القناة الصفراوية خارج الكبد وتسلخ المرارة في حديثي الولادة في الفأر البالغ من العمر تسعة أيام

Summary

لمراقبة اضطرابات القناة الصفراوية الوليدية للفئران ، يلزم وجود قناة صفراوية سليمة وإعداد فعال. لذلك ، تم تطوير نهج جديد لعزل نظام القناة الصفراوية خارج الكبد بالكامل في حديثي الولادة الفئران بنجاح مع الحفاظ على سلامة القناة الصفراوية.

Abstract

تم وصف تشريح القنوات الصفراوية لحديثي الولادة في الفئران بأنه صعب. الهدف الرئيسي من إجراء التشغيل القياسي الموصوف هو عزل القناة الصفراوية خارج الكبد (EBD) في حديثي الولادة في الفئران دون الإضرار بالقناة الصفراوية أثناء التحضير. نظرا لإعداده الوثيق بشكل استثنائي مقارنة بخط خلايا الخلايا الصفراوية وحصاد نظام القناة الصفراوية خارج الكبد بأكمله (EBDS) ، فإن النهج الموصوف مفيد للغاية في البحث عن النماذج الحيوانية لاضطرابات القناة الصفراوية لحديثي الولادة ، مثل رتق القناة الصفراوية. بعد القتل الرحيم ، تم الوصول إلى التجويف البريتوني ، وتم استخراج نظام القناة الصفراوية والاثني عشر والكبد باستخدام استئصال En-bloc-Resection الفريد (EbR). يتم وضع العينة المستخرجة على حصيرة رغوية ، ويتم تشريح EBD من الخلايا الملوثة بشكل غير مؤلم دون اللمس اللازم. يعد تشريح EBDS بالكامل ميزة مهمة لهذه الطريقة. يجب توخي الحذر بسبب صغر حجم وكمية أنسجة القناة الصفراوية. باستخدام التقنية الموصوفة ، لا يوجد أي ضرر للخلايا الصفراوية. علاوة على ذلك ، فإن نقاء التقنية قابل للتكرار (n = 10). لذلك ، يمكن حصاد عينات قابلة للمقارنة على النحو الأمثل. علاوة على ذلك ، لا تتضرر أنسجة القناة الصفراوية ، لأنه يمكن تجنب أي اتصال مع نظام القناة الصفراوية أثناء التحضير ، وترك السائل الصفراوي داخل المرارة. الأهم من ذلك ، أثناء إجراء تشريح المرارة والقناة الصفراوية النهائي ، تم استخدام الأدوات الدقيقة غير الرضحية فقط بشكل جانبي قليلا من القناة الصفراوية دون الضغط عليها. هذا هو المفتاح لعينة نظيفة وسليمة ، وضروري لمزيد من التحقيق النسيجي أو عزل الخلايا الصفراوية. للتلخيص ، تمكن تقنية التشريح المبتكرة الموصوفة المشغلين عديمي الخبرة بشكل خاص من المعدات اللازمة لعزل EBDS بشكل نظيف قدر الإمكان.

Introduction

نشأة وتطور اعتلال الأقنية الصفراوية مثل رتق القناة الصفراوية والتهاب الأقنية الصفراوية المصلب الأولي (PSC) والتهاب الأقنية الصفراوية الأولي (PBC) إما غير معروف أو غير مكتمل ^1,2. يؤدي الفهم المحدود لأصل هذه الأمراض وتطورها إلى ندرة خيارات العلاج³. أصعب عقبة في دراسة اضطرابات القناة الصفراوية الوليدية هي اكتساب فهم جزيئي للفيزيولوجيا المرضية. أحد المفاتيح الأساسية لفهم أفضل لعلم الأمراض الجزيئي هو أفضل ملاحظة ممكنة للأنسجة المصابة. لتجنب انخفاض قابلية المقارنة والتناقضات بين الأبحاث ، مثل مراقبة المسببات الفيروسية المحتملة لرتق القناة الصفراوية⁴ ، تنشأ الحاجة إلى أفضل إعداد ممكن ومشاركة تقنيات التشريح التي يتم إجراؤها. يعد التحضير النقي للأنسجة المستهدفة ضروريا لإجراء تحقيقات مجهرية لاحقة أو تربية الثقافات العضوية الخلوية و 3D. ومع ذلك ، في اضطرابات حديثي الولادة الفئران ، تكون عينات الأنسجة نادرة ولا تحدث إلا بكمية صغيرة بسبب صغر حجمها. فيما يتعلق باضطرابات القناة الصفراوية ، تم وصف الصعوبات في التحضير النظيف للقنوات الصفراوية في حديثي الولادة الفئران⁵. نظرا لمرحلة تطور حديثي الولادة ، فإن تمايز الأنسجة ليس متقدما بشكل مفرط ، مما يعقد التحضير ويزيد من الصعوبة مقارنة بإعداد عينات البالغين. لذلك ، قامت مجموعة العمل التشغيلية بالتحقيق في استراتيجية جديدة لإعداد EBDS في نموذج فأر حديثي الولادة. في هذه الدراسة ، تسمح التقنية بتشريح فعال لكل عينة.

يتم وضع نظام القناة الصفراوية داخل الصفاق في الجزء العلوي الأيمن من البطن ، الناشئة عن الكبد. تقع المرارة تحت السطح الحشوي للفص الأيمن للكبد. القناة الصفراوية ، جنبا إلى جنب مع الوريد البابي والشريان الكبدي ، مضمنة في الرباط الكبدي الاثني عشر. ينضم إلى الكبد والاثني عشر مباشرة ويستنزف السائل الصفراوي في الاثني عشر⁶. تشريحيا ، تنقسم القناة الصفراوية إلى القنوات الكبدية اليمنى واليسرى ، والقناة الكبدية المشتركة ، والقناة الكيسية ، والقناة الصفراوية ، التي تتشكل من التقاء القناة الكيسية والقناة الكبدية المشتركة⁷. هذا واحد في نهاية المطاف يفرغ السائل الصفراوي واللعاب من القناة البنكرياسية إلى الاثني عشر عبر أمبولة فاتر.

تبطن الخلايا الصفراوية القناة الصفراوية داخل وخارج الكبد ، وتسكن في مكانة تشريحية معقدة حيث تساعد في إنتاج الصفراء والتوازن⁸. يمر السائل الصفراوي بهذه الخلايا الطلائية المتخصصة بتركيزات عالية يوميا. على وجه الخصوص ، تعتبر صيانة مظلة HCO3 مهمة جدا للحماية من سمية حمض الصفراء⁹. الخلايا الصفراوية هي خط الدفاع الأول في نظام الكبد الصفراوي ضد ، على سبيل المثال ، الكائنات الحية الدقيقة اللمعية¹⁰. قد تضعف الفعالية الدفاعية للخلايا الصفراوية ضد الاعتداءات السامة بسبب الاستعداد الوراثي. الحمل الزائد السام يسبب الضرر والدمار وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى اعتلال القنوات الصفراوية. علاوة على ذلك ، فإن القناة الصفراوية النامية ليست قادرة تماما على جميع آليات الحماية الذاتية ، مما يؤدي إلى زيادة التعرض للسموم البيئية في القنوات الصفراوية الوليدية¹¹.

Protocol

بعد الموافقة الأخلاقية (N045 / 2021) ، تمت ملاحظة ذكور وإناث C57BL / 6 فئران حديثي الولادة حتى عمر 9 أيام. ولدت الحيوانات وقدمت لأغراض تجريبية من قبل مرفق الحيوانات في المركز الطبي الجامعي هامبورغ إيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا. تم إيواء حديثي الولادة في قفص مع حيواناتهم الأم. تم التحكم في الظروف البيئية في درجة حرارة (20-24 درجة مئوية) ، 12:12 ساعة دورة الضوء والظلام ، والرطوبة النسبية من 40٪ -70٪.

1. التحضير التجريبي

1. قم بإعداد المعدات المطلوبة للعملية الجراحية ، بما في ذلك المقص والملقط وما إلى ذلك (انظر جدول المواد).
2. ضع الأدوات المطهرة والمعقمة على سطح معقم بجوار طاولة العمليات.
3. القتل الرحيم للفأر الوليدي البالغ من العمر P9 بسرعة عن طريق قطع الرأس بمقص التشغيل. ضع جسم الفأر الوليدي الرحيم في حقل عملية معقمة. تشريح EBDSs في حديثي الولادة الفئران بعمر 9 أيام (الخطوة 5).
   ملاحظة: يعطي إجراء التشريح الموصوف أي عالم الأدوات المناسبة لإزالة EBDS من الفئران حديثي الولادة وكبار السن. كلما كبر الماوس ، كان التحضير أسهل.

2. الوصول إلى التجويف البريتوني

1. أمسك الجلد فوق موقع المثانة البولية بالملقط. شق ثقب قطره 2 مم في الجلد باستخدام مقص ، دون الإضرار بالصفاق والهياكل الأساسية. قم بتوسيع القطع إلى موقع قطع الرأس ، باتباع الخط الإبطي الأمامي الأيسر. إزالة الجلد من اليسار إلى الجانب الأيمن مع ملقط غير مؤلم.
2. امسك الصفاق المحيط بالطحال. ارفعه برفق حتى يشبه الصفاق هيكلا يشبه الخيمة واقطع ثقبا قطره 1 مم في المنتصف. انتظر حتى تمتلئ "الخيمة البريتونية" بالهواء. استخدم تكبيرا مجهريا 10x لهذه الخطوة والخطوات التالية.
3. اقطع الصفاق في نافذة محاطة بالأضلاع السفلية ، وكلا منطقتي البطن الجانبيتين ، ومنطقة المثانة السفلية لضمان الوصول الكامل إلى الكبد ونظام القناة الصفراوية والمعدة والأمعاء الدقيقة والقولون.
   ملاحظة: لتحسين الوصول إلى الكبد ، يمكن إجراء شق إضافي ، وإزالة الأضلاع الثلاثة السفلية مع ترك عملية الخنجري ، والأربطة المنجلية ، والكبد ، وهياكل القناة الصفراوية سليمة. من السهل الحصول على منظر الكبد.

3. فحص المرارة والقنوات الصفراوية

ملاحظة: تأكد من إبقاء العينة رطبة بشكل منتظم خلال جميع الخطوات التالية.

1. اسحب عملية الخنجري بعناية في وضع قحفي بطني لفحص المرارة.
   ملاحظة: يزداد التوتر على الرباط المنجلي مع هذه الحركة ، وتصبح المرارة المرفقة مرئية.
   1. قم بإجراء سحب طفيف فقط لتجنب تمزق الرباط المنجلي الذي لا يمكن السيطرة عليه ، مما قد يؤدي إلى تمزق المرارة من نظام القناة الصفراوية. حرر سحب عملية الخنجري قبل الخطوة التالية.
2. اسحب الاثني عشر برفق لتحرير نظام القناة الصفراوية.
   ملاحظة: مع زيادة التوتر على الرباط الكبدي الاثني عشر ، يصبح نسيج القناة الصفراوية مرئيا.

4. استئصال الكتلة

1. قم بإجراء التعبئة الداخلية السفلية باتباع الخطوات أدناه.
   1. تحديد حليمة الاثني عشر ، التي تربط نظام القناة الصفراوية إلى الاثني عشر.
   2. قطع من خلال الاثني عشر حوالي 2 سم من إلى الجانب الجانبي الأيمن من الحليمة.
   3. قطع من خلال منطقة البواب. تأكد من وجود محتويات المعدة في منطقة البواب بين موقع القطع وحليمة الاثني عشر.
      ملاحظة: هذه خطوة مهمة لأمان التوجه لاحقا للموقع الصحيح لأجزاء الاثني عشر الفموية والفموية.
2. أداء التعبئة العليا en-bloc.
   1. اسحب عملية الخنجري برفق واحصل على إمكانية الوصول إلى الرباط المنجلي.
   2. قم بإجراء قطع بطول 1 سم من خلال الرباط المنجلي ، أقرب ما يمكن من عملية الخنجري ، بين المرارة وعملية الخنجري. تأكد من عدم تلف المرارة.
   3. قطع من خلال الهياكل المتصلة التالية بين الكبد والصدر: المريء ، الوريد الأجوف السفلي ، الشريان الأورطي الصدري ، جميع الأربطة التي تحيط بالمنطقة العارية من الكبد ، وجميع وصلات الأنسجة المتبقية ظهريا.
      ملاحظة: يتم تشريح عينة en-bloc بالكامل. أنه يحتوي على الكبد ، ونظام القناة الصفراوية ، والجسم الاثني عشر ، الذي يرتبط مع منطقة البواب في المعدة.

5. تشريح المرارة والقناة الصفراوية النهائي

1. قم بإجراء التحضير الإجمالي باتباع الخطوات أدناه.
   1. ضع عينة en-bloc على وسادة رغوية تستخدم عادة للتجفيف. استخدم تكبيرا مجهريا 20x وملقطين جراحيين مجهريين بدون رضوح بحد أقصى لحجم الطرف 6 مم لهذه الخطوة والخطوات التالية.
   2. قم بتجميع العينة على وسادة الرغوة. أعد تنظيم العينة في الموضع التشريحي الصحيح. تسطيح الجزء الفموي والفموي من الاثني عشر ، وأداء حركة لطيفة.
   3. ابدأ الحركة عند حليمة الاثني عشر واستمر في حواف القطع باستخدام ملقط غير مؤلم. قم بتنعيم محتويات اللب الأبيض للمعدة ، والتي لن تحدث إلا في الجزء الفموي من الاثني عشر. تأكد من تحديد الجزء الفموي والفموي من الاثني عشر لاستبعاد دوران القناة الصفراوية المحتمل.
   4. قطع بقايا كبيرة من الأنسجة الكبدية لبدء تشريح القناة الصفراوية.
2. أداء العزل النهائي.
   1. اضغط برفق على الأنسجة الكبدية المتبقية في مسام حصيرة الرغوة. تأكد من أن حركات الكشط تبدأ من نظام القناة الصفراوية وتؤدي إلى حدود الكبد.
   2. انقل العينة إلى وضع أنظف على حصيرة الرغوة بعد بضع حركات كشط في اتجاهات مختلفة. استخدم ميزة أنسجة الكبد الأقل ضغطا في الخلفية لتحسين العرض للحصول على أفضل تمييز ممكن بين EBDS والخلايا غير المرغوب فيها. كشط الأنسجة الكبدية من القناة الصفراوية حتى لا يبقى شيء ، أو أقل قدر ممكن ، من الأنسجة الكبدية.
   3. قم بمعالجة الرباط الكبدي الاثني عشر حتى يبقى EBDS المعزول. إزالة الأوعية الدموية داخل الرباط مثل الشريان الكبدي والوريد البابي والبقايا الصغيرة. قم بإزالة هذا الخيط الرقيق ، مع سحب لطيف وعناية عالية ، إلى الجانب الجانبي الأيسر. قد تكون خطوة التشريح هذه قد بدأت بالفعل عن غير قصد أو جزئيا أثناء الإزالة السابقة للأنسجة الكبدية ، مما يؤدي في النهاية إلى نفس النتيجة.
      ملاحظة: تظهر الأوعية الدموية كخيوط بيضاء وحساسة للغاية حوالي 3-5 مم عن طريق الفم من حليمة الاثني عشر وتنضم إلى الرباط الكبدي الاثني عشر من الجانب الجانبي الأيسر ، وتتراكم مع القناة الصفراوية إلى ثالوث جليسوني. مع الانتهاء من هذه الخطوة ، يتم عزل العينة النهائية تماما. إذا كانت هناك حاجة إلى سجل ، يمكن التقاط الصور بعد تنظيم هياكل القناة الصفراوية في موقعها التشريحي (الشكل 1). يوصى بالقيام بخطوات التحضير الأخيرة على حصيرة رغوية لأن العينة لن تلتصق كثيرا بسطح حقل التشغيل. إذا كانت المسام رطبة ، فإن القناة الصفراوية ترتفع أو تطفو. عند تحريك العينة ، لن تلتصق بقوة كما تفعل مع التحضير على قماش العملية ، مما يؤدي إلى عدم التمزيق أثناء تحريك العينة.

6. التحضير للتحليل النسيجي

1. ضع العينة المعزولة في محلول مخزن أو وسيط خاص أو مثبتات تحتوي على الفورمالين (انظر جدول المواد) في أسرع وقت ممكن بعد التشريح.
2. اختر حل تخزين مناسب اعتمادا على خطوات المعالجة المخطط لها.
   تنبيه: استخدم المثبتات المحتوية على الفورمالين فقط تحت فتحة التهوية بسبب السمية الحادة والتآكل والمخاطر الصحية المتنوعة.
   ملاحظة: في الدراسة المقدمة ، تم إدخال عينات EBDS في بارافورمالدهيد ، مجففة ، ومضمنة في البارافين. تم تخزينها في درجة حرارة الغرفة وتبريدها قبل التقسيم. في خزانة الاحترار ، تم الاحتفاظ بشرائح 2 ميكرومتر طوال الليل وتلطيخها باستخدام الهيماتوكسيلين التقليدي والإيوزين⁴ (انظر جدول المواد).

النتائج

يوضح الشكل 1A EBDS لحديث الولادة الفئران ، والذي تم تشريحه باستخدام التقنية الموصوفة. مجهريا ، لا يوجد مزيد من الأنسجة الكبدية مرئية. تمت إزالة الأنسجة الكبدية خلال خطوات العزل النهائية للبروتوكول ويمكن تمييزها بسهولة عن أنسجة القناة الصفراوية فيما يتعلق باللون والاتساق. يع...

Discussion

ذكرت هذه المقالة وناقشت إنشاء والتحقق من صحة نهج جراحي جديد لإزالة EBDS من الفئران حديثي الولادة القتل الرحيم. تكشف النتائج المجهرية والنسيجية أن النهج يكتشف بسرعة EBDs ويشريحها بالقرب من حواف القناة ، حتى في الفئران حديثي الولادة. مطلوب فقط الأدوات الجراحية والمجهر مع تكبير 20x للبروتوكول ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides