JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا العمل ، تم وصف مقايسة مضان الكالسيوم عالية الإنتاجية داخل الخلايا لألواح 384 بئرا لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة على مستقبلات البروتين G المقترنة المؤتلفة (GPCRs). يتم التعبير عن الهدف ، مستقبل كينين من قراد حمى الماشية ، Rhipicephalus microplus ، في خلايا CHO-K1. يحدد هذا الفحص الناهضات والخصوم باستخدام نفس الخلايا في مقايسة "الإضافة المزدوجة" الواحدة.

Abstract

تمثل مستقبلات البروتين G المقترنة (GPCRs) أكبر عائلة فائقة من المستقبلات وهي أهداف للعديد من الأدوية البشرية. تستخدم صناعة الأدوية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) لمكتبات الجزيئات الصغيرة العشوائية مقابل GPCRs لاكتشاف الأدوية الخاصة بالهدف. في هذه الدراسة ، تم استخدام HTS لتحديد روابط جديدة صغيرة الجزيئات من GPCRs العصبية الخاصة باللافقاريات كتحقيقات للدراسات الفسيولوجية لنواقل مسببات الأمراض البشرية والبيطرية القاتلة.

تم اختيار مستقبل كينين الخاص باللافقاريات كهدف لأنه ينظم العديد من العمليات الفسيولوجية المهمة في اللافقاريات ، بما في ذلك إدرار البول والتغذية والهضم. علاوة على ذلك ، فإن علم الأدوية للعديد من GPCRs اللافقارية ضعيف الوصف أو لا يتميز على الإطلاق. لذلك ، فإن علم الصيدلة التفاضلي لهذه المجموعات من المستقبلات فيما يتعلق ب GPCRs ذات الصلة في metazoans الأخرى ، وخاصة البشر ، يضيف المعرفة إلى العلاقات بين الهيكل والنشاط ل GPCRs كعائلة فائقة. تم تطوير اختبار HTS للخلايا في 384 لوحة بئر لاكتشاف روابط مستقبلات كينين من قراد حمى الماشية ، أو قراد الماشية الجنوبي ، Rhipicephalus microplus. تم التعبير عن مستقبل كينين القراد بثبات في خلايا CHO-K1.

مستقبلات كينين ، عند تنشيطها بواسطة ببتيدات كينين العصبية الداخلية أو غيرها من ناهضات الجزيئات الصغيرة ، تؤدي إلى إطلاق Ca2+ من مخازن الكالسيوم إلى السيتوبلازم. يمكن لمقايسة مضان الكالسيوم هذه جنبا إلى جنب مع نهج "الإضافة المزدوجة" اكتشاف ناهض وظيفي وجزيئات "ضرب" مضادة في نفس لوحة الفحص. تم إجراء كل اختبار باستخدام لوحات المخدرات التي تحمل مجموعة من 320 جزيئا صغيرا عشوائيا. تم الحصول على عامل Z موثوق به يبلغ 0.7 ، وتم تحديد ثلاثة جزيئات ناهضة وجزيئين مصادين عندما كان HTS عند تركيز نهائي 2 ميكرومتر. يمكن تكييف مقايسة مضان الكالسيوم المبلغ عنها هنا لفحص GPCRs الأخرى التي تنشط سلسلة إشارات Ca2+ .

Introduction

تمثل مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs) ، الموجودة من الخميرة إلى البشر ، أكبر عائلة فائقة من المستقبلات في العديد من الكائنات الحية1. يلعبون أدوارا حاسمة في تنظيم جميع العمليات البيولوجية تقريبا في الحيوانات. هناك 50-200 GPCRs في جينوم المفصليات ، مما يعني أنها تمثل أكبر عائلة فائقة لمستقبلات الغشاء2. يتم تصنيفها إلى ست فئات رئيسية ، A-F ، بناء على تشابه تسلسلها ووظائفها3. تقوم GPCRs بتحويل إشارات مختلفة خارج الخلية ، مثل تلك الخاصة بالهرمونات ، والببتيدات العصبية ، والأمينات الحيوية ، والغلوتامات ، والبروتون ، والبروتينات الشحمية ، والفوتونات4. يقترن GPCRs ببروتينات G غير المتجانسة (Gα و Gβ و Gγ) لنقل إشارات المصب. GPCRs المقترنة ببروتينات Gαs أو Gαi / o تزيد أو تنقص ، على التوالي ، مستويات أحادي فوسفات الأدينوزين الحلقي 3 '، 5'-cyclic (cAMP) عن طريق تنشيط أو تثبيط سيكلاز الأدينيل. تحفز GPCRs المقترنة ب Gαq / 11 إطلاق الكالسيوم من مخازن الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية عن طريق تنشيط مسار الفوسفوليباز C (PLC) -الإينوزيتول-1،4،5-ثلاثي الفوسفات (IP3). تعمل GPCRs المقترنة ب Gα12/13 على تنشيط عوامل تبادل النوكليوتيدات RhoGTPase 5,6. GPCRs هي هدف أكثر من 50 ٪ من الأدوية البشرية ومبيد للقراد ، amitraz4. وبما أن هذه المحطات تنقل مثل هذه الإشارات المتنوعة، فإنها تعد أهدافا واعدة لتطوير مبيدات آفات جديدة تعطل الوظائف الفسيولوجية الخاصة باللافقاريات.

الهدف من HTS هو تحديد جزيئات الضرب التي يمكنها تعديل وظائف المستقبلات. يتضمن HTS تطوير الفحص والتصغير والأتمتة7. تشارك GPCRs المفصلية العصبية في معظم الوظائف الفسيولوجية ، مثل التنمية ، وطرح الريش و ecdysis ، والإفراز ، وتعبئة الطاقة ، والتكاثر4. تشير معظم GPCRs الببتيد العصبي للمفصليات والميتازوان من خلال سلسلة إشارات الكالسيوم2،6،8،9،10 ، كما هو الحال في مستقبلات الببتيد المثبط للعضل ومستقبلات SIFamide للقراد الأسود Ixodes scapularis. روابطهم معادية في مقايسات حركية الأمعاء الخلفية ، حيث تثير SIF انكماشا ويثبطها MIP11,12. ينظم مستقبل يشبه NPY لبعوضة الحمى الصفراء ، Aedes aegypti ، مضيفة أنثى تسعى13. بالمقارنة مع مقايسات تعبئة الكالسيوم البديلة الأخرى مثل مقايسة التلألؤ الحيوي للكالسيوم aequorin14 ، فإن مقايسة مضان الكالسيوم سهلة التنفيذ ، ولا تتطلب نقل بروتينات الكشف عن الكالسيوم المؤتلف الأخرى ، وهي فعالة من حيث التكلفة. تنتج مقايسة مضان الكالسيوم إشارة طويلة مقارنة بالإشارة الحركية السريعة التي تم الحصول عليها في مقايسة التلألؤ الحيوي للكالسيوم aequorin14,15.

في المثال هنا ، تم التعبير عن مستقبل كينين من قراد حمى الماشية ، Rhipicephalus microplus ، بشكل مؤتلف في خط خلية CHO-K1 واستخدم في مقايسة مضان الكالسيوم. لا يوجد سوى جين واحد لمستقبلات كينين موجود في R. microplus. إشارات المستقبل من خلال مسار إشارات يعتمد على بروتين Gq ويؤدي إلى تدفق Ca2+ من مخازن الكالسيوم إلى الفضاء داخل الخلايا16. يمكن اكتشاف هذه العملية وقياسها بواسطة الفلوروفور ، الذي يثير إشارة مضان عند ربط أيونات الكالسيوم (الشكل 1).

مستقبلات كينين هي GPCR خاص باللافقاريات ، والذي ينتمي إلى مستقبلات تشبه رودوبسين من الفئة أ. Kinin هو ببتيد عصبي قديم للإشارات موجود في Mollusca و Crustacea و Insecta و Acari4،17،18. تفتقر غمدية الأجنحة (الخنافس) إلى نظام إشارات كينين ؛ في البعوض Aedes aegypti ، لا يوجد سوى مستقبل كينين واحد يربط ثلاثة aedeskinins ، في حين أن ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر لديها مستقبل كينين واحد مع ذبابة الفاكهة كرابط فريد19،20،21. لا توجد كينين متماثل أو مستقبلات كينين في الفقاريات. على الرغم من أن الوظيفة الدقيقة للكينين غير معروفة في القراد ، إلا أن الإناث الصامتات مستقبلات الكينين RNAi من R. microplus تظهر انخفاضا كبيرا في اللياقة الإنجابية22. Kinins هي الببتيدات متعددة الخواص في الحشرات. في ذبابة الفاكهة الميلانية ، يشاركون في كل من الأنظمة التنظيمية العصبية المركزية والمحيطية23 ، ما قبل ecdysis 24 ، التغذية 25 ، الأيض 26 ، وأنماط نشاط النوم26,27 ، وكذلك حركة اليرقات 28. تنظم Kinins تقلص الأمعاء الخلفية ، إدرار البول ، والتغذية في البعوض A. aegypti29،30،31. تحتوي ببتيدات الكينين على خماسي الببتيد الطرفي C المحفوظ Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2 ، وهو الحد الأدنى للتسلسل المطلوب للنشاط البيولوجي32. إن خصوصية المفصليات ، وصغر حجم الليجند الداخلي ، مما يجعلها قابلة للتداخل الجزيئي الصغير ، والوظائف متعددة الاتجاهات في الحشرات تجعل مستقبلات كينين هدفا واعدا لمكافحة الآفات4.

يسمح اختبار "الإضافة المزدوجة" (الشكل 2) بتحديد الناهضات أو الخصوم في نفس اختبار HTS15. تم تكييفه من مقايسة "الإضافة المزدوجة" التي يشيع استخدامها في صناعة الأدوية لاكتشاف الأدوية33. باختصار ، تسمح الإضافة الأولى للأدوية في صفيحة الخلية بتحديد الناهضات المحتملة في المكتبة الكيميائية عند اكتشاف إشارة مضان أعلى مقارنة بتطبيق التحكم في المذيبات. بعد 5 دقائق من الحضانة مع هذه الجزيئات الصغيرة ، يتم تطبيق ناهض معروف (كينين ببتيد) على جميع الآبار. تلك الآبار التي استقبلت بشكل عشوائي مضادا من لوحة الدواء تظهر إشارة مضان أقل عند إضافة ناهض مقارنة بآبار التحكم التي تلقت المذيب في الإضافة الأولى. يسمح هذا الفحص بعد ذلك بتحديد الناهضات والخصوم المحتملين بنفس الخلايا. في مشروع HTS القياسي ، سيتم التحقق من صحة هذه الجزيئات الضاربة من خلال فحوصات الاستجابة للجرعة ومقايسات النشاط البيولوجي الإضافية ، والتي لا تظهر هنا.

figure-introduction-6360
الشكل 1: رسم توضيحي لآلية فحص مضان الكالسيوم. يحفز بروتين Gq مسار إشارات الكالسيوم داخل الخلايا. تم التعبير عن مستقبل كينين (مستقبل البروتين المقترن بالبروتين G) بشكل مؤتلف في خلايا CHO-K1. عندما يرتبط الربيطة الناهضة بالمستقبل ، فإن بروتين Gq المرتبط بمستقبل كينين ينشط PLC ، الذي يحفز تحويل جزيء PIP2 إلى IP3 و DAG. ثم يرتبط IP 3 ب IP3R على سطح الشبكة الإندوبلازمية ، مما يؤدي إلى إطلاق Ca 2+ في السيتوبلازم ، حيث ترتبط أيونات Ca2+ بالفلوروفورات وتثير إشارة مضانة. يمكن الحصول على إشارة التألق عن طريق الإثارة عند 490 نانومتر واكتشافها عند 514 نانومتر. الاختصارات: GPCR = G مستقبلات البروتين المقترنة ؛ PLC = فوسفوليباز ج ؛ PIP2 = فوسفاتيديلينوسيتول 4،5-ثنائي الفوسفات ؛ IP3 = اينوزيتول ثلاثي الفوسفات; DAG = دياسيل جليسرول ؛ IP3 R = مستقبل IP3. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-introduction-7596
الشكل 2: سير العمل للفحص عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة على مستقبل مقترن بالبروتين G معبرا عنه في خلايا CHO-K1. (أ) تمت إضافة خلايا CHO-K1 المؤتلفة التي تعبر بثبات عن مستقبل كينين إلى لوحة 384 بئرا (10000 خلية / بئر) باستخدام نظام معالجة السوائل (25 ميكرولتر / بئر) وتم تحضينها في حاضنة CO2 مرطبة لمدة 12-16 ساعة. وأضيف مخزن الفحص الذي يحتوي على صبغة الفلورسنت (25 ميكرولتر/بئر) إلى صفيحة الخلية باستخدام نظام مناولة السوائل. تم تحضين الصفيحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتمت موازنتها عند RT لمدة 30 دقيقة أخرى. (ج) تم قياس إشارة مضان الخلفية للخلايا في كل بئر باستخدام قارئ لوحة. (د) تمت إضافة المحاليل الدوائية من لوحة مكتبة 384 بئرا ومذيب فارغ (جميعها عند 0.5 ميكرولتر / بئر) إلى لوحة الفحص الخلوي باستخدام نظام معالجة السوائل. (ه) تم قياس استجابات مضان الكالسيوم الخلوي باستخدام قارئ اللوحة مباشرة بعد إضافة محاليل الدواء؛ تم اختيار المركب (المركبات) التي تثير إشارات مضان أعلى من المتوسط كضربة (ضربات) ناهضة. تم الكشف عن نتائج المضاد التي تمنع GPCR (الرمز أدناه) بعد إضافة ناهض الببتيد خلال الخطوة G. (F) في نفس لوحة الفحص ، بعد 5 دقائق من حضانة الخلايا بمركبات الغربلة ، تمت إضافة ببتيد ناهض داخلي المنشأ Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) لمستقبل كينين القراد إلى كل بئر (1 ميكرومتر). (ز) تم قياس استجابات التألق الخلوي بعد إضافة الببتيد الناهض بواسطة قارئ اللوحة على الفور. تم اختيار المركب (المركبات) التي تثبط إشارة التألق كضربة (ضربات) مضادة. الاختصارات: GPCR = G مستقبلات البروتين المقترنة ؛ RT = درجة حرارة الغرفة ؛ RFU = وحدات مضان نسبية. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Protocol

1. صيانة الخلايا

ملاحظة: تم تطوير خط خلية CHO-K1 الذي يعبر بثبات عن مستقبل كينين من R. MICROPLUS ، المسمى BMLK3 ، بواسطة HOLMES ET AL.16. يتم عرض تفاصيل تطوير خط الخلية في مكان آخر14. يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

  1. قم بتنمية خط الخلايا المؤتلف في وسائط انتقائية (وسط F-12K يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 800 ميكروغرام / مل كبريتات G418) لضمان التعبير عن المستقبل المستهدف. قم بتخزين الخلايا التي تعبر عن المستقبل بثبات في 1 مل من وسط التجميد (90٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) في كريوفيال 2 مل في مجمد −80 درجة مئوية.
    ملاحظة: لتخزين الخلايا المجمدة على المدى الطويل ، قم بتخزينها في النيتروجين السائل.
  2. قم بتسخين جميع الوسائط قبل زراعة الخلية. في خزانة السلامة الحيوية ، انقل 13 مل من الوسط الانتقائي المسخن مسبقا (وسط F-12K يحتوي على 10٪ FBS و 800 ميكروغرام / مل كبريتات G418) إلى دورق T-75 ، واحتفظ به في خزانة السلامة الحيوية. قم بإذابة قارورة واحدة من خلايا BMLK 3 المجمدة (~ 1.5 × 106 خلايا) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة2-3 دقائق. نقل الخلايا المذابة إلى دورق T-75. الحفاظ على الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ما لم ينص على خلاف ذلك.
  3. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء (1-2 أيام) ، قم بتسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية باستثناء محلول ملحي دولبيكو المخزن بالفوسفات (DPBS) ، والذي يتم الاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بإزالة الوسط المستهلك من دورق T-75 ، واغسل الخلايا لمدة 5 ثوان مع 10 مل من DPBS عن طريق تحريك القارورة برفق ، ثم قم بإزالة DPBS باستخدام ماصة مصلية.
    ملاحظة: تظهر صورة لخلايا CHO-K1 عند التقاء 90٪ في Lu et al.14.
  4. افصل الخلايا عن دورق T-75 بإضافة 2 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA ، واحتضانها لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. بعد ذلك ، أضف 8 مل من الوسط الانتقائي ، واخلطه جيدا عن طريق السحب وإطلاق 2x-3x برفق باستخدام نفس الماصة المصلية.
  5. انقل 2 مل من معلق الخلية (~ 1 × 106 خلايا) من الخطوة 1.4 إلى قارورة T-75 جديدة تحتوي على 10 مل من الوسط الانتقائي الدافئ. تنمو الخلايا لمدة 1-2 أيام في الحاضنة حتى تصل إلى 90 ٪ التقاء.
  6. استخدم الخلايا للفحص باتباع الخطوات التالية ، أو كرر الخطوات 1.4-1.5 مرة أو مرتين قبل استخدام الخلايا في الفحص.
    ملاحظة: لا تتجاوز ثلاثة إلى أربعة مقاطع ، لأن إشارة الفحص مع خطوط خلية معينة قد تصبح أضعف مع المزيد من الممرات.

2. مقايسة مضان الكالسيوم

  1. معطف لوحة الخلية.
    1. استخدم نظام مناولة السوائل الموضوعة داخل خزانة السلامة البيولوجية لجميع خطوات سحب العينات في ألواح البئر البالغ عددها 384 بئرا. قم بإنشاء برامج مخصصة للسحب في ألواح 384 بئر31 (الجدول التكميلي S1). قم بتغطية الألواح المعقمة المكونة من 384 بئرا مسبقا. في خزانة السلامة الأحيائية ، قم بتحميل 10 ميكرولتر / بئر من محلول مائي من Poly-D-lysine (PDL) بمعدل 0.05 مجم / مل في كل لوحة ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. أفرغ الطبق عن طريق قلب اللوحة بسرعة ونشافها برفق على مناشف ورقية معقمة. بعد ذلك ، اشطف كل بئر ب 10 ميكرولتر من الماء ، وأفرغ الطبق ، واترك الطبق حتى يجف في خزانة السلامة الحيوية طوال الليل بدون غطاء. أغلق الطبق بالغطاء ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المطلية في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. اليوم 1
    1. أخرج صفيحة الدواء (100 ميكرومتر في 90٪ DPBS + 10٪ DMSO ، سيكون التركيز النهائي في البئر ل HTS 2 ميكرومتر) المخزن في الفريزر −20 درجة مئوية ، وضعه في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تخطيط لوحة الدواء: تحتوي كل لوحة من 384 بئرا (24 عمودا × 16 صفا) على 320 بئرا بها مركبات مكتبة مختلفة و 64 بئرا بها مذيب فارغ (DPBS تحتوي على 10٪ DMSO) ، مرتبة في أربعة أعمدة ، مع عمودين على حافة كل جانب. انظر الجدول التكميلي S2 لتخطيط اللوحة.
    2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪ -90٪ في دورق T-75 ، افصل الخلايا عن دورق T-75 كما هو موضح أدناه. قم بتسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية باستثناء DPBS (درجة حرارة الغرفة).
      1. قم بإزالة الوسط المستهلك ، واغسل الخلايا ب 10 مل من DPBS ، ثم قم بإزالة DPBS. افصل الخلايا عن دورق T-75 باستخدام 2 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة ، وأضف 8 مل من الوسط الانتقائي ، وانقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل إلى جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق.
      2. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط F-12K الذي يحتوي على 1٪ FBS و 400 ميكروغرام / مل كبريتات G418. احتفظ بالتعليق في خزانة السلامة الحيوية أثناء تحديد عدد الخلايا.
    3. تحديد كثافة الخلية من التعليق لمزيد من التخفيف: امزج 20 ميكرولتر من معلق الخلية في 20 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق ، ثم قم بتحميل 20 ميكرولتر من الخليط في غرفة عد الخلايا ليتم قراءتها بواسطة عداد الخلايا لكثافة الخلية.
    4. قم بتخفيف معلق الخلية في نفس الوسط (وسط F-12K يحتوي على 1٪ FBS و 400 ميكروغرام / مل كبريتات G418) إلى حجم نهائي لا يقل عن 15 مل بكثافة 4 × 105 خلايا / مل.
    5. بذر الخلايا في لوحة 384 بئر المطلية ب PDL. انقل 15 مل من معلق الخلية أعلاه (4 × 105 خلايا / مل) إلى خزان كاشف صديق للسيارات سعة 150 مل. قم بتوزيع 25 ميكرولتر من معلق الخلية (~ 10000 خلية / بئر) في كل بئر من آبار اللوحة البالغ عددها 384 بئرا باستخدام نظام مناولة السوائل في خطوتين. قم بتحميل أطراف منخفضة الاحتفاظ 384 / 12.5 ميكرولتر على رأس معالج السائل ، وشفط 12.5 ميكرولتر من الخزان (السرعة 5.2 ميكرولتر / ثانية) ، والاستغناء عنها في كل بئر (السرعة: 3.1 ميكرولتر / ثانية).
    6. كرر السحب كما في الخطوة السابقة 2.2.5 للوصول إلى 25 ميكرولتر لكل بئر. بعد ذلك ، احتضن اللوحة طوال الليل (14-16 ساعة) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الحاضنة المرطبة.
      ملاحظة: نظرا لأن الحد الأقصى لحجم السحب هو 12.5 ميكرولتر لهذا الرأس المحدد ، يتم إجراء السحب ل 25 ميكرولتر في خطوتين.
  3. اليوم 2
    1. في صباح اليوم التالي ، تحقق من لوحة الخلية المغطاة تحت المجهر ؛ إذا لم تكن متقاربة ، فانتظر حتى تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء.
    2. تحضير محلول مخزون من صبغة الفلورسنت: أعد تعليق صبغة الفلورسنت المجففة بالتجميد في 100 ميكرولتر من DMSO ، وتجنب الضوء المباشر على محلول المخزون. لف الأنبوب بورق الألمنيوم لمنع التبييض الضوئي.
      ملاحظة: يمكن أن يتم نقل المخزون إلى 15 ميكرولتر لكل فحص لوحة لتجنب التجميد والذوبان المتكرر ؛ يمكن تخزين القسمة في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    3. في خزانة السلامة الحيوية مع إطفاء أضوائها ، قم بإعداد صبغة تحميل (1x) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ملفوف بورق الألمنيوم ، يجمع بين 15 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة الفلورية (من الخطوة 2.3.2) وبقية مكونات المجموعة سابقة التسخين (37 درجة مئوية): 13.5 مل من 1x HHBS (مخزن هانك المؤقت مع 20 mM HEPES) و 1.5 مل من الكاشف B (مثبط تدفق الصبغة).
      ملاحظة: يضيء ضوء الغرفة أثناء هذه الخطوة.
    4. أغلق الأنبوب واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب برفق عدة مرات (عادة 3-5x).
      ملاحظة: يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، ويستخدم خليط صبغة التحميل في غضون 30 دقيقة.
    5. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من الالتقاء ، قم بإزالة الوسط المستهلك من لوحة الفحص التي تحتوي على 384 بئرا عن طريق قلب اللوحة بسرعة ونشافها برفق على مناشف ورقية معقمة ؛ كرر هذه الحركة 2x-3x لإزالة كل السائل من اللوحة. تخلص من المناشف المبللة.
    6. أطفئ معظم المصابيح الاصطناعية المباشرة في الغرفة (اترك مصباحا مكتبيا ناعما وخافتا مضاء أو مشابها للسماح بظروف عمل مرئية) وفي خزانة السلامة البيولوجية لجميع الخطوات حتى نهاية الفحص (لمدة 1.5 ساعة تقريبا).
    7. ضع 15 مل من صبغة التحميل (1x) من الخطوة 2.3.3 في خزان سهل الاستخدام سعة 150 مل.
      1. نقل 25 ميكرولتر من صبغة التحميل (1x) من الخزان إلى كل بئر باستخدام نظام مناولة السوائل بأطراف منخفضة الاحتفاظ 384 / 12.5 ميكرولتر عن طريق توزيع 12.5 ميكرولتر في كل بئر من اللوحة (سرعة الشفط والاستغناء: 3.8 ميكرولتر / ثانية).
    8. كرر خطوة السحب كما في 2.3.7.1 للوصول إلى حجم نهائي قدره 25 ميكرولتر في كل بئر من اللوحة. قم بتغطية ولف اللوحة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء المحيط.
    9. احتضان لوحة الخلية المغطاة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 المرطبة لمدة 30 دقيقة ، وقم بإزالتها من الحاضنة ، وقم بموازنتها في درجة حرارة الغرفة داخل قارئ اللوحة أو على المقعد ، مع إبقاء اللوحة مغطاة وملفوفة بورق القصدير لمدة 30 دقيقة أخرى. ثم تكون الخلايا جاهزة للفحص عالي الإنتاجية (HTS).
    10. التحضير الكيميائي: قم بتدوير لوحة الدواء من الخطوة 2.2.1 عند 1200 × جم في جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
      1. تحضير محلول ببتيد ناهض 10x من Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) (10 ميكرومتر) عن طريق تعليق 100 نانومول من الببتيد المجفف بالتجميد في 10 مل من 1x HHBS يحتوي على 0.1٪ DMSO ، ونقل المحلول إلى خزان صديق تلقائي سعة 150 مل.
    11. قياس إشارة الخلفية: بالنسبة لفحص HTS بالكامل في قارئ اللوحة ، ضمن البروتوكولات ، اختر وضع مضان نقطة النهاية.
      ملاحظة: تتم قراءة إشارة الفلورسنت من أسفل اللوحة بأطوال موجية للإثارة / الانبعاث تبلغ 495 نانومتر / 525 نانومتر.
      1. أدخل لوحة الخلية في قارئ اللوحة. في لوحة العدادات، حدد ضبط الكسب، وحدد بئرا عشوائيا على اللوحة، وقم بتعيينه على أنه 5٪ -10٪ من الحد الأقصى لقيمة التألق القابلة للقياس، وحدد ضبط (قراءة) الارتفاع.
      2. انقر فوق بدء القياس لقراءة اللوحة بأكملها لإشارة مضان الخلفية بوحدات التألق النسبية (RFU).
    12. مقايسة "الإضافة المزدوجة"
      1. باستخدام نظام مناولة السوائل مع أطراف 384 / 12.5 ميكرولتر ، لخلط محلول الدواء في كل بئر من صفيحة الدواء ، ماصة 3x لأعلى ولأسفل 10 ميكرولتر من محلول الدواء (في DPBS تحتوي على 10٪ DMSO) (سرعة السحب: 5.2 ميكرولتر / ثانية) ، و "نضح" 1.5 ميكرولتر من كل بئر من صفيحة الدواء (سرعة الشفط: 1.0 ميكرولتر / ثانية).
      2. "استغناء" 0.5 ميكرولتر من المركبات في لوحة فحص الخلية (سرعة الامتصاص: 1 ميكرولتر / ثانية) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكرومتر في 0.2٪ DMSO.
      3. ضع لوحة الفحص على الفور في قارئ اللوحة بعد إضافة مركبات الغربلة. اقرأ نفس اللوحة في كل من اتجاهات القراءة الأمامية والخلفية. للحصول على هذه القراءات ، حدد برنامجا للقراءة من "البئر 1-384" وعلى الفور من "384-1".
        ملاحظة: تستغرق القراءة في كلا الاتجاهين 2 دقيقة إجمالا. يهدف تصميم القراءة هذا إلى تعويض الانخفاض في قوة الإشارة الذي يحدث أثناء قراءة اللوحة في كل اتجاه. راجع الخطوة 3.1 للاطلاع على تحليلات القراءة.
      4. تخلص من 1 ميكرولتر المتبقية من محلول الدواء في الأطراف عن طريق غمر الأطراف في خزان نفايات سعة 150 مل يحتوي على ~ 50 مل من DPBS (سرعة التوزيع: 1.0 ميكرولتر / ثانية).
      5. احتضان مركبات الغربلة مع الخلايا لمدة 5 دقائق (بما في ذلك 2 دقيقة من قراءة اللوحة) في درجة حرارة الغرفة في خزانة السلامة الحيوية مع إطفاء الأنوار. أضف 3 ميكرولتر من الببتيد الناهض ، Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) ، من الخزان (سرعة الشفط: 3.1 ميكرولتر / ثانية) إلى لوحة الفحص باستخدام نظام مناولة السوائل (سرعة الاستغناء: 3.1 ميكرولتر / ثانية) مع أطراف 384 / 12.5 ميكرولتر.
      6. ضع اللوحة في قارئ اللوحة مباشرة بعد إضافة الببتيد الناهض. اقرأ اللوحة في كل من الاتجاهين الأمامي والخلفي باستخدام نفس البرنامج كما في الخطوة 2.3.12.3

3. تحليل البيانات

  1. باستخدام برنامج التحليل المرتبط بقارئ اللوحة المثبت على جهاز كمبيوتر ، احسب استجابات التألق الخلوي (في RFU) لكلتا القراءتين بعد إضافة المركب الأولى (القراءة الأولى ؛ القراءة الأولى ؛ RFU منذ [الجدول التكميلي S2]) وبعد خطوات إضافة ناهض (القراءة الثانية = RFUالنمل [الجدول التكميلي S2]). يتم الحصول على كل قراءة عن طريق حساب متوسط القيمتين اللتين تم الحصول عليهما (غير المعروضتين) بواسطة قراءات اللوحة الأمامية والخلفية من الخطوة 2.3.12.3 والخطوة 2.3.12.6 ، على التوالي.
    ملاحظة: RFU قبل ، تشير نملة RFU إلى وحدات التألق النسبية لضربات الناهض المحتملة (اقرأ في الخطوة 2.3.12.3) وضربات الخصم المحتملة (اقرأ في الخطوة 2.3.12.6) ، على التوالي.
  2. قم بتصدير جميع مجموعات البيانات الثلاث ، RFU bg و RFU ago و RFU ant ، من برنامج التحليل إلى ثلاثة جداول بيانات منفصلة. سيحتوي كل جدول بيانات على عمودين فقط: موضع البئر و RFU الخام (الملفات غير معروضة هنا).
    ملاحظة: يشير RFU bg إلى RFU للخلفية المقروءة في الخطوة 2.3.11.2.
  3. قم بتنسيق البيانات من جداول البيانات الثلاثة، وقم بتنظيم البيانات المذكورة أعلاه في ملف csv واحد (انظر المثال في الجدول التكميلي S2). اطرح إشارة الخلفية المقروءة من RFU ago و RFUant ، على التوالي (أعمدة G و H في الجدول التكميلي S2).
  4. قم باستيراد ملف csv إلى "منصة بيانات HTS عبر الإنترنت" متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) لتحليل البيانات النهائية (الجدول 1) والتخزين.
  5. احسب يدويا عامل Z لمراقبة الجودة لكل فحص لوحة باستخدام المعادلة (1):
    المعادلة (1):
    figure-protocol-12768(1)
    ملاحظة: يمثل μc- و μc + متوسط RFUs لقراءات نفس الآبار ، والتي تعمل كضوابط سلبية في الإضافة الأولى بعد إضافة المذيب (مذيب فارغ ، n = 64 ؛ الأرقام باللون الأزرق في الجدول التكميلي S2) وتعمل كضوابط إيجابية بعد إضافة الناهض (مذيب فارغ + ناهض ، n = 64 ؛ الأرقام باللون الأرجواني) ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، يمثل σ c و σ c + الانحرافات المعيارية المقابلة (SDs).
  6. حدد يدويا جزيئات الضرب من الخرائط الحرارية على "منصة بيانات HTS عبر الإنترنت" ، واحسب تنشيط النسبة المئوية الطبيعية (NPA) والنشاط المثبط (Io) لضربات الناهض وضربات الخصم باستخدام المعادلة (2) والمعادلة (3):
    figure-protocol-13644(2)
    figure-protocol-13756(3)

النتائج

تم استخدام لوحة دواء داخلية (SAC2-34-6170) تتكون من 320 جزيئا صغيرا عشوائيا لإظهار مقايسة HTS هذه كمثال. كان لدى HTS جودة فحص ممتازة مع عامل Z 0.7 (الجدول 1). يعكس عامل Z هذا جودة الفحص المستقلة عن المركبات المختبرة34. يشير عامل Z البالغ 0.5 أو أكثر إلى نطاق ديناميكي جيد لإشا?...

Discussion

الهدف من HTS هو تحديد جزيئات الضرب من خلال فحص أعداد هائلة من الجزيئات الصغيرة. لذلك ، فإن النتائج من هذا المثال لا تمثل سوى جزء صغير من تجربة HTS التقليدية. علاوة على ذلك ، يجب التحقق من صحة جزيئات الضرب المحددة في مقايسات المصب مثل الفحص المعتمد على الجرعة على نفس خط الخلية المؤتلف وعلى خط خل?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة USDA-NIFA-AFRI لصحة الحيوان ورفاهيته (رقم الجائزة 2022-67015-36336 ، PVP [مدير المشروع]) ومن الصناديق التنافسية من برنامج منحة أمراض ناقلات الحشرات لأبحاث Texas A&M AgriLife (FY'22-23) إلى P.V.P. تم الاعتراف بمجموعة أعضاء هيئة التدريس A.W.E.S.O.M.E. في كلية الزراعة وعلوم الحياة ، TAMU ، للمساعدة في تحرير المخطوطة. يحتوي الجدول التكميلي S2 على بيانات من مكتبة داخلية عشوائية صغيرة الجزيئات تم الحصول عليها من مختبر الدكتور جيمس ساكيتي في جامعة تكساس إيه آند إم وأبحاث تكساس إيه آند إم الزراعية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco Invitrogen15050-065with phenol red
0.4% trypan blueMilliporeSigmaT8154liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubesThermo FisherAM12400RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipetteCorning29443-045Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipetteCorning29443-047Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubesFalcon352196sterile
20 µL filter tipsUSA Scientifc Inc.P1121sterile, barrier
25 mL serological pipetteCorning29443-049Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubesCorning430828graduated, sterile
150 mL auto-friendly reserviorIntegra Bioscience6317sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reserviorIntegra Bioscience6318sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tipsIntegra Bioscience6405long, sterile filter
384/ 12.5 µL tipsIntegra Bioscience6404long, sterile filter
384-well plateGreiner781091CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate sealsAxygen ScientificPCR-AS-200polyester-based
Aluminum foil wrapWalmart
Biosafty cabinet IINuAireNU-540-300
Cell counterNexcelomAutoT4
cell counting slidesNexcelomSD-10020 µL chamber
CO2 humidified incubatorThermo FisherForma Series II
Desk LampSunvaleeyTEKRS1000B
Dimethyl sulfoxideMilliporeSigma276855anhydous, >99.9%
Drug plateCorning3680
Dulbecco's phosphate-buffered salineCorning21-031-CVDPBS, 1x without calcium amd magnesium
EthanolKoptec2000
F-12K Nutrient Mixture Corning45000-354(Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serumEquitech-BioSFBU30
Fluorescent calcium assay kitENZO LifescienceENZ-5101710x96 tests
G418 sulfateGibco Invitrogen10131-027Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's bufferMilliporeSigma55037CHBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES bufferGibco Invitrogen15630-0801 Molar
HTS data storage plateformCDD vault https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling systemIntegra BioscienceViaflo384/12.5 µL
Plate centrifugeThermo FisherSorvall ST8
Plate readerBMG technologyClariostar
Poly-D-lysineMilliporeSigmaP6407
Rhimi-K-1 agonist peptideGenscriptcustom orderQFSPWGamide
T-75 flaskFalcon353136

References

  1. Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
  2. Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993 (2021).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
  4. Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
  5. Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
  6. Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).
  7. Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H., Leifert, W. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. , (2009).
  8. Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
  9. Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).
  10. Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).
  11. Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
  12. Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
  13. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).
  14. Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).
  15. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).
  16. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
  17. Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
  18. Dircksen, H., Kastin, A. J. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). , 209-221 (2013).
  19. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
  20. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
  21. Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
  22. Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
  23. Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).
  24. Kim, Y. -. J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
  25. Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
  26. Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).
  27. Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).
  28. Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
  29. Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
  30. Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
  31. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
  32. Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
  33. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
  34. Zhang, J. -. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  35. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  36. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  37. Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).
  38. Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved