דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים

Summary

לתצפית על הפרעות בצינור המרה של מורין, נדרש צינור מרה שלם והכנה יעילה. לכן, גישה חדשה לבידוד כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים ביילודים מורין פותחה בהצלחה תוך שמירה על שלמות צינור המרה.

Abstract

כריתה של צינורות מרה ילודים מורין תוארה כקשה. המטרה העיקרית של הליך ההפעלה הסטנדרטי המתואר היא בידוד של צינור המרה החוץ-כבד (EBD) ביילודים של עכברים מבלי לפגוע בצינור המרה במהלך ההכנה. בגלל ההכנה הקרובה במיוחד שלה בהשוואה לקו התאים של כולנגיוציטים וקציר של כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים (EBDS), הגישה המתוארת שימושית ביותר בחקר מודלים של בעלי חיים של הפרעות בצינור המרה של יילודים, כגון אטרזיה של המרה. לאחר המתת חסד, חלל הצפק היה גישה, ואת מערכת צינור המרה, התריסריון, ואת הכבד חולצו עם הייחודי En-bloc-Reduct (EbR). הדגימה המופקת מונחת על מחצלת קצף, וה- EBD מנותח מתאים מזהמים באופן אטראומטי ללא מגע הכרחי. ניתוח של EBDS כולו הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. יש לנקוט משנה זהירות בשל הגודל הקטן והכמות של רקמת צינור המרה. באמצעות הטכניקה המתוארת, אין נזק cholangiocytes. יתר על כן, טוהר הטכניקה ניתן לשחזור (n = 10). לכן, ניתן לקצור דגימות דומות באופן אופטימלי. יתר על כן, אף רקמת צינור המרה אינה נפגעת, מכיוון שניתן להימנע מכל מגע עם מערכת צינור המרה במהלך ההכנה, ולהשאיר את נוזל המרה בתוך כיס המרה. והכי חשוב, בעת ביצוע כיס המרה הסופי ודיסקציה של צינור המרה, מיקרו-מכשירים א-טראומטיים שימשו רק מעט לרוחב צינור המרה מבלי לסחוט אותו. זהו המפתח למדגם נקי ושלם, וחיוני לחקירה היסטולוגית נוספת או לבידוד של כולנגיוציטים. לסיכום, טכניקת הדיסקציה החדשנית המתוארת מאפשרת למפעילים חסרי ניסיון במיוחד עם הציוד הדרוש לבודד את ה- EBDS בצורה נקייה ככל האפשר.

Introduction

ההתחלה וההתקדמות של כולנגיופתיות כגון אטרזיה מרה, כולנגיטיס סקלרוזית ראשונית (PSC), וכולנגיטיס מרה ראשונית (PBC) אינן ידועות או לא שלמות ^1,2. ההבנה המוגבלת של מקורן והתקדמותן של מחלות אלה מובילה למיעוט אפשרויות הטיפול³. המכשול הקשה ביותר בחקר הפרעות בצינור המרה של ילודים הוא השגת הבנה מולקולרית של הפתופיזיולוגיה. אחד המפתחות החיוניים להבנה טובה יותר של הפתולוגיה המולקולרית הוא התצפית הטובה ביותר האפשרית על רקמות מושפעות. כדי למנוע השוואה מופחתת ופערים בין מחקרים, כגון התבוננות באטיולוגיה ויראלית פוטנציאלית של אטרזיה מרה⁴, מתעורר הצורך בהכנה הטובה ביותר האפשרית ושיתוף של טכניקות הדיסקציה שבוצעו. הכנה טהורה של רקמת המטרה נחוצה למחקרים מיקרוסקופיים מאוחרים יותר או לגידול תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות ותלת-ממדיות. עם זאת, בהפרעות ילודים מורין, דגימות רקמות הן נדירות ומתרחשות רק בכמות קטנה בשל גודל קטן מאוד. לגבי הפרעות בצינור המרה, תוארו קשיים בהכנה נקייה של צינורות המרה בילודים מורין⁵. בשל שלב ההתפתחות של היילודים, התמיינות הרקמות אינה מתקדמת יתר על המידה, מה שמסבך את ההכנה ומגביר את הקושי בהשוואה להכנת דגימות בוגרות. לכן, קבוצת העבודה התפעולית חקרה אסטרטגיה חדשנית להכנת ה- EBDS במודל עכבר יילודים. במחקר הנוכחי, הטכניקה מאפשרת ניתוח יעיל של כל דגימה.

מערכת צינור המרה ממוקמת באופן תוך-צפקי בבטן העליונה הימנית, הנובעת מהכבד. כיס המרה ממוקם מתחת לפני השטח הקרביים של האונה הימנית של הכבד. צינור המרה, יחד עם וריד הפורטל ועורק הכבד, מוטבע ברצועת ההפטודודנל. הוא מחבר את הכבד ואת התריסריון ישירות ומנקז נוזל מרה לתוך התריסריון⁶. מבחינה אנטומית, צינור המרה מחולק לצינורות הכבד הימניים והשמאליים, צינור הכבד המשותף, הצינור הציסטי, ודוקטוס choledochus, אשר נוצר על ידי מפגש של צינור ציסטי ואת צינור הכבד המשותף⁷. זה בסופו של דבר מרוקן נוזל מרה ורוק מצינור הלבלב לתוך התריסריון דרך אמפולה של Vater.

כולנגיוציטים מרפדים את צינור המרה באופן תוך-הפטי וחוץ-הפטי, ושוכנים בנישה אנטומית מסובכת שבה הם מסייעים בייצור מרה ובהומאוסטזיס⁸. נוזל המרה עובר את תאי האפיתל המתמחים האלה בריכוזים גבוהים מדי יום. בפרט, תחזוקת מטריית HCO3 חשובה מאוד להגנה מפני רעילות חומצת מרה⁹. Cholangiocytes הם קו ההגנה הראשון במערכת hepatobiliary נגד, למשל, מיקרואורגניזמים luminal¹⁰. יעילות ההגנה של כולנגיוציטים מפני התקפות רעילות עלולה להיחלש על ידי נטייה גנטית. עומס יתר רעיל גורם לנזק והרס ולכן יכול להוביל לכולנגיופתיות. יתר על כן, צינור המרה המתפתח אינו מסוגל לחלוטין לכל מנגנוני ההגנה העצמית, מה שמוביל לרגישות גבוהה יותר לרעלנים סביבתיים בצינורות המרה היילודים¹¹.

Protocol

לאחר אישור אתי (N045/2021), נצפו יילודים של עכברים זכרים ונקבות C57BL/6 עד גיל 9 ימים. בעלי החיים נולדו וסופקו למטרות ניסוי על ידי מתקן החיות של המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, המבורג, גרמניה. היילודים שוכנו בכלוב יחד עם חיות האם שלהם. התנאים הסביבתיים היו מבוקרים בטמפרטורה (20-24 מעלות צלזיוס), מחזור אור-חושך של 12:12, ולחות יחסית של 40%-70%.

1. הכנה ניסיונית

1. הכינו את הציוד הנדרש לפעולה כירורגית, כולל מספריים, מלקחיים וכו' (ראו טבלת חומרים).
2. הניחו מכשירים מחוטאים ואוטומטיים על משטח סטרילי ליד שולחן הניתוחים.
3. הרדימו עכבר יילודים בגיל P9 במהירות על ידי עריפת ראשו באמצעות מספריים פועלים. מניחים את גופו של עכבר היילוד המומת על שדה ניתוח סטרילי. נתחו את ה-EBDS בפגי עכברים בני 9 ימים (שלב 5).
   הערה: הליך הנתיחה המתואר נותן לכל מדען את הכלים המתאימים להסרת ה- EBDS מעכברים ילודים ומבוגרים יותר. ככל שהעכבר ישן יותר, כך ההכנה קלה יותר.

2. גישה לחלל הצפק

1. לתפוס את העור מעל המיקום של שלפוחית השתן עם מלקחיים. חותכים חור בקוטר 2 מ"מ לתוך העור באמצעות מספריים, מבלי לפגוע בצפק ובמבנים שמתחתיו. הרחב את החתך למיקום העריפה, בעקבות קו בית השחי הקדמי השמאלי. הסר את העור מצד שמאל לצד ימין עם מלקחיים atraumatic.
2. תפסו את הצפק המקיף את הטחול. מרימים אותו בעדינות עד שהצפק דומה למבנה דמוי אוהל וחותכים חור בקוטר 1 מ"מ במרכז. המתן עד ש"אוהל הצפק "יתמלא באוויר. השתמש בהגדלה מיקרוסקופית של 10x עבור שלב זה והשלבים הבאים.
3. חותכים את הצפק בחלון הממוסגר על ידי הצלעות התחתונות, הן אזורי הבטן הצדדיים והן אזור שלפוחית השתן התחתונה כדי להבטיח גישה מלאה לכבד, למערכת צינורות המרה, לקיבה, למעי הדק ולמעי הגס.
   הערה: כדי לשפר את הגישה לכבד, ניתן לבצע חתך נוסף, הסרת שלוש הצלעות הנמוכות ביותר תוך השארת התהליך הקסיפואידי, הרצועה הזיפית, הכבד ומבני צינור המרה ללא פגע. קל להשיג את הנוף של הכבד.

3. בדיקת כיס המרה וצינורות המרה

הערה: הקפידו לשמור על הדגימה רטובה על בסיס קבוע במהלך כל השלבים הבאים.

1. בזהירות למשוך את תהליך xiphoid במצב cranioventral כדי לבחון את כיס המרה.
   הערה: המתח על הרצועה המזויפת עולה עם תנועה זו, וכיס המרה המחובר הופך גלוי.
   1. בצע רק משיכה קלה כדי למנוע קריעה בלתי נשלטת של הרצועה falciform, אשר עלול להוביל לקרע כיס המרה ממערכת צינור המרה. שחרר את המשיכה של תהליך xiphoid לפני השלב הבא.
2. משכו בעדינות את התריסריון כלפי מטה כדי לשחרר את מערכת צינורות המרה.
   הערה: ככל שהמתח ברצועה הפטודואודנלית עולה, רקמת צינור המרה הופכת לגלויה.

4. כריתה של גוש

1. בצע את ההתגייסות הנמוכה יותר בגוש בהתאם לשלבים הבאים.
   1. זהה את הפפילה של התריסריון, המחברת את מערכת צינורות המרה לתריסריון.
   2. חותכים דרך התריסריון כ -2 ס"מ מהצד הימני הצדדי של הפפילה.
   3. חותכים דרך האזור הפילורי. ודא כי תוכן הקיבה נמצאים באזור פילורי בין מיקום החיתוך לבין פפילה התריסריון.
      הערה: זהו צעד חשוב לאבטחת התמצאות מאוחרת יותר עבור המיקום הנכון של חלקי התריסריון האוראליים והאוראליים.
2. בצע את גיוס הגוש העליון.
   1. משכו בעדינות את התהליך הקסיפואידי וקבלו גישה לרצועה המזויפת.
   2. בצע חתך באורך 1 ס"מ דרך הרצועה falciform, קרוב ככל האפשר לתהליך xiphoid, בין כיס המרה לבין תהליך xiphoid. הקפד לא לפגוע בכיס המרה.
   3. חותכים את המבנים המקשרים הבאים בין הכבד לבית החזה: הוושט, הווריד הנבוב התחתון, אבי העורקים החזי, כל הרצועות המקיפות את האזור החשוף של הכבד, וכל קשרי הרקמות שנותרו באופן דורסלי.
      הערה: דגימת en-bloc מנותחת לחלוטין. הוא מכיל את הכבד, מערכת צינור המרה, ואת קורפוס התריסריון, אשר מחובר עם האזור הפילורי של הבטן.

5. דיסקציה סופית של כיס המרה וצינור המרה

1. בצע את ההכנה ברוטו לפי השלבים הבאים.
   1. הניחו את דגימת הגוש על כרית קצף המשמשת בדרך כלל להתייבשות. השתמש בהגדלה מיקרוסקופית של 20x ובשני מלקחיים א-טראומטיים מיקרו-כירורגיים עם גודל קצה מרבי של 6 מ"מ עבור שלב זה והשלבים הבאים.
   2. הרכיבו את הדגימה על כרית הקצף. ארגן מחדש את הדגימה במיקום האנטומי הנכון. משטחים את החלק האוראלי והאבראלי של התריסריון, מבצעים תנועה עדינה.
   3. התחל את התנועה בפפילה התריסריון והמשיך לקצוות החיתוך באמצעות מלקחיים א-טראומטיים. להחליק את התוכן עיסתי לבן של הבטן, אשר יתרחש רק בחלק האוראלי של התריסריון. הקפידו לזהות את החלק האוראלי ואת החלק האבראלי של התריסריון כדי לשלול סיבוב סביר של צינור המרה.
   4. חותכים שרידים גדולים של רקמת הכבד כדי להתחיל דיסקציה של צינור המרה.
2. בצע את הבידוד הסופי.
   1. לחצו בעדינות את רקמת הכבד הנותרת לתוך הנקבוביות של מחצלת הקצף. ודא שתנועות הגירוד מתחילות ממערכת צינורות המרה ומובילות לגבולות הכבד.
   2. העבירו את הדגימה למצב נקי יותר על שטיחון הקצף לאחר מספר תנועות גירוד בכיוונים שונים. השתמש ביתרון של רקמת כבד פחות דחוסה ברקע כדי למטב את התצוגה להבחנה הטובה ביותר האפשרית בין EBDS לתאים לא רצויים. מגרדים את רקמת הכבד מצינור המרה עד שלא נותר דבר, או מעט ככל האפשר, של רקמת הכבד.
   3. מעבדים את הרצועה ההפטודואודנלית עד שנשאר ה-EBDS המבודד. הסר כלי דם תוך ליגמנטליים כמו עורק הכבד, וריד הפורטל ושרידים קטנים. הסר נימה עדינה זו, עם משיכה עדינה וטיפול גבוה, לצד שמאל לרוחב. ייתכן ששלב זה של דיסקציה כבר החל שלא במתכוון או בחלקו במהלך ההסרה הקודמת של רקמת הכבד, מה שבסופו של דבר מוביל לאותה תוצאה.
      הערה: כלי הדם מתגלים כחוט לבן ועדין מאוד כ-3-5 מ"מ דרך הפה של הפפילה בתריסריון ומצטרפים לרצועה ההפטודואודנלית מצד שמאל לרוחב, המצטברים עם צינור המרה לשלישייה הגליסונית. עם השלמת שלב זה, המדגם הסופי מבודד לחלוטין. אם יש צורך ברשומה, ניתן לצלם תמונות לאחר ארגון מבני צינורות המרה למקומם האנטומי (איור 1). מומלץ לבצע את שלבי ההכנה האחרונים על מחצלת קצף מכיוון שהדגימה לא תידבק כל כך לפני השטח של שדה הניתוח. אם הנקבוביות רטובות, צינור המרה מרחף או צף. בעת הזזת הדגימה, היא לא תידבק בחוזקה כפי שהייתה עושה עם הכנה על בד הניתוח, וכתוצאה מכך לא תיקרע בעת הזזת הדגימה.

6. הכנה לניתוח היסטולוגי

1. שים את הדגימה המבודדת בתמיסה חצויה, מדיום מיוחד או קיבועים המכילים פורמלין (ראה טבלת חומרים) בהקדם האפשרי לאחר הנתיחה.
2. בחר פתרון אחסון מתאים בהתאם לשלבי עיבוד מתוכננים נוספים.
   אזהרה: יש להשתמש בחומרים מקבעים המכילים פורמלין רק מתחת לפתח האוורור בגלל רעילות חריפה, קורוזיביות וסכנות בריאותיות מגוונות.
   הערה: במחקר המוצג, דגימות ה-EBDS הוכנסו לפרפורמלדהיד, התייבשו והוטמעו בפרפין. הם אוחסנו בטמפרטורת החדר והתקררו לפני החתך. בארון חימום, פרוסות 2 מיקרומטר נשמרו למשך הלילה והוכתמו באמצעות המטוקסילין קונבנציונאלי ואאוזין⁴ (ראו טבלת חומרים).

תוצאות

איור 1A מראה את ה-EBDS של יילוד מורין, אשר נותח בטכניקה המתוארת. מבחינה מיקרוסקופית, לא נראית רקמת כבד נוספת. רקמת הכבד הוסרה בשלבי הבידוד הסופיים של הפרוטוקול וניתן היה להבחין בה בקלות מרקמת צינור המרה לגבי צבע ועקביות. איור 1B מציג את הדגימה המבודדת בהשוואה לק?...

Discussion

מאמר זה דיווח ודן ביצירה ואימות של גישה כירורגית חדשה להסרת EBDS של עכברי ילודים מורדמים. ממצאים מיקרוסקופיים והיסטולוגיים מגלים כי הגישה מזהה במהירות EBDs ומנתחת אותם בסמוך לשולי הצינור, אפילו בעכברים ילודים. רק כלי ניתוח ומיקרוסקופ עם הגדלה של 20x נדרשים לפרוטוקול המתואר. יתר על כן, הגישה מאפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides