Dokuz Günlük Fare Yenidoğanlarında Ekstrahepatik Safra Kanalı ve Safra Kesesi Diseksiyonu

Özet

Murin neonatal safra kanalı bozukluklarının gözlenmesi için sağlam bir safra kanalı ve etkili bir hazırlık gereklidir. Bu nedenle, murin yenidoğanlarda tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin izole edilmesi için safra kanalının bütünlüğünü korurken başarılı bir şekilde yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir.

Özet

Murin neonatal safra kanallarının diseksiyonu zor olarak tanımlanmıştır. Tarif edilen standart çalışma prosedürünün temel amacı, fare yenidoğanlarında ekstrahepatik safra kanalının (EBD) hazırlık sırasında safra kanalına zarar vermeden izole edilmesidir. Kolanjiyositler hücre hattına kıyasla son derece yakın preparasyonu ve tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin (EBDS) toplanması nedeniyle, tarif edilen yaklaşım, biliyer atrezi gibi yenidoğan safra kanalı bozukluklarının hayvan modellerinin araştırılmasında son derece yararlıdır. Ötanaziden sonra periton boşluğuna erişildi ve safra kanalı sistemi, duodenum ve karaciğer benzersiz En-bloc-Rezeksiyon (EbR) ile ekstrakte edildi. Ekstrakte edilen numune bir köpük paspas üzerine yerleştirilir ve EBD, gerekli dokunuş olmadan atravmatik olarak kirletici hücrelerden diseke edilir. EBDS'nin tamamının diseksiyonu bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Safra kanalı dokusunun küçük boyutu ve miktarı nedeniyle dikkatli olunmalıdır. Tarif edilen tekniği kullanarak, kolanjiyositlere zarar verilmez. Ayrıca, tekniğin saflığı tekrarlanabilir (n = 10). Bu nedenle, optimum şekilde karşılaştırılabilir numuneler toplanabilir. Ayrıca, safra kanalı dokusu zarar görmez, çünkü safra kanalı sistemi ile herhangi bir temas, hazırlık sırasında önlenebilir ve safra sıvısı safra kesesi içinde bırakılır. En önemlisi, son safra kesesi ve safra kanalı diseksiyonu yapılırken, safra kanalının sadece biraz yanalında sıkılmadan atravmatik mikroaletler kullanıldı. Bu, temiz ve sağlam bir numunenin anahtarıdır ve daha fazla histolojik araştırma veya kolanjiyositlerin izolasyonu için gereklidir. Özetlemek gerekirse, açıklanan yenilikçi diseksiyon tekniği, EBDS'yi mümkün olduğunca temiz bir şekilde izole etmek için gerekli ekipmana sahip özellikle deneyimsiz operatörlere olanak tanır.

Giriş

Biliyer atrezi, primer sklerozan kolanjit (PSK) ve primer biliyer kolanjit (PBK) gibi kolanjiyopatilerin oluşumu ve progresyonu bilinmemekte veya tamamlanmamıştır ^1,2. Bu hastalıkların kökeni ve ilerlemesinin sınırlı bir şekilde anlaşılması, tedavi seçeneklerinin azlığına yol açmaktadır³. Yenidoğan safra yolu hastalıklarının incelenmesindeki en zor engel, patofizyolojinin moleküler olarak anlaşılmasını sağlamaktır. Moleküler patolojinin daha iyi anlaşılmasının temel anahtarlarından biri, etkilenen dokunun mümkün olan en iyi şekilde gözlemlenmesidir. Biliyer atrezi^4'ün potansiyel viral etiyolojisini gözlemlemek gibi araştırmalar arasındaki karşılaştırılabilirliğin ve tutarsızlıkların azalmasını önlemek için, gerçekleştirilen diseksiyon tekniklerinin mümkün olan en iyi şekilde hazırlanması ve paylaşılması ihtiyacı ortaya çıkmaktadır. Hedef dokunun saf bir şekilde hazırlanması, daha sonraki mikroskobik araştırmalar veya üreme hücresi ve 3D organoid kültürleri için gereklidir. Bununla birlikte, murin yenidoğan bozukluklarında, doku örnekleri nadirdir ve çok küçük boyut nedeniyle sadece az miktarda ortaya çıkar. Safra yolu bozuklukları ile ilgili olarak, murin yenidoğanlarda safra kanallarının temiz bir şekilde hazırlanmasındaki zorluklar tanımlanmıştır⁵. Gelişimin yenidoğan aşaması nedeniyle, doku farklılaşması aşırı derecede gelişmiş değildir, bu da hazırlığı zorlaştırır ve yetişkin örneklerin hazırlanmasına kıyasla zorluğu arttırır. Bu nedenle, işletme çalışma grubu, EBDS'yi yenidoğan fare modelinde hazırlamak için yeni bir strateji araştırdı. Bu çalışmada, teknik her numunenin verimli bir şekilde diseksiyonuna izin vermektedir.

Safra kanalı sistemi, karaciğerden kaynaklanan sağ üst karın bölgesine intraperitoneal olarak yerleştirilir. Safra kesesi, karaciğerin sağ lobunun viseral yüzeyinin altında bulunur. Safra kanalı, portal ven ve hepatik arter ile birlikte, hepatoduodenal ligamente gömülüdür. Karaciğer ve duodenuma doğrudan katılır ve safra sıvısını duodenum^6'ya boşaltır. Anatomik olarak, safra kanalı sağ ve sol hepatik kanallara, ortak hepatik kanala, kistik kanala ve kistik kanal ile ortak hepatik kanalın^7'nin birleşmesiyle oluşan Ductus choledochus'a ayrılır. Bu sonunda safra sıvısını ve tükürüğü pankreas kanalından Vater'in Ampulla'sı aracılığıyla duodenuma boşaltır.

Kolanjiyositler safra kanalını intra- ve ekstrahepatik olarak hizalar, safra üretimine ve homeostaza yardımcı oldukları karmaşık bir anatomik niş içinde^{bulunurlar 8}. Safra sıvısı bu özel epitel hücrelerini günlük olarak yüksek konsantrasyonlarda geçirir. Özellikle, HCO3- şemsiye bakımı, safra asidi toksisitesine karşı korunmak için çok önemlidir⁹. Kolanjiyositler, hepatobiliyer sistemde, örneğin luminal mikroorganizmalara karşı ilk savunma hattıdır¹⁰. Kolanjiyositlerin toksik saldırılara karşı savunma etkinliği genetik yatkınlık nedeniyle zayıflayabilir. Toksik bir aşırı yük hasar ve yıkıma neden olur ve bu nedenle kolanjiyopatilere yol açabilir. Ayrıca, gelişmekte olan safra kanalı tüm kendini koruyucu mekanizmalara tamamen sahip değildir ve bu da yenidoğan safra kanallarında çevresel toksinlere karşı daha yüksek bir duyarlılığa yol açar¹¹.

Protokol

Etik onayı takiben (N045/2021), erkek ve dişi C57BL/6 fare yenidoğanları 9 günlük olana kadar gözlendi. Hayvanlar, Hamburg, Almanya'daki Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi'nin hayvan tesisi tarafından deneysel amaçlar için doğdu ve sağlandı. Yenidoğanlar, ebeveyn hayvanlarıyla birlikte bir kafese yerleştirildi. Çevre koşulları sıcaklık (20-24 °C), 12:12 saat açık-karanlık döngüsü ve %40-%70 bağıl nem oranlarında kontrol edildi.

1. Deneysel hazırlık

1. Makas, forseps vb. dahil olmak üzere cerrahi operasyon için gerekli ekipmanı hazırlayın (bkz.
2. Dezenfekte edilmiş ve otoklavlanmış aletleri ameliyat masasının yanındaki steril bir yüzeye yerleştirin.
3. P9 yaşındaki bir yenidoğan faresini, çalışan bir makasla kafasını keserek hızlı bir şekilde ötenazileştirin. Ötanize edilmiş yenidoğan faresinin gövdesini steril bir operasyon alanına yerleştirin. EBDS'leri 9 günlük fare yenidoğanlarında inceleyin (adım 5).
   NOT: Açıklanan diseksiyon prosedürü, herhangi bir bilim insanına EBDS'yi yenidoğan ve yaşlı farelerden çıkarmak için uygun araçları sağlar. Fare ne kadar eski olursa, hazırlık o kadar kolay olur.

2. Peritoneal boşluğa erişim

1. İdrar kesesinin bulunduğu yerin üzerindeki cildi forseps ile kavrayın. Periton ve altta yatan yapılara zarar vermeden makas kullanarak cilde 2 mm çapında bir delik açın. Sol ön aksiller çizgiyi takip ederek kesimi dekapitasyonun bulunduğu yere genişletin. Atravmatik forseps ile cildi soldan sağ tarafa doğru çıkarın.
2. Dalağı çevreleyen peritona tutun. Periton çadır benzeri bir yapıya benzeyene kadar yavaşça kaldırın ve merkezde 1 mm çapında bir delik açın. "Peritoneal çadırın" havayla dolmasını bekleyin. Bu ve sonraki adımlar için 10x mikroskobik büyütme kullanın.
3. Karaciğere, safra kanalı sistemine, mideye, ince bağırsaklara ve kolona tam erişim sağlamak için peritonu, alt kaburgalar, hem lateral karın bölgeleri hem de alt mesane bölgesi tarafından çerçevelenmiş bir pencerede kesin.
   NOT: Karaciğere erişimi iyileştirmek için, ksifoid süreci, falsiform ligamenti, karaciğeri ve safra kanalı yapılarını sağlam bırakırken en düşük üç kaburgayı çıkararak ek bir kesi yapılabilir. Karaciğerin görünümünü elde etmek kolaydır.

3. Safra kesesi ve safra kanallarının incelenmesi

NOT: Aşağıdaki adımların tümü sırasında numuneyi düzenli olarak ıslak tuttuğunuzdan emin olun.

1. Safra kesesini incelemek için ksifoid süreci kraniyoventral pozisyonda dikkatlice çekin.
   NOT: Falciform ligament üzerindeki gerginlik bu hareketle artar ve bağlı safra kesesi görünür hale gelir.
   1. Safra kesesi kanalının safra kanalı sisteminden yırtılmasına yol açabilecek falsiform ligamentin kontrol edilemeyen yırtılmasını önlemek için sadece hafif bir çekme işlemi yapın. Bir sonraki adımdan önce ksifoid işlemin çekişini serbest bırakın.
2. Safra kanalı sistemini serbest bırakmak için duodenumu yavaşça aşağı çekin.
   NOT: Hepatoduodenal ligament üzerindeki gerginlik arttıkça, safra kanalı dokusu görünür hale gelir.

4. En-blok-rezeksiyon

1. Aşağıdaki adımları izleyerek alt en-blok mobilizasyonunu gerçekleştirin.
   1. Safra kanalı sistemini duodenuma bağlayan duodenal papillayı tanımlayın.
   2. Duodenumdan papillanın sağ lateral tarafına yaklaşık 2 cm kesin.
   3. Pilor bölgesinden kesin. Mide içeriğinin, kesme yeri ile duodenal papilla arasındaki pilorik bölgede bulunduğundan emin olun.
      NOT: Bu, oral ve aboral duodenal parçaların doğru yeri için daha sonra oryantasyon güvenliği için önemli bir adımdır.
2. Üst en-blok mobilizasyonunu gerçekleştirin.
   1. Ksifoid işlemi yavaşça çekin ve falciform ligamente erişin.
   2. Safra kesesi ile ksifoid süreç arasında, ksifoid sürece mümkün olduğunca yakın, falsiform ligamentten 1 cm uzunluğunda bir kesim yapın. Safra kesesine zarar vermediğinizden emin olun.
   3. Karaciğer ve toraks arasındaki aşağıdaki bağlantı yapılarını kesin: yemek borusu, inferior vena kava, torasik aort, karaciğerin çıplak alanını çevreleyen tüm bağlar ve dorsal olarak kalan tüm doku bağlantıları.
      NOT: en-bloc örneği tamamen disseke edilmiştir. Karaciğer, safra kanalı sistemi ve midenin pilorik bölgesi ile bağlantılı duodenal korpus içerir.

5. Son safra kesesi ve safra kanalı diseksiyonu

1. Aşağıdaki adımları izleyerek brüt hazırlığı gerçekleştirin.
   1. En-blok numunesini genellikle dehidrasyon için kullanılan bir köpük ped üzerine yerleştirin. Bu ve sonraki adımlar için 20x mikroskobik büyütme ve maksimum uç boyutu 6 mm olan iki mikrocerrahi atravmatik forseps kullanın.
   2. Numuneyi köpük ped üzerine monte edin. Numuneyi doğru anatomik konumda yeniden düzenleyin. Duodenumun oral ve aboral kısmını düzleştirerek yumuşak bir hareket gerçekleştirin.
   3. Hareketi duodenal papillada başlatın ve atravmatik forseps kullanarak kesici kenarlara devam edin. Sadece duodenumun oral kısmında ortaya çıkacak olan midenin beyaz hamurlu içeriğini yumuşatın. Olası safra kanalı rotasyonunu dışlamak için duodenumun oral ve aboral kısmını tanımladığınızdan emin olun.
   4. Safra kanalının diseksiyonuna başlamak için büyük karaciğer dokusu kalıntılarını kesin.
2. Son yalıtımı gerçekleştirin.
   1. Kalan karaciğer dokusunu köpük paspasın gözeneklerine hafifçe bastırın. Kazıma hareketlerinin safra kanalı sisteminden başlayıp karaciğer sınırlarına yol açtığından emin olun.
   2. Çeşitli yönlerde birkaç kazıma hareketinden sonra numuneyi köpük paspas üzerinde daha temiz bir konuma aktarın. EBDS ve istenmeyen hücreler arasında mümkün olan en iyi ayrım için görünümü optimize etmek üzere arka planda daha az sıkılmış karaciğer dokusunun avantajını kullanın. Hepatik dokuyu safra kanalından hiçbir şey kalmayıncaya kadar veya mümkün olduğunca az kalana kadar kazıyın.
   3. İzole EBDS kalana kadar hepatoduodenal ligamenti işleyin. Hepatik arter, portal ven ve küçük kalıntılar gibi intraligamentöz kan damarlarını çıkarın. Bu hassas filamenti, yumuşak bir çekiş ve yüksek özenle sol yanal tarafa çıkarın. Bu diseksiyon adımı, hepatik dokunun önceden çıkarılması sırasında istemeden veya kısmen tamamlanmış olabilir, bu da sonunda aynı sonuca yol açar.
      NOT: Kan damarları, duodenal papillanın oral yoldan yaklaşık 3-5 mm beyaz ve çok hassas bir filament olarak ortaya çıkar ve sol lateral taraftan hepatoduodenal ligamente katılır ve safra kanalı ile glissonian üçlüsüne birikir. Bu adımın tamamlanmasıyla, son numune tamamen izole edilir. Kayıt ihtiyacı varsa, safra kanalı yapılarını anatomik konumlarına göre düzenledikten sonra görüntüler yakalanabilir (Şekil 1). Son hazırlık adımlarının bir köpük paspas üzerinde yapılması önerilir, çünkü numune operasyon alanının yüzeyine çok fazla yapışmayacaktır. Gözenekler ıslaksa, safra kanalı yükselir veya yüzer. Numuneyi hareket ettirirken, operasyon bezi üzerindeki preparatta olduğu kadar sıkı yapışmaz, bu da numuneyi hareket ettirirken yırtılmaya neden olmaz.

6. Histolojik analiz için hazırlık

1. İzole edilmiş numuneyi, diseksiyondan sonra mümkün olan en kısa sürede tamponlanmış bir çözeltiye, özel bir ortama veya formalin içeren fiksatif maddelere (bakınız Malzeme Tablosu) koyun.
2. Daha fazla planlanan işleme adımlarına bağlı olarak uygun bir depolama çözümü seçin.
   DİKKAT: Formalin içeren fiksatörleri akut toksisite, aşındırıcılık ve çeşitli sağlık tehlikeleri nedeniyle sadece bir havalandırma deliği altında kullanın.
   NOT: Sunulan çalışmada, EBDS örnekleri paraformaldehit içine yerleştirilmiş, dehidrate edilmiş ve parafin içine gömülmüştür. Oda sıcaklığında saklanmışlar ve bölümlemeden önce soğutulmuşlardır. Bir ısıtma kabininde, 2 μm dilimler gece boyunca tutuldu ve geleneksel hematoksilin ve eozin⁴ kullanılarak boyandı (bkz.

Sonuçlar

Şekil 1A , tarif edilen teknikle diseke edilen bir murin yenidoğanının EBDS'sini göstermektedir. Mikroskopik olarak, başka karaciğer dokusu görülmez. Hepatik doku, protokolün son izolasyon aşamalarında çıkarılmıştır ve renk ve kıvam açısından safra kanalı dokusundan kolayca ayırt edilebilir. Şekil 1B , milimetre ölçeğine kıyasla izole edilmiş numuneyi göstermektedir. EBD'nin uzunluğu (safra kesesinden duodenal papillaya kadar öl?...

Tartışmalar

Bu makalede, ötenazi yenidoğan farelerinin EBDS'lerinin çıkarılması için yeni bir cerrahi yaklaşımın oluşturulması ve doğrulanması bildirilmiş ve tartışılmıştır. Mikroskopik ve histolojik bulgular, yaklaşımın EBD'leri hızlı bir şekilde tespit ettiğini ve yenidoğan farelerde bile kanal kenarlarına yakın bir yerde diseke ettiğini ortaya koymaktadır. Tarif edilen protokol için sadece cerrahi aletler ve 20x büyütmeli bir mikroskop gereklidir. Ayrıca, yaklaşım tüm EBDS'nin izolasyonuna ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides