מיקרודיסקציה של עין המכרסם

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.

Abstract

המיקרו-דיסקציה העינית של עין המכרסם כוללת פילוח של גלגל העין המצוי עם הממברנה המצורפת, או העפעף השלישי, כדי להשיג את המשקפיים הקדמיים והאחוריים. בטכניקה זו, ניתן להשיג את חלקי המשנה של העין, כולל רקמת הקרנית, הרקמה העצבית, רקמת אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והעדשה, עבור סיטומות, חתך קריו, ו / או מתלים חד תאי של רקמת עין ספציפית. נוכחותו של העפעף השלישי טומנת בחובה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים, שכן היא מועילה לשמירה על כיוון העין, החשוב להבנת הפיזיולוגיה של העין לאחר התערבות מקומית כלשהי או במחקרים הכוללים אנליזה עינית הנוגעת לטופוגרפיה המרחבית של העין.

בשיטה זו חינכנו את גלגל העין בשקע יחד עם העפעף השלישי על ידי חיתוך זהיר ואיטי של השרירים החוץ-עיניים וקטיעת עצב הראייה. גלגל העין נוקב דרך לימבוס הקרנית באמצעות מיקרובלייד. החתך שימש כנקודת הכניסה, ואיפשר חיתוך לאורך צומת הקרנית-סקלרלית על ידי החדרת מיקרו-מספריים דרך נקודת החתך. חתכים קטנים ורצופים לאורך ההיקף נעשו עד שהכוסות נפרדו. ניתן לנתח אותם עוד יותר על ידי קילוף עדין של השכבה השקופה של הרשתית העצבית באמצעות מלקחיים לתפירת קוליברי כדי להשיג את שכבות הרשתית העצבית וה- RPE. יתר על כן, שלושה/ארבעה חתכים במרחקים שווים נעשו מהפריפריה בניצב למרכז הראייה עד להגעה לעצב הראייה. פעולה זו פתחה את הגביעים ההמיספריים לצורת פרח כך שהם נפלו שטוחים וניתן היה להרכיב אותם בקלות. טכניקה זו שימשה במעבדה שלנו עבור wholemounts הקרנית וקטעי הרשתית. נוכחותו של העפעף השלישי מסמנת את האוריינטציה האף-טמפורלית, המאפשרת לימוד התערבויות שונות של תרפיה תאית לאחר ההשתלה, ומכאן התיקוף הפיזיולוגי הממוקד החיוני להדמיה ולייצוג מדויק במחקרים כאלה.

Introduction

דיסקציה עינית היא טכניקה חשובה במחקר העיניים ואפשרה לחוקרים לגשת למקטעי העין למחקרים ממוקדים. בעבר, חוקרי עיניים הסתמכו על רקמת העין של אנשים חולים עבור המחקרים שלהם. עם זאת, המספר ההולך וגדל של זנים של מודלים מכרסמים אופתלמיים¹ לאורך השנים הפחית את הצורך ברקמת עין אנושית. זני עכברים אלה אפשרו הבנה עמוקה יותר של מחלות עיניים והתערבויות. עם זאת, הם גם יצרו צורך בטכניקות חדשניות של מיקרו-דיסקציה עינית. הגודל הקטן ושטח הפעולה המוגבל מגבילים מאוד את הגישה היעילה לחלקי העין. יתר על כן, בשל הרכבה תאית הומוגנית של המשקפיים האחוריים והקדמיים, קשה לבצע התערבויות ממוקדות לאחר דיסקציה. טכניקות המיקרו-דיסקציה הנוכחיות של לייזר² ומיקרודיסקציה כירורגית ^3,4 אינן מספקות בעמידה בדרישות כאלה של מחקר עיני. מיקרו-דיסקציה בלייזר יעילה מאוד באנליזה של תא בודד, אך יש לנתח את הרקמה הספציפית לפני הליך הלייזר². הטכניקה יכולה לבודד אזורים קטנים של עניין מרקמה שנותחה מראש לצורך אנליזה מולקולרית. לפיכך, הטכניקה אינה מתאימה להכנת wholemounts או לבידוד של שכבות עיניים ארוזות אקסיאלית עבור הדמיה אופטימלית.

השיטה הכירורגית היא הטכניקה הנפוצה ביותר; שיטה זו כוללת השתקת העין דרך עצב הראייה⁵ ולאחר מכן ביצוע הדיסקציה. תרגול זה הוא מפרך ויכול לפגוע בכל רקמה שברירית, כמו העין הכדורית ממשיכה לנוע במהלך דיסקציה. למרות היותה מועילה לבידוד החלקים השונים של שכבות הרשתית, הטכניקה אינה יכולה לתחום את הכיוון המרחבי של הרקמה בעת הדיסקציה.

במהלך הדיסקציה, שמירה על נוכחות הממברנה המחוברת או העפעף השלישי (איור 1) מציגה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים. בשיטה זו, ראשית, גלגל העין הוא enucleated עם העפעף השלישי. לאחר מכן, העפעף השלישי משמש לשיתוק העין⁶ (איור 2A). לאחר מכן חודרים את גלגל העין דרך לימבוס הקרנית ומשתמשים בחתך כנקודת הכניסה (איור 2B,C). לאחר מכן, המשקפיים מופרדים על-ידי חיתוך לאורך ההיקף הקדמי והאחורי (איור 2D-G). על ידי ניתוח נוסף של העין האחורית, ניתן לזהות את השכבה השקופה של הרשתית העצבית ולקלף אותה בעדינות. לאחר מכן שלושה או ארבעה חתכים במרחקים שווים בגביעים הקדמיים והאחוריים המתקבלים, אשר מאפשרים לגביעים בצורת פרח ליפול שטוחים על מגלשה (איור 2H).

העפעף השלישי מסייע לטיפול קל ויעיל במהלך הדיסקציה, ובכך מבטיח נזק מינימלי לרקמה בעת גישה לשכבות העין השונות ובעת ייצור שלמים. יתר על כן, נוכחותו של העפעף השלישי מסייעת לאתר ולבחון התערבויות מקומיות במהלך הדמיה.

ההליך, במעבדה שלנו, בוצע על CBA/J או זן עכבר rd1 ב P28 מכל מין. ההליך יכול להתבצע על כל זן, גיל או מין של בעל חיים ואין לו הטיה על פי מאפיינים אלה.

בעלי החיים נרכשו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) ותוחזקו במתקן לחיות קטנות (SAF) במכון הלאומי לאימונולוגיה (NII). הם הוחזקו בכלובים מאווררים נפרדים (IVC) וקיבלו גישה אד ליביטום , למים ומזון חומציים. הם נשמרו ב 21-23 ° C ועם מחזור אור / חושך של 14 שעות / 10 שעות.

להלן שיטה כירורגית שונה למיקרו-דיסקציה של עין עכבר.

Protocol

הליך זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים של המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. מספר האסמכתא הסידורי של האישור הוא IAEC#480/18. הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הרגולציה של הוועדה לבקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים, משרד הדיג, גידול בעלי חיים וחלב, ממשלת הודו, בפיקוח וטרינר מקצועי ב-SAF, הביטוח הלאומי.

1. הכנה

1. להרחיב את העיניים מכרסם באמצעות טיפה של 0.8% tropicamide ו 5% phenylephrine פתרונות אופתלמיים בכל עין. הניחו את בעל החיים באזור חשוך למשך 30 דקות לפני ההליך.
   הערה: משכך כאבים אינו נדרש מכיוון שבעל החיים מורדם מיד לאחר השלמת 30 דקות. ההסתגלות הכהה והרחבת עיני החיה מאפשרות למתבונן לבדוק קרעים ונזקים בעין לפני ההליך. בנוסף, הרחבה היא יתרון בעת עבודה עם רקמת גלגל העין פיגמנט.
2. המתת חסד את החיה על ידי מתן intraperitoneally מנה 5x של הרדמה. מינון טיפוסי הוא 200 μL של PBS המכיל 10 מ"ג קטמין ו 1 מ"ג של xylazine.
   הערה: המינון להמתת חסד של בעל החיים הוא קטמין במשקל גוף של 400-500 מ"ג/ק"ג וקסילזין במשקל גוף של 50 מ"ג/ק"ג הניתן תוך צפקית. עבור עכבר טיפוסי השוקל 20 גרם, המינון יהיה 200 μL של PBS המכיל 10 מ"ג קטמין (100 μL של תמיסת מלאי של 100 מ"ג / מ"ל קטמין) ו 1 מ"ג של xylazine (100 μL של תמיסת מלאי של 10 מ"ג / מ"ל xylazine).
3. אשר את חוסר התגובה המוחלט לגירוי על ידי בחינת רפלקס הדוושה. היעדר פעימות לב ונשימה הם גם אינדיקטורים חשובים.
4. הניחו את העכבר בשכיבה צידית כדי לאפשר גישה מלאה לעין.
5. הכינו מלקחיים לתפירת קוליברי, מלקחיים מעוקלים, מיקרו-להב (גודל 15°, 3 מ"מ), מיקרו-מספריים קפיציים ומיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים מוכנים להליך.

2. חינוך עין העכבר יחד עם העפעף השלישי

1. הניחו את העכבר בשכיבה צידית כדי לאפשר גישה מלאה לעין. פתח את העפעפיים החיצוניים עם המלקחיים כדי לדמיין בצורה אופטימלית את העפעף השלישי.
   הערה: העפעף השלישי, הידוע גם בשם הממברנה הניקטיבית, ממוקם לכיוון הפינה העליונה של משיק האף (איור 1A).
2. זהו את העפעף השלישי כבליטה שקופה מינורית עם גבול פיגמנטי (איור 1B).
3. מניחים מלקחיים מעוקלים סביב גלגל העין, וצובטים כדי לשחרר את העין מחיבורים חיצוניים. זה ימזער דימום לתוך העין מן הרקמה שמסביב.
4. החליפו את המלקחיים המעוקלים במיקרו-מספריים קפיציים, וחתכו סביב גלגל העין כשהעפעף השלישי מחובר אליו. השתמש חתכים רציפים קטנים כדי לשחרר את גלגל העין מן הרקמות שמסביב.
5. הניחו מיקרו-מספריים קפיציים מעוקלים מתחת לגלגל העין כדי לשחרר את העין על ידי חיתוך עצב הראייה. ודא כי גלגל העין משוחרר לחלוטין מארובות העין.

3. ניקוי הרקמה החיצונית

1. הניחו את העין המוחדרת מהעכבר המורדם בצלוחית פטרי עם חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS) ב-pH 7.4, כאשר צלחת הפטרי מלאה כך שגלגל העין שקוע ב-PBS.
2. לשתק את גלגל העין של העכבר עם העפעף השלישי המחובר ביד אחת באמצעות מלקחיים.
3. השהה את גלגל העין בתווך נוזלי כדי לאפשר טיפול יעיל יותר. חלק מהשרירים או הרקמות החוץ-עיניות יתחילו לצוף הרחק מגלגל העין. הסר אותם על ידי חיתוך אותם גלגל העין באמצעות מיקרו מספריים קפיץ.
4. גזור והסר את עצב הראייה מבסיס גלגל העין באמצעות מיקרו-מספריים כדי לאפשר הפרדה טובה יותר של הרשתית לתכשירים שלמים.
   הערה: אין צורך להסיר את עצב הראייה עבור חתך רקמות.
5. שטפו את גלגל העין עם PBS, והעבירו אותו לצינור של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך שעתיים לפחות ב-4°C לצורך קיבוע רקמות.
   הערה: ניתן להשהות את ההליך בשלב זה על ידי השארת הרקמה ב- PFA למשך עד 12 שעות ב- 4 °C. עם זאת, עבור בידוד של תאים חיים, שלבי הקיבוע לא צריך להתבצע, ואת ההליך כולו צריך להתבצע ללא הפסקות.

4. דיסקציה של העין המושמעת לקבלת המשקפיים הקדמיים והאחוריים

1. לאחר קיבוע PFA (אם אוספים תאים חיים, להמשיך ללא קיבוע של גלגל העין), להעביר את גלגל העין לתוך צלחת פטרי המכילה PBS, ומניחים אותו תחת מיקרוסקופ לנתח כדי לבצע את ההליך הבא.
2. לשתק את גלגל העין על ידי החזקת העפעף השלישי בחוזקה עם מלקחיים תופרים קוליברי.
3. בצע חתך קטן בלימבוס על ידי פירסינג באמצעות מיקרו-להב. הלימבוס הוא צומת הקרנית-סקלרלית. בצע את החתך רצוי מול העפעף השלישי, ובכך ליצור נקודת גישה עבור מיקרו מספריים קפיץ.
   הערה: שימוש במיקרו-להב בגודל 15° ו-3 מ"מ עשוי לספק שליטה טובה יותר על עומק חתך זה.
4. לאחר מכן, באמצעות חתך זה כנקודת התחלה, עם זוג מספריים מיקרו, לבצע חתכים קטנים ורציפים לאורך היקף הלימבוס הקרנית-סקלרלית. ראשית, השלימו חצי עיגול של חתכים החל מנקודת החתך ועד לעפעף השלישי. לאחר מכן, להשלים את חצי עיגול החתכים הנותר בצד השני. לבסוף, בצע חתך סביב העפעף השלישי כדי להפריד את הגביע האחורי ואת הגביע הקדמי.
   הערה: בהתאם לעיני המעניין, ניתן להשאיר את הממברנה המניקה מחוברת לעין הקדמית או האחורית.
5. הסר את העדשה מהגביע האחורי באמצעות מלקחיים כדי לקבל את הגביע האחורי המורכב משכבות הרשתית העצבית ואפיתל פיגמנט הרשתית (RPE). העדשה, הגביע האחורי והגביע הקדמי של העין מופרדים, אם כן.
   הערה: אם עובדים עם רקמות לא מקובעות, כעת ניתן לעכל אנזימטית את הגביעים הקדמיים והאחוריים כדי לקבל תרחיף חד תאי של הקרנית או הרשתית.
6. לקיבוע הרקמות, להעביר כוסות אלה לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% PFA במשך 12 שעות ב 4 ° C.
   הערה: לאחר הקיבוע, ניתן להטמיע את הרקמה בתווך מתאים, וניתן לבצע חתך קריו-חתך או פרפין כדי להשיג חתכי קרנית או רשתית.

5. בידוד של הרשתית העצבית ושכבות RPE

1. הכניסו מחדש את הכוס האחורית לצלחת הפטרי המכילה חיץ PBS כדי להטביע את הרקמה.
2. בדוק את נוכחותה של הרשתית העצבית. ניתן לדמיין זאת כשכבה אטומה על שכבת RPE פיגמנטית, המחוברת בהיקף ההיקפי של הכוס.
3. החזיקו את העפעף השלישי במלקחיים כדי לשתק את הכוס האחורית, וקילפו את הרשתית העצבית החל מהפריפריה באמצעות זוג מלקחיים שני.
   הערה: תנועות עדינות וקלות מאוד של היד מומלצות מאוד על מנת לא לפגוע ברקמה. ביציאה של עצב הראייה, ניתן להחדיר את מספריים הקפיץ המעוקלים מתחת לרשתית העצבית, ולבצע חתך כדי לשחרר לחלוטין את השכבות אם הרשתית העצבית נשארת מחוברת כפי שמתואר באיור 3. לחלופין, שחררו או נתקו את הרשתית במשיכות עדינות באמצעות מברשת רכה. עם זאת, זה לא יהיה מתאים לעשות זאת אם איסוף הרשתית עבור היסטולוגיה.
   הערה: הרשתית העצבית ושכבת RPE פיגמנטית עם העפעף השלישי מתקבלים, אם כן.

6. פילוח שכבות רשתית ו-RPE לסיטונים

1. הכניסו מחדש את הכוסות הקדמיות והאחוריות לצלחת הפטרי המכילה חיץ PBS, והניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ המנתח.
2. לשתק את הכוס הקדמית על ידי החזקת העפעף השלישי.
3. השתמשו במיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים כדי לבצע חתך של כ-3/4 מקוטר העין ליד העפעף השלישי, תוך חיתוך מהפריפריה בניצב לכיוון מרכז הראייה.
4. שמרו על אחיזה בעפעף השלישי, ובצעו חתך ליד החתך הראשון.
5. בצע חתך דומה בין החתך השני לעפעף השלישי.
   הערה: שלושה או ארבעה חתכים כאלה במרחקים שווים פותחים את הגביעים המיספריים לצורת פרח, אשר נופל שטוח וניתן להרכיב אותו בקלות.
6. יש לשתק את הכוס האחורית על ידי החזקת העפעף השלישי.
7. בצע את אותם השלבים שניתנו לביצוע החתכים (שלבים 6.3-6.5) על הכוס הקדמית כדי לבצע שלושה או ארבעה חתכים במרחקים שווים על הכוס האחורית.
   הערה: עבור ההיסטולוגיה של הרשתית העצבית המבודדת בשלב 5, בצע חתכים דומים כדי להבטיח שהיא תיפול שטוחה על משטח. אין לבצע חתכים עמוקים מאוד במרכז הכוס, שכן הדבר עלול לגרום לחלקי העלה להתפרק או להיפרד בקלות.
8. בצע את הצביעה, ואת כל הרקמות עבור הדמיה יעילה ^7,8.
   הערה: נוכחותו של הממברנה המניקה פועלת כאינדיקטור פיזי קבוע של צד האף של העין בשלמות. זה עוזר לתחום את הצד הגבי/גחוני של העין, שכן העפעף השלישי של העין מציין את כיוון האף/הגחון.

תוצאות

רקמת עין/קרנית עכבר RD1 הוכנה כדי לחקור אנגיוגנזה לימפוגרפית פוטנציאלית ברקמה הקדמית/הקרנית במצב חולה. רקמת הלחמית המחוברת מהעפעף השלישי פעלה כבקרה חיובית, שכן הקרנית חסרה כלי לימפה. לצורך המחקר, רקמת הקרנית נותחה עם הלחמית ותוקנה עם 4% PFA, ולאחר מכן חלחול וחסימה. לאחר מכן הרקמה הוכתמה בנוגדן...

Discussion

מיקרודיסקציה של העין נמצאה כמשימה קשה בשל גודלה הקטן וצורתה הכדורית של עין המכרסם, ועין המכרסם דורשת טכניקות חדשניות לטיפול יעיל⁸.

בשיטה המודגמת הנוכחית, גלגל העין של העכבר מתקבל עם העפעף השלישי מחובר לטיפול יעיל וקל. באמצעות העפעף השלישי, גלגל העין יכול להיות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare;  India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
CBA/J inbred mice	The Jackson Laboratory	Stock No. 000654
Cefotaxime (Taxim)	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma ; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet)	Reckitt Benckiser , India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma ; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD ; US	REF 303060
Isoflurane ( Forane)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty ; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant