аналогичный разрез между вторым срезом и третьим веком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Три или четыре таких равноудаленных разреза открывают полусферические чашечки в форме цветка, который падает плашмя и может быть легко установлен.
6. Иммобилизуйте заднюю чашку, удерживая третье веко.
7. Выполните те же действия, что и для разрезов (шаги 6.3-6.5) на передней чашке, чтобы сделать три или четыре равноудаленных разреза на задней чашке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для гистологии нервной сетчатки, выделенной на шаге 5, сделайте аналогичные разрезы, чтобы убедиться, что она падает плашмя на поверхность. Не делайте очень глубоких надрезов в центре чашки, так как это может привести к тому, что срезы листьев развалятся или легко отделятся.
8. Выполните окрашивание и смонтируйте ткани целиком для эффективной визуализации ^7,8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие мигательной мембраны действует как постоянный физический индикатор носовой стороны наглазника в целых креплениях. Это помогает разграничить дорсальную/вентральную сторону наглазника, так как третье веко наглазника указывает на носовую/вентральную ориентацию.

Результаты

Для изучения потенциального лимфатического ангиогенеза в ткани переднего / роговицы мышей rd1 был подготовлен целый массив ткани мыши/роговицы мышей в болезненном состоянии. Прикрепленная конъюнктивальная ткань от третьего века действовала как положительный контроль, так как в рогови...

Обсуждение

Было обнаружено, что микродиссекция глаза глаза является сложной задачей из-за небольшого размера и сферической формы глаза грызуна, а глаз грызуна требует инновационных методов для эффективного обращения⁸.

В демонстрируемом способе энуклеированное глазн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare;  India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
CBA/J inbred mice	The Jackson Laboratory	Stock No. 000654
Cefotaxime (Taxim)	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma ; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet)	Reckitt Benckiser , India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma ; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD ; US	REF 303060
Isoflurane ( Forane)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant