Microdisección del ojo de roedor

Resumen

Este artículo presenta un protocolo para la microdisección ocular en roedores. El proceso implica la enucleación del globo ocular junto con la membrana nictitante (es decir, el tercer párpado). Esto es seguido por la separación de las copas oculares posterior y anterior.

Resumen

La microdisección ocular del ojo de roedor implica la segmentación del globo ocular enucleado con la membrana nictitante adjunta, o tercer párpado, para obtener los oculares anterior y posterior. Con esta técnica, las subpartes del ojo, incluido el tejido corneal, el tejido neural, el tejido epitelial pigmentario de la retina (EPR) y la lente, se pueden obtener para montajes completos, criosección y / o suspensiones unicelulares de un tejido ocular específico. La presencia del tercer párpado presenta ventajas únicas y significativas, ya que beneficia el mantenimiento de la orientación del ojo, lo cual es importante para comprender la fisiología ocular después de cualquier intervención localizada o en estudios que involucran análisis oculares relacionados con la topografía espacial del ojo.

En este método, enucleamos el globo ocular en la cavidad junto con el tercer párpado cortando cuidadosa y lentamente los músculos extraoculares y cortando el nervio óptico. El globo ocular fue perforado a través del limbo corneal usando una microcuchilla. La incisión se utilizó como punto de entrada, lo que permitió cortar a lo largo de la unión córnea-escleral insertando microtijeras a través del punto de incisión. Se hicieron pequeños y continuos cortes a lo largo de la circunferencia hasta que las copas se separaron. Estos podrían diseccionarse aún más pelando suavemente la capa translúcida de la retina neural utilizando pinzas de sutura Colibrí para obtener las capas de retina neural y EPR. Además, se hicieron tres/cuatro cortes equidistantes desde la periferia perpendicularmente al centro óptico hasta que se alcanzó el nervio óptico. Esto abrió las copas hemisféricas en forma de florete para que cayeran planas y pudieran montarse fácilmente. Esta técnica se ha utilizado en nuestro laboratorio para montajes completos de córnea y secciones de retina. La presencia del tercer párpado delinea la orientación nasal-temporal, lo que permite el estudio de diversas intervenciones de terapia celular después del trasplante y, por lo tanto, la validación fisiológica dirigida vital para la visualización y la representación precisa en dichos estudios.

Introducción

La disección ocular es una técnica importante en la investigación oftalmológica y ha permitido a los investigadores acceder a los segmentos del ojo para estudios específicos. Anteriormente, los investigadores oculares se basaban en el tejido ocular de individuos enfermos para sus estudios. Sin embargo, el número progresivamente creciente de cepas de modelos de roedores oftálmicos¹ a lo largo de los años ha disminuido la necesidad de tejido ocular humano. Estas cepas de ratón han permitido una comprensión más profunda de las enfermedades oculares y las intervenciones. Sin embargo, también han generado la necesidad de técnicas innovadoras de microdisección ocular. El pequeño tamaño y el área limitada de operación limitan severamente el acceso efectivo a las subpartes oculares. Además, debido al ensamblaje celular homogéneo de los oculares posterior y anterior, es difícil realizar intervenciones específicas después de la disección. Las técnicas actuales de microdisección del láser² y la microdisección quirúrgica ^3,4 son inadecuadas para cumplir con tales requisitos de investigación ocular. La microdisección con láser es muy eficaz en el análisis de células individuales, pero el tejido específico debe ser microdiseccionado antes del procedimiento con láser². La técnica puede aislar pequeñas regiones de interés de un tejido prediseccionado para el análisis molecular. Por lo tanto, la técnica no es adecuada para preparar monturas enteras o para el aislamiento de capas oculares empaquetadas axialmente para una visualización óptima.

El método quirúrgico es la técnica más utilizada; Este método consiste en inmovilizar el ojo a través del nervio óptico⁵ y luego realizar la disección. Esta práctica es ardua y puede dañar cualquier tejido frágil, ya que el ojo esférico continúa moviéndose durante la disección. A pesar de ser beneficiosa para aislar las diversas secciones de las capas de la retina, la técnica no puede demarcar la orientación espacial del tejido en la disección.

Durante la disección, mantener la presencia de la membrana nictitante adherida o del tercer párpado (Figura 1) presenta ventajas únicas y significativas. En este método, primero, el globo ocular se enuclea con el tercer párpado. Luego, el tercer párpado se utiliza para inmovilizar el ojo⁶ (Figura 2A). Esto es seguido por la perforación del globo ocular a través del limbo corneal y el uso de la incisión como punto de entrada (Figura 2B, C). Luego, los oculares se separan cortando a lo largo de la circunferencia anterior y posterior (Figura 2D-G). Al diseccionar aún más el ocular posterior, la capa translúcida de la retina neural se puede identificar y despegar suavemente. Luego se realizan tres o cuatro cortes equidistantes en las copas hemisféricas anteriores y posteriores obtenidas, que permiten que estas copas en forma de flor caigan planas sobre un portaobjetos (Figura 2H).

El tercer párpado ayuda a un manejo fácil y eficiente durante la disección, asegurando así un daño mínimo al tejido mientras se accede a las diversas capas oculares y al producir montajes completos. Además, la presencia del tercer párpado ayuda a localizar y examinar intervenciones localizadas durante la visualización.

El procedimiento, en nuestro laboratorio, se ha realizado en una cepa de ratón CBA / J o rd1 en P28 de cualquier sexo. El procedimiento se puede realizar en cualquier cepa, edad o sexo del animal y no tiene sesgo de acuerdo con estas características.

Los animales fueron adquiridos de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales) y mantenidos en la Instalación de Animales Pequeños (SAF) en el Instituto Nacional de Inmunología (NII). Se mantuvieron en jaulas ventiladas individuales (IVC) y recibieron acceso ad libitum a agua y alimentos acidificados en autoclave. Se mantuvieron a 21-23 °C y con un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h.

A continuación se muestra un método quirúrgico modificado para la microdisección de un ojo de ratón.

Protocolo

Este procedimiento fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal del Instituto Nacional de Inmunología de Nueva Delhi. El número de referencia de serie de la aprobación es IAEC#480/18. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices reglamentarias del Comité de Control y Supervisión de Experimentos con Animales, Ministerio de Pesca, Ganadería y Lechería, Gobierno de la India, bajo la supervisión de un veterinario profesional en el SAF, NII.

1. Preparación

1. Dilate los ojos de roedores con una gota de tropicamida al 0,8% y soluciones oftálmicas de fenilefrina al 5% en cada ojo. Coloque al animal en un área oscura durante 30 minutos antes del procedimiento.
   NOTA: No se requiere un analgésico ya que el animal es sacrificado inmediatamente después de completar los 30 minutos. La adaptación a la oscuridad y la dilatación de los ojos del animal permiten al observador verificar si hay desgarros oculares y daños antes del procedimiento. Además, la dilatación es ventajosa mientras se trabaja con el tejido pigmentado del globo ocular.
2. Eutanasia al animal administrando por vía intraperitoneal una dosis 5x de anestesia. Una dosis típica es de 200 μL de PBS que contiene 10 mg de ketamina y 1 mg de xilazina.
   NOTA: La dosis para la eutanasia del animal es ketamina a 400-500 mg/kg de peso corporal y xilazina a 50 mg/kg de peso corporal administrada por vía intraperitoneal. Para un ratón típico que pesa 20 g, la dosis sería de 200 μL de PBS que contiene 10 mg de ketamina (100 μL de una solución madre de 100 mg/ml de ketamina) y 1 mg de xilazina (100 μL de una solución madre de 10 mg/ml de xilazina).
3. Confirme la falta total de respuesta a un estímulo examinando el reflejo del pedal. La ausencia de latidos cardíacos y la respiración también son indicadores importantes.
4. Coloque el ratón en reclinación lateral para permitir el acceso completo al ojo.
5. Prepare pinzas de sutura Colibrí, pinzas curvas, una microcuchilla (15°, 3 mm de tamaño), microtijeras de resorte y microtijeras de resorte en ángulo listas para el procedimiento.

2. Enucleación del ojo del ratón junto con el tercer párpado

1. Coloque el ratón en reclinación lateral para permitir el acceso completo al ojo. Abra los párpados externos con los fórceps para visualizar de manera óptima el tercer párpado.
   NOTA: El tercer párpado, también conocido como membrana nictitante, se encuentra hacia la esquina superior de la tangente nasal (Figura 1A).
2. Identifique el tercer párpado como una protuberancia translúcida menor con un límite pigmentado (Figura 1B).
3. Coloque pinzas curvas alrededor del globo ocular y pellizque para liberar el ojo de accesorios extraños. Esto minimizará el sangrado en el ojo desde el tejido circundante.
4. Reemplace las pinzas curvas con microtijeras de resorte y corte alrededor del globo ocular con el tercer párpado unido a él. Use pequeños cortes continuos para liberar el globo ocular de los accesorios de tejido circundante.
5. Coloque microtijeras de resorte curvas debajo del globo ocular para liberar el ojo cortando el nervio óptico. Asegúrese de que el globo ocular esté completamente liberado de la cuenca del ojo.

3. Limpiar el tejido extraño

1. Coloque el ojo enucleado del ratón sacrificado en una placa de Petri con tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7.4, con la placa de Petri llena de tal manera que el globo ocular se sumerja en PBS.
2. Inmovilice el globo ocular enucleado del ratón con el tercer párpado adjunto con una mano usando fórceps.
3. Suspenda el globo ocular en medio líquido para permitir un manejo más eficiente. Algunos músculos o tejidos extraoculares comenzarán a flotar lejos del globo ocular. Retírelos cortándolos del globo ocular con microtijeras de resorte.
4. Corte y retire el nervio óptico de la base del globo ocular con microtijeras para permitir una mejor separación de la retina para preparaciones de montaje completo.
   NOTA: No es necesario extirpar el nervio óptico para la sección del tejido.
5. Lave el globo ocular con PBS y transfiéralo a un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% durante un mínimo de 2 h a 4 °C para la fijación del tejido.
   NOTA: El procedimiento se puede pausar en este paso dejando el tejido en PFA durante un máximo de 12 h a 4 °C. Sin embargo, para el aislamiento de células vivas, no se deben realizar los pasos de fijación y todo el procedimiento debe realizarse sin pausas.

4. Disección del ojo enucleado para obtener los oculares anterior y posterior

1. Después de la fijación de PFA (si se recogen células vivas, proceda sin la fijación del globo ocular), transfiera el globo ocular a una placa de Petri que contenga PBS y colóquelo bajo un microscopio de disección para realizar el procedimiento posterior.
2. Inmovilice el globo ocular manteniendo presionado firmemente el tercer párpado con pinzas de sutura Colibrí.
3. Haga una pequeña incisión en el limbo perforándolo con una microcuchilla. El limbo es la unión corneal-escleral. Haga la incisión preferiblemente opuesta al tercer párpado, haciendo así un punto de acceso para las microtijeras de resorte.
   NOTA: El uso de una microcuchilla de 15° y 3 mm de tamaño puede proporcionar un mejor control sobre la profundidad de esta incisión.
4. A continuación, utilizando esta incisión como punto de partida, con un par de microtijeras, realice cortes pequeños y continuos a lo largo de la circunferencia del limbo corneal-escleral. Primero, complete un semicírculo de cortes comenzando desde el punto de incisión hasta el tercer párpado. Luego, complete el semicírculo restante de cortes en el otro lado. Finalmente, haga un corte alrededor del tercer párpado para separar la copa posterior y la copa anterior.
   NOTA: Dependiendo del ocular de interés, la membrana nictitante se puede dejar unida al ocular anterior o posterior.
5. Retire el cristalino de la copa posterior con fórceps para obtener la copa posterior que comprende las capas de retina neural y epitelio pigmentario de la retina (EPR). El cristalino, la copa posterior y la copa anterior del ojo están, por lo tanto, separadas.
   NOTA: Si se trabaja con tejidos no fijados, las copas anterior y posterior ahora se pueden digerir enzimáticamente para obtener una suspensión unicelular corneal o retiniana.
6. Para fijar los tejidos, transfiera estas copas a un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de PFA al 4% durante 12 h a 4 °C.
   NOTA: Después de la fijación, el tejido se puede incrustar en un medio apropiado, y se puede realizar una criosección o una sección de parafina para obtener secciones corneales o retinianas.

5. Aislamiento de las capas neurales de la retina y del EPR

1. Reintroduzca la copa posterior en la placa de Petri que contiene tampón PBS para sumergir el tejido.
2. Compruebe la presencia de la retina neural. Esto se puede visualizar como una capa opaca en la capa de EPR pigmentada, que está unida a la circunferencia periférica de la copa.
3. Sostenga el tercer párpado con fórceps para inmovilizar la copa posterior y despegue la retina neural comenzando desde la periferia con un segundo par de fórceps.
   NOTA: Se recomiendan movimientos muy suaves y ligeros de la mano para no dañar el tejido. En la salida del nervio óptico, las tijeras de resorte curvadas se pueden insertar debajo de la retina neural, y se puede hacer un corte para liberar completamente las capas si la retina neural permanece unida como se muestra en la Figura 3. Opcionalmente, libere o desprenda la retina con movimientos suaves utilizando un cepillo suave. Sin embargo, no sería apropiado hacerlo si se recolecta la retina para histología.
   NOTA: La retina neural y la capa pigmentada de EPR con el tercer párpado son, por lo tanto, obtenidos.

6. Segmentación de capas retinianas y RPE para montajes enteros

1. Vuelva a introducir las copas anterior y posterior en la placa de Petri que contiene tampón PBS y coloque la placa bajo el microscopio de disección.
2. Inmovilice la copa anterior manteniendo presionado el tercer párpado.
3. Use microtijeras de resorte en ángulo para hacer un corte de alrededor de 3/4 del diámetro del ocular junto al tercer párpado, cortando desde la periferia perpendicularmente hacia el centro óptico.
4. Mantenga un agarre en el tercer párpado y haga un corte junto al primer corte.
5. Haga un corte similar entre el segundo corte y el tercer párpado.
   NOTA: Tres o cuatro de estos cortes equidistantes abren las copas hemisféricas en forma de flor, que cae plana y se puede montar fácilmente.
6. Inmoviliza la copa posterior manteniendo presionado el tercer párpado.
7. Siga los mismos pasos que se indican para hacer los cortes (pasos 6.3-6.5) en la copa anterior para hacer tres o cuatro cortes equidistantes en la copa posterior.
   NOTA: Para la histología de la retina neural aislada en el paso 5, haga cortes similares para asegurarse de que caiga plana sobre una superficie. No haga cortes muy profundos en el centro de la copa, ya que esto puede hacer que las secciones de las hojas se deshagan o se separen fácilmente.
8. Realizar la tinción y montar completamente los tejidos para una visualización efectiva ^7,8.
   NOTA: La presencia de la membrana nictitante actúa como un indicador físico constante del lado nasal del ocular en montes enteros. Ayuda a demarcar el lado dorsal / ventral del ocular, ya que el tercer párpado del ocular indica la orientación nasal / ventral.

Resultados

Se preparó un conjunto de tejido ocular/corneal de ratón rd1 para estudiar la posible angiogénesis linfática en el tejido anterior/corneal en un estado enfermo. El tejido conjuntival unido desde el tercer párpado actuó como un control positivo, ya que la córnea carece de vasos linfáticos. Para el estudio, el tejido corneal se diseccionó con la conjuntiva y se fijó con PFA al 4%, seguido de permeabilización y bloqueo. Luego, el tejido fue teñido con un anticuerpo primario contra el marcador endotelial linfáti...

Discusión

Se ha encontrado que la microdisección ocular es una tarea difícil debido al pequeño tamaño y la forma esférica del ojo del roedor, y el ojo del roedor requiere técnicas innovadoras para un manejo eficiente⁸.

En el método demostrado actual, el globo ocular de ratón enucleado se obtiene con el tercer párpado unido para un manejo efectivo y fácil. Usando el tercer párpado, el globo ocular se puede inmovilizar por completo, lo que permite que la disección proc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare;  India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
CBA/J inbred mice	The Jackson Laboratory	Stock No. 000654
Cefotaxime (Taxim)	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma ; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet)	Reckitt Benckiser , India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma ; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD ; US	REF 303060
Isoflurane ( Forane)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant