Disección extrahepática de las vías biliares y la vesícula biliar en neonatos de ratón de nueve días de edad

Resumen

Para la observación de los trastornos murinos del conducto biliar neonatal, se requiere un conducto biliar intacto y una preparación eficiente. Por lo tanto, se desarrolló con éxito un nuevo enfoque para aislar todo el sistema de vías biliares extrahepáticas en neonatos murinos mientras se mantenía la integridad del conducto biliar.

Resumen

La disección de los conductos biliares neonatales murinos se ha descrito como difícil. El objetivo principal del procedimiento operativo estándar descrito es el aislamiento del conducto biliar extrahepático (EBD) en neonatos de ratón sin dañar el conducto biliar durante la preparación. Debido a su preparación excepcionalmente cercana en comparación con la línea celular de colangocitos y la recolección de todo el sistema de conductos biliares extrahepáticos (EBDS), el enfoque descrito es extremadamente útil en la investigación de modelos animales de trastornos del conducto biliar en recién nacidos, como la atresia biliar. Después de la eutanasia, se accedió a la cavidad peritoneal y se extrajeron el sistema de conductos biliares, el duodeno y el hígado con la única resección en bloque (EbR). La muestra extraída se coloca en una estera de espuma, y el EBD se disecciona de las células contaminantes de forma atraumática sin el contacto necesario. La disección de todo el EBDS es una ventaja significativa de este método. Se debe tener precaución debido al pequeño tamaño y cantidad de tejido del conducto biliar. Usando la técnica descrita, no hay daño a los colangiocitos. Además, la pureza de la técnica es reproducible (n = 10). Por lo tanto, se pueden recolectar muestras óptimamente comparables. Además, no se daña el tejido del conducto biliar, ya que se puede evitar cualquier contacto con el sistema de conductos biliares durante la preparación, dejando el líquido biliar dentro de la vesícula biliar. Lo más importante es que, mientras se realizaba la disección final de la vesícula biliar y el conducto biliar, se utilizaron microinstrumentos atraumáticos solo ligeramente laterales del conducto biliar sin apretarlo. Esta es la clave para una muestra limpia e intacta, y esencial para una mayor investigación histológica o el aislamiento de colangiocitos. En resumen, la innovadora técnica de disección descrita permite a los operadores especialmente inexpertos con el equipo necesario aislar el EBDS de la manera más limpia posible.

Introducción

La génesis y progresión de colangiopatías como la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria (CEP) y la colangitis biliar primaria (CBP) son desconocidas o incompletas ^1,2. La comprensión limitada del origen y la progresión de esas enfermedades conduce a una escasez de opciones terapéuticas³. El obstáculo más difícil en el estudio de los trastornos neonatales del conducto biliar es obtener una comprensión molecular de la fisiopatología. Una de las claves esenciales para una mejor comprensión de la patología molecular es la mejor observación posible del tejido afectado. Para evitar la reducción de la comparabilidad y las discrepancias entre las investigaciones, como la observación de la posible etiología viral de la atresia biliar⁴, surge la necesidad de la mejor preparación posible y el intercambio de las técnicas de disección realizadas. Una preparación pura del tejido diana es necesaria para investigaciones microscópicas posteriores o cultivos de células de reproducción y organoides 3D. Sin embargo, en los trastornos neonatales murinos, las muestras de tejido son raras y solo ocurren en una pequeña cantidad debido al tamaño muy pequeño. En cuanto a los trastornos de las vías biliares, se han descrito dificultades en una preparación limpia de las vías biliares en neonatos murinos⁵. Debido a la etapa neonatal de desarrollo, la diferenciación tisular no está demasiado avanzada, lo que complica la preparación y aumenta la dificultad en comparación con la preparación de muestras adultas. Por lo tanto, el grupo de trabajo operativo investigó una estrategia novedosa para preparar el EBDS en un modelo de ratón neonatal. En el presente estudio, la técnica permite una disección eficiente de cada muestra.

El sistema de conductos biliares se coloca por vía intraperitoneal en la parte superior derecha del abdomen, que surge del hígado. La vesícula biliar se encuentra debajo de la superficie visceral del lóbulo derecho del hígado. El conducto biliar, junto con la vena porta y la arteria hepática, está incrustado en el ligamento hepatoduodenal. Se une al hígado y al duodeno directamente y drena el líquido biliar en el duodeno⁶. Anatómicamente, el conducto biliar se divide en los conductos hepáticos derecho e izquierdo, el conducto hepático común, el conducto cístico y el conducto colédoco, que está formado por la confluencia del conducto cístico y el conducto hepático común⁷. Este eventualmente vacía el líquido biliar y la saliva del conducto pancreático hacia el duodeno a través de la ampolla de Vater.

Los colangiocitos recubren el conducto biliar intra y extrahepáticamente, habitando en un nicho anatómico complicado donde ayudan en la producción de bilis y la homeostasis⁸. El líquido biliar pasa estas células epiteliales especializadas en altas concentraciones diariamente. En particular, el mantenimiento del paraguas HCO3- es muy importante para proteger contra la toxicidad de los ácidos biliares⁹. Los colangiocitos son la primera línea de defensa en el sistema hepatobiliar contra, por ejemplo, microorganismos luminales¹⁰. La eficacia de defensa de los colangiocitos contra las agresiones tóxicas puede verse debilitada por la predisposición genética. Una sobrecarga tóxica causa daño y destrucción y, por lo tanto, puede conducir a colangiopatías. Además, el conducto biliar en desarrollo no es completamente capaz de todos los mecanismos de autoprotección, lo que lleva a una mayor susceptibilidad a las toxinas ambientales en los conductos biliares neonatales¹¹.

Protocolo

Tras la aprobación ética (N045/2021), se observaron neonatos machos y hembras de ratones C57BL/6 hasta los 9 días de edad. Los animales nacieron y fueron proporcionados con fines experimentales por la instalación de animales del Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemania. Los neonatos fueron alojados en una jaula junto con sus animales parentales. Las condiciones ambientales se controlaron en temperatura (20-24 °C), ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h y humedad relativa de 40%-70%.

1. Preparación experimental

1. Prepare el equipo requerido para la operación quirúrgica, incluyendo tijeras, fórceps, etc. (ver Tabla de materiales).
2. Coloque los instrumentos desinfectados y esterilizados en autoclave sobre una superficie estéril junto a la mesa de operaciones.
3. Eutanasia a un ratón neonatal de edad P9 rápidamente por decapitación con una tijera operativa. Coloque el cuerpo del ratón neonato sacrificado en un campo de operación estéril. Diseccionar los EBDS en neonatos de ratón de 9 días de edad (paso 5).
   NOTA: El procedimiento de disección descrito le da a cualquier científico las herramientas adecuadas para eliminar el EBDS de ratones neonatales y mayores. Cuanto más viejo es el ratón, más fácil es la preparación.

2. Acceso a la cavidad peritoneal

1. Agarre la piel por encima de la ubicación de la vejiga urinaria con fórceps. Incide un orificio de 2 mm de diámetro en la piel con tijeras, sin dañar el peritoneo y las estructuras subyacentes. Expanda el corte hasta la ubicación de la decapitación, siguiendo la línea axilar delantera izquierda. Retire la piel del lado izquierdo al derecho con los fórceps atraumáticos.
2. Agarre el peritoneo que rodea el bazo. Levántelo suavemente hasta que el peritoneo se asemeje a una estructura similar a una tienda de campaña y corte un orificio de 1 mm de diámetro en el centro. Espere a que la "tienda peritoneal" se llene de aire. Utilice un aumento microscópico de 10x para este y los siguientes pasos.
3. Corte el peritoneo en una ventana enmarcada por las costillas inferiores, ambas regiones abdominales laterales y el área inferior de la vejiga para garantizar el acceso completo al hígado, el sistema de conductos biliares, el estómago, el intestino delgado y el colon.
   NOTA: Para mejorar el acceso al hígado, se puede realizar una incisión adicional, eliminando las tres costillas más bajas dejando intactas las estructuras del proceso xifoide, el ligamento falciforme, el hígado y el conducto biliar. La vista del hígado es fácil de obtener.

3. Examen de la vesícula biliar y los conductos biliares

NOTA: Asegúrese de mantener la muestra húmeda regularmente durante todos los pasos siguientes.

1. Tire cuidadosamente del proceso xifoide en una posición craneoventral para examinar la vesícula biliar.
   NOTA: La tensión en el ligamento falciforme aumenta con este movimiento, y la vesícula biliar adjunta se hace visible.
   1. Realice solo un ligero tirón para evitar el desgarro incontrolable del ligamento falciforme, lo que podría provocar el desgarro de la vesícula biliar del sistema de conductos biliares. Libere la tracción del proceso xifoide antes del siguiente paso.
2. Tire suavemente hacia abajo del duodeno para liberar el sistema de conductos biliares.
   NOTA: A medida que aumenta la tensión en el ligamento hepatoduodenal, el tejido del conducto biliar se hace visible.

4. Resección en bloque

1. Realice la movilización en bloque inferior siguiendo los pasos a continuación.
   1. Identifique la papila duodenal, que conecta el sistema de conductos biliares con el duodeno.
   2. Corte a través del duodeno aproximadamente 2 cm desde el lado lateral derecho de la papila.
   3. Corte a través del área pilórica. Asegúrese de que el contenido del estómago esté presente en el área pilórica entre el lugar de corte y la papila duodenal.
      NOTA: Este es un paso importante para la seguridad posterior de la orientación para la correcta ubicación de las partes duodenales orales y aborales.
2. Realizar la movilización en bloque superior.
   1. Tire suavemente del proceso xifoide y obtenga acceso al ligamento falciforme.
   2. Realice un corte de 1 cm de largo a través del ligamento falciforme, lo más cerca posible del proceso xifoide, entre la vesícula biliar y el proceso xifoide. Asegúrese de no dañar la vesícula biliar.
   3. Corte a través de las siguientes estructuras de conexión entre el hígado y el tórax: esófago, vena cava inferior, aorta torácica, todos los ligamentos que rodean el área desnuda del hígado y todas las conexiones de tejido dorsalmente restantes.
      NOTA: El ejemplo en bloque está completamente diseccionado. Contiene el hígado, el sistema de conductos biliares y el cuerpo duodenal, que está conectado con la región pilórica del estómago.

5. Disección final de vesícula biliar y vías biliares

1. Realice la preparación gruesa siguiendo los pasos a continuación.
   1. Coloque la muestra en bloque en una almohadilla de espuma que generalmente se usa para la deshidratación. Utilice un aumento microscópico de 20x y dos pinzas atraumáticas microquirúrgicas con un tamaño máximo de punta de 6 mm para este y los siguientes pasos.
   2. Ensamble la muestra en la almohadilla de espuma. Reorganice la muestra en la posición anatómica correcta. Aplanar la parte oral y aboral del duodeno, realizando un movimiento suave.
   3. Comience el movimiento en la papila duodenal y continúe hasta los bordes cortantes usando fórceps atraumáticos. Alise el contenido pulposo blanco del estómago, lo que solo ocurrirá en la parte oral del duodeno. Asegúrese de identificar la parte oral y aboral del duodeno para descartar una probable rotación del conducto biliar.
   4. Cortar grandes restos de tejido hepático para comenzar la disección del conducto biliar.
2. Realice el aislamiento final.
   1. Presione suavemente el tejido hepático restante en los poros de la estera de espuma. Asegúrese de que los movimientos de raspado comiencen desde el sistema de conductos biliares y conduzcan a los límites del hígado.
   2. Transfiera la muestra a una posición más limpia en la estera de espuma después de algunos movimientos de raspado en varias direcciones. Utilice la ventaja de un tejido hepático menos comprimido en segundo plano para optimizar la vista y lograr la mejor diferenciación posible entre EBDS y células no deseadas. Raspa el tejido hepático del conducto biliar hasta que no quede nada, o lo menos posible, del tejido hepático.
   3. Procesar el ligamento hepatoduodenal hasta que quede el EBDS aislado. Elimine los vasos sanguíneos intraligamentosos como la arteria hepática, la vena porta y los restos pequeños. Retira este delicado filamento, con un tirón suave y un cuidado alto, hacia el lado lateral izquierdo. Este paso de disección podría haber comenzado involuntariamente o parcialmente completado durante la extirpación previa del tejido hepático, lo que al final conduce al mismo resultado.
      NOTA: Los vasos sanguíneos están emergiendo como un filamento blanco y muy delicado de aproximadamente 3-5 mm por vía oral de la papila duodenal y se unen al ligamento hepatoduodenal desde el lado lateral izquierdo, acumulándose con el conducto biliar a la tríada glissoniana. Con la finalización de este paso, la muestra final queda completamente aislada. Si hay una necesidad de un registro, las imágenes se pueden capturar después de organizar las estructuras del conducto biliar en su posición anatómica (Figura 1). Se recomienda realizar los últimos pasos de preparación en una estera de espuma porque la muestra no se pegará tanto a la superficie del campo de operación. Si los poros están húmedos, el conducto biliar levita o flota. Al mover la muestra, no se pegará tan firmemente como lo haría con la preparación en el paño de operación, lo que no provocará rasgado mientras se mueve la muestra.

6. Preparación para el análisis histológico

1. Coloque la muestra aislada en una solución tamponada, un medio especial o fijadores que contengan formalina (consulte la Tabla de materiales) tan pronto como sea posible después de la disección.
2. Elija una solución de almacenamiento adecuada en función de los pasos de procesamiento planificados adicionales.
   PRECAUCIÓN: Use fijadores que contengan formalina solo debajo de una salida de aire debido a la toxicidad aguda, la corrosividad y los diversos peligros para la salud.
   NOTA: En el estudio presentado, las muestras de EBDS se han insertado en paraformaldehído, deshidratadas e incrustadas en parafina. Se han almacenado a temperatura ambiente y se han enfriado antes de seccionarlos. En un gabinete de calentamiento, las rodajas de 2 μm se mantuvieron durante la noche y se tiñeron con hematoxilina convencional y eosina⁴ (ver Tabla de materiales).

Resultados

La Figura 1A muestra el EBDS de un neonato murino, que fue diseccionado con la técnica descrita. Microscópicamente, no hay más tejido hepático visible. El tejido hepático se ha eliminado durante los pasos finales de aislamiento del protocolo y podría distinguirse fácilmente del tejido del conducto biliar en cuanto a color y consistencia. La Figura 1B muestra la muestra aislada en comparación con una escala milimétrica. La longitud de la EBD (medida desd...

Discusión

Este artículo informó y discutió la creación y validación de un nuevo enfoque quirúrgico para eliminar el EBDS de ratones neonatales sacrificados. Los hallazgos microscópicos e histológicos revelan que el enfoque detecta rápidamente las EBD y las disecciona cerca de los márgenes del conducto, incluso en ratones neonatos. Solo se requieren instrumentos quirúrgicos y un microscopio con un aumento de 20x para el protocolo descrito. Además, el enfoque permite el aislamiento de todo el EBDS. La técnica es altamen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides