Dissecção do ducto biliar extra-hepático e da vesícula biliar em neonatos de camundongos com nove dias de idade

Resumo

Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.

Resumo

A dissecção dos ductos biliares neonatais murinos tem sido descrita como difícil. O principal objetivo do procedimento cirúrgico padrão descrito é o isolamento do ducto biliar extra-hepático (EBD) em neonatos de camundongos sem danificar o ducto biliar durante a preparação. Devido à sua preparação excepcionalmente próxima em comparação com a linhagem celular de colangiócitos e a colheita de todo o sistema de ducto biliar extra-hepático (EBDS), a abordagem descrita é extremamente útil na pesquisa de modelos animais de distúrbios do ducto biliar recém-nascido, como a atresia biliar. Após a eutanásia, a cavidade peritoneal foi acessada e o sistema de ductos biliares, duodeno e fígado foram extraídos com a única ressecção em bloco (EbR). A amostra extraída é colocada em um tapete de espuma, e a EBD é dissecada de células contaminantes atraumaticamente sem o toque necessário. A dissecação de toda a EBDS é uma vantagem significativa deste método. Deve-se ter cuidado devido ao pequeno tamanho e quantidade de tecido do ducto biliar. Usando a técnica descrita, não há danos aos colangiócitos. Além disso, a pureza da técnica é reprodutível (n = 10). Portanto, amostras comparáveis de forma ideal podem ser colhidas. Além disso, nenhum tecido do ducto biliar é prejudicado, porque qualquer contato com o sistema do ducto biliar pode ser evitado durante a preparação, deixando o fluido biliar dentro da vesícula biliar. Mais importante ainda, durante a realização da vesícula biliar final e da dissecção do ducto biliar, microinstrumentos atrauratos foram usados apenas ligeiramente laterais do ducto biliar sem apertá-lo. Esta é a chave para uma amostra limpa e intacta, e essencial para uma investigação histológica mais aprofundada ou o isolamento de colangiócitos. Para resumir, a técnica de dissecção inovadora descrita permite que operadores especialmente inexperientes com o equipamento necessário isolem a EBDS da forma mais limpa possível.

Introdução

A gênese e a progressão de colangiopatias como atresia biliar, colangite esclerosante primária (colangite esclerosante) e colangite biliar primária (CBP) são desconhecidas ou incompletas ^1,2. A compreensão limitada da origem e progressão dessas doenças leva a uma escassez de opções terapêuticas³. O obstáculo mais difícil no estudo dos distúrbios do ducto biliar neonatal é obter uma compreensão molecular da fisiopatologia. Uma das chaves essenciais para uma melhor compreensão da patologia molecular é a melhor observação possível do tecido afetado. Para evitar a redução da comparabilidade e discrepâncias entre as pesquisas, como a observação da potencial etiologia viral da atresia biliar⁴, surge a necessidade do melhor preparo possível e do compartilhamento das técnicas de dissecção realizadas. Uma preparação pura do tecido alvo é necessária para investigações microscópicas posteriores ou culturas organoides de células e 3D reprodutoras. No entanto, em distúrbios neonatais murinos, as amostras de tecido são raras e só ocorrem em pequena quantidade devido ao tamanho muito pequeno. Em relação aos distúrbios do ducto biliar, dificuldades no preparo limpo dos ductos biliares em neonatos murinos têm sido descritas⁵. Devido ao estágio neonatal de desenvolvimento, a diferenciação tecidual não é excessivamente avançada, o que complica o preparo e aumenta a dificuldade em comparação com o preparo de amostras adultas. Portanto, o grupo de trabalho operacional investigou uma nova estratégia para preparar a EBDS em um modelo de camundongo neonatal. No presente estudo, a técnica permite uma dissecção eficiente de cada amostra.

O sistema de ducto biliar é colocado intraperitonealmente no abdômen superior direito, surgindo do fígado. A vesícula biliar está localizada abaixo da superfície visceral do lobo direito do fígado. O ducto biliar, juntamente com a veia porta e a artéria hepática, está incorporado no ligamento hepatoduodenal. Ele une o fígado e o duodeno diretamente e drena o líquido biliar para o duodeno⁶. Anatomicamente, o ducto biliar é dividido nos ductos hepáticos direito e esquerdo, no ducto hepático comum, no ducto cístico e no ducto colédoco, que é formado pela confluência do ducto cístico e do ducto hepático comum⁷. Este eventualmente esvazia o líquido biliar e a saliva do ducto pancreático para o duodeno através da Ampola de Vater.

Os colangiócitos revestem o ducto biliar intra e extra-hepaticamente, habitando-se em um complicado nicho anatômico onde auxiliam na produção biliar e na homeostase⁸. O fluido biliar passa essas células epiteliais especializadas em altas concentrações diariamente. Em particular, a manutenção do guarda-chuva HCO3- é muito importante para a proteção contra a toxicidade dos ácidos biliares⁹. Os colangiócitos são a primeira linha de defesa no sistema hepatobiliar contra, por exemplo, microrganismos luminais¹⁰. A eficácia de defesa dos colangiócitos contra agressões tóxicas pode ser enfraquecida pela predisposição genética. Uma sobrecarga tóxica causa danos e destruição e, portanto, pode levar a colangiopatias. Além disso, o ducto biliar em desenvolvimento não é completamente capaz de todos os mecanismos de autoproteção, levando a uma maior suscetibilidade a toxinas ambientais nos ductos biliares neonatais¹¹.

Protocolo

Após a aprovação ética (N045/2021), foram observados neonatos de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas até os 9 dias de idade. Os animais nasceram e foram fornecidos para fins experimentais pela instalação animal do Centro Médico Universitário de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha. Os neonatos foram alojados em uma gaiola junto com seus animais pais. As condições ambientais foram controladas em temperatura (20-24 °C), ciclo claro-escuro de 12:12 h e umidade relativa do ar de 40%-70%.

1. Preparação experimental

1. Prepare o equipamento necessário para a operação cirúrgica, incluindo tesoura, pinça, etc. (ver Tabela de Materiais).
2. Coloque os instrumentos desinfetados e autoclavados em uma superfície estéril ao lado da mesa de operação.
3. Eutanasiar um rato neonatal de idade P9 rapidamente por decapitação com uma tesoura cirúrgica. Coloque o corpo do rato neonatal eutanasiado em um campo de operação estéril. Dissecar os EBDSs em neonatos de camundongos de 9 dias de idade (etapa 5).
   NOTA: O procedimento de dissecação descrito dá a qualquer cientista as ferramentas adequadas para remover o EBDS de camundongos neonatais e mais velhos. Quanto mais velho o mouse, mais fácil a preparação.

2. Acesso à cavidade peritoneal

1. Segure a pele acima da localização da bexiga urinária com fórceps. Incida um orifício de 2 mm de diâmetro na pele usando uma tesoura, sem danificar o peritônio e as estruturas subjacentes. Expanda o corte até o local da decapitação, seguindo a linha axilar frontal esquerda. Remova a pele do lado esquerdo para o direito com a pinça atraumática.
2. Segure o peritônio ao redor do baço. Levante-o suavemente até que o peritônio se assemelhe a uma estrutura semelhante a uma tenda e corte um orifício de 1 mm de diâmetro no centro. Espere a "tenda peritoneal" se encher de ar. Use uma ampliação microscópica de 10x para esta e as etapas a seguir.
3. Corte o peritônio em uma janela emoldurada pelas costelas inferiores, ambas as regiões abdominais laterais e a área da bexiga inferior para garantir o acesso total ao fígado, sistema de ductos biliares, estômago, intestino delgado e cólon.
   NOTA: Para melhorar o acesso ao fígado, uma incisão adicional pode ser realizada, removendo as três costelas mais baixas, deixando intactas as estruturas do processo xifoide, ligamento falciforme, fígado e ducto biliar. A visão do fígado é fácil de obter.

3. Exame da vesícula biliar e ductos biliares

NOTA: Certifique-se de manter a amostra molhada regularmente durante todas as etapas a seguir.

1. Puxe cuidadosamente o processo xifoide em uma posição cranioventral para examinar a vesícula biliar.
   NOTA: A tensão no ligamento falciforme aumenta com este movimento, e a vesícula biliar anexada torna-se visível.
   1. Realize apenas um leve puxão para evitar o rompimento incontrolável do ligamento falciforme, o que poderia levar ao rompimento da vesícula biliar do sistema de ductos biliares. Solte a tração do processo xifoide antes da próxima etapa.
2. Puxe suavemente o duodeno para baixo para liberar o sistema de ducto biliar.
   NOTA: À medida que a tensão no ligamento hepatoduodenal aumenta, o tecido do ducto biliar torna-se visível.

4. En-bloc-ressecção

1. Realize a mobilização em bloco inferior seguindo as etapas abaixo.
   1. Identifique a papila duodenal, que conecta o sistema de ducto biliar ao duodeno.
   2. Corte o duodeno a cerca de 2 cm do lado direito lateral da papila.
   3. Corte a área pilórica. Certifique-se de que o conteúdo do estômago esteja presente na área pilórica entre o local de corte e a papila duodenal.
      NOTA: Este é um passo importante para posterior segurança da orientação para a localização correta das partes duodenais orais e aborais.
2. Realizar a mobilização superior em bloco.
   1. Puxe suavemente o processo xifoide e tenha acesso ao ligamento falciforme.
   2. Realizar um corte de 1 cm de comprimento através do ligamento falciforme, o mais próximo possível do processo xifoide, entre a vesícula biliar e o processo xifoide. Certifique-se de não danificar a vesícula biliar.
   3. Corte as seguintes estruturas de conexão entre o fígado e o tórax: esôfago, veia cava inferior, aorta torácica, todos os ligamentos que cercam a área nua do fígado e todas as conexões de tecido dorsalmente remanescentes.
      NOTA: A amostra em bloco é completamente dissecada. Ele contém o fígado, o sistema do ducto biliar e o corpo duodenal, que está conectado com a região pilórica do estômago.

5. Vesícula biliar final e dissecção do ducto biliar

1. Realize a preparação bruta seguindo os passos abaixo.
   1. Coloque a amostra em bloco em uma almofada de espuma geralmente usada para desidratação. Use uma ampliação microscópica de 20x e duas pinças atraumáticas microcirúrgicas com um tamanho máximo da ponta de 6 mm para esta e as etapas seguintes.
   2. Monte a amostra na almofada de espuma. Reorganize a amostra na posição anatômica correta. Achatar a parte oral e aboral do duodeno, realizando um movimento suave.
   3. Inicie o movimento na papila duodenal e continue até as arestas de corte usando pinça atraumática. Alise o conteúdo polpudo branco do estômago, que só ocorrerá na parte oral do duodeno. Certifique-se de identificar a parte oral e a parte aboral do duodeno para descartar a provável rotação do ducto biliar.
   4. Corte grandes restos de tecido hepático para iniciar a dissecção do ducto biliar.
2. Execute o isolamento final.
   1. Pressione suavemente o tecido hepático restante nos poros do tapete de espuma. Certifique-se de que os movimentos de raspagem começam a partir do sistema de ductos biliares e levam aos limites do fígado.
   2. Transfira a amostra para uma posição mais limpa no tapete de espuma após alguns movimentos de raspagem em várias direções. Use a vantagem de menos tecido hepático espremido em segundo plano para otimizar a visão para a melhor diferenciação possível entre EBDS e células indesejadas. Raspe o tecido hepático do ducto biliar até que nada, ou o mínimo possível, do tecido hepático permaneça.
   3. Processe o ligamento hepatoduodenal até que a EBDS isolada permaneça. Remova os vasos sanguíneos intraligamentares, como a artéria hepática, a veia porta e pequenos remanescentes. Remova este filamento delicado, com um puxão suave e alto cuidado, para o lado lateral esquerdo. Esta etapa de dissecção pode já ter começado involuntariamente ou parcialmente concluída durante a remoção prévia do tecido hepático, o que no final leva ao mesmo resultado.
      NOTA: Os vasos sanguíneos estão emergindo como um filamento branco e muito delicado aproximadamente 3-5 mm por via oral da papila duodenal e se juntam ao ligamento hepatoduodenal do lado lateral esquerdo, acumulando-se com o ducto biliar até a tríade glissoniana. Com a conclusão desta etapa, a amostra final é completamente isolada. Se houver necessidade de registro, as imagens podem ser capturadas após a organização das estruturas do ducto biliar em sua posição anatômica (Figura 1). Recomenda-se fazer as últimas etapas de preparação em um tapete de espuma porque a amostra não grudará tanto na superfície do campo de operação. Se os poros estiverem molhados, o ducto biliar levita ou flutua. Ao mover a amostra, ela não grudará tão firmemente quanto com a preparação no pano de operação, resultando em nenhum rasgo ao mover a amostra.

6. Preparação para a análise histológica

1. Colocar a amostra isolada numa solução tamponada, num meio especial ou em fixadores contendo formalina (ver Tabela de Materiais) o mais rapidamente possível após a dissecção.
2. Escolha uma solução de armazenamento adequada, dependendo das etapas de processamento planejadas adicionais.
   CUIDADO: Use fixadores contendo formalina apenas sob uma saída de ar devido à toxicidade aguda, corrosividade e diversos riscos para a saúde.
   NOTA: No estudo apresentado, as amostras de EBDS foram inseridas em paraformaldeído, desidratadas e embutidas em parafina. Eles foram armazenados à temperatura ambiente e resfriados antes da secção. Em um armário de aquecimento, fatias de 2 μm foram mantidas durante a noite e coradas usando hematoxilina convencional e eosina⁴ (ver Tabela de Materiais).

Resultados

A Figura 1A mostra a EBDS de um neonato murino, que foi dissecado com a técnica descrita. Microscopicamente, nenhum outro tecido hepático é visível. O tecido hepático foi removido durante as etapas finais de isolamento do protocolo e pode ser facilmente distinguido do tecido do ducto biliar em relação à cor e consistência. A Figura 1B mostra a amostra isolada em comparação com uma escala milimétrica. O comprimento da EBD (medido da vesícula biliar ?...

Discussão

Este artigo relatou e discutiu a criação e validação de uma nova abordagem cirúrgica para a remoção da EBDS de camundongos neonatais eutanasiados. Os achados microscópicos e histológicos revelam que a abordagem detecta rapidamente as EBDs e as disseca perto das margens do ducto, mesmo em camundongos neonatais. Apenas instrumentos cirúrgicos e um microscópio com ampliação de 20x são necessários para o protocolo descrito. Além disso, a abordagem permite o isolamento de toda a EBDS. A técnica é altamente e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides