Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Riepilogo

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Abstract

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) rappresentano la più grande superfamiglia di recettori e sono i bersagli di numerosi farmaci umani. Lo screening ad alta produttività (HTS) di librerie casuali di piccole molecole rispetto ai GPCR viene utilizzato dall'industria farmaceutica per la scoperta di farmaci specifici per bersaglio. In questo studio, un HTS è stato impiegato per identificare nuovi ligandi a piccole molecole di neuropeptidi GPCR specifici per invertebrati come sonde per studi fisiologici di vettori di patogeni umani e veterinari mortali.

Il recettore della chinina specifico per gli invertebrati è stato scelto come bersaglio perché regola molti importanti processi fisiologici negli invertebrati, tra cui la diuresi, l'alimentazione e la digestione. Inoltre, la farmacologia di molti GPCR invertebrati è scarsamente caratterizzata o non caratterizzata affatto; pertanto, la farmacologia differenziale di questi gruppi di recettori rispetto ai GPCR correlati in altri metazoi, in particolare nell'uomo, aggiunge conoscenza alle relazioni struttura-attività dei GPCR come superfamiglia. È stato sviluppato un test HTS per cellule in piastre a 384 pozzetti per la scoperta di ligandi del recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, o zecca bovina meridionale, Rhipicephalus microplus. Il recettore della zecca chinina era stabilmente espresso nelle cellule CHO-K1.

Il recettore della chinina, quando attivato da neuropeptidi endogeni della chinina o da altri agonisti di piccole molecole, innesca il rilascio di Ca²⁺ dalle riserve di calcio nel citoplasma. Questo saggio di fluorescenza del calcio combinato con un approccio di "doppia addizione" può rilevare molecole "hit" funzionali agoniste e antagoniste nella stessa piastra di analisi. Ogni test è stato condotto utilizzando piastre di farmaci contenenti una serie di 320 piccole molecole casuali. È stato ottenuto un fattore Z' affidabile di 0,7 e sono state identificate tre molecole colpite agonista e due antagoniste quando l'HTS era ad una concentrazione finale di 2 μM. Il saggio di fluorescenza del calcio qui riportato può essere adattato per lo screening di altri GPCR che attivano la cascata di segnalazione Ca²⁺ .

Introduzione

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR), che sono presenti dal lievito all'uomo, rappresentano la più grande superfamiglia di recettori in molti organismi¹. Svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione di quasi tutti i processi biologici negli animali. Ci sono 50-200 GPCR nel genoma degli artropodi, il che significa che rappresentano la più grande superfamiglia di recettori di membrana². Sono classificati in sei classi principali, A-F, in base alla loro somiglianza di sequenza e alle funzioni³. I GPCR trasducono vari segnali extracellulari, come quelli di ormoni, neuropeptidi, ammine biogen....

Protocollo

1. Manutenzione delle celle

NOTA: UNA LINEA CELLULARE CHO-K1 che esprime stabilmente il recettore della chinina da R. microplus, chiamata BMLK₃, è stata sviluppata da Holmes et al.16. I dettagli dello sviluppo della linea cellulare sono presentati altrove¹⁴. Tutte le seguenti fasi vengono eseguite in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza di classe II.

1. Far crescere la linea cellulare ricombinante in mezzi selettivi (terreno F-12K contenente il 10% di siero bovino fetale [FBS] e 800 μg/mL di solfato G418) per garantire l'espressione del r....

Risultati

Una piastra di farmaco interna (SAC2-34-6170) composta da 320 piccole molecole casuali è stata utilizzata per dimostrare questo test HTS come esempio. L'HTS aveva un'eccellente qualità del saggio con un fattore Z' di 0,7 (Tabella 1). Questo fattore Z' riflette la qualità del saggio indipendente dai composti testati³⁴. Un fattore Z′ pari o superiore a 0,5 indica un buon intervallo dinamico del segnale di analisi tra le RFU dei controlli positivi e dei con.......

Discussione

L'obiettivo di HTS è identificare le molecole colpite attraverso lo screening di un numero enorme di piccole molecole. Pertanto, i risultati di questo esempio rappresentano solo una piccola parte di un esperimento HTS convenzionale. Inoltre, le molecole hit identificate devono essere convalidate in saggi a valle, come un saggio dose-dipendente sulla stessa linea cellulare ricombinante e su una linea cellulare CHO-K1 che trasporta solo il vettore vuoto, che può essere eseguito simultaneamente per salvare piccole molecol.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco Invitrogen	15050-065	with phenol red
0.4% trypan blue	MilliporeSigma	T8154	liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher	AM12400	RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette	Corning	29443-045	Corning Costar Stripette individually wrapped
10 mL serological pipette	Corning	29443-047	Corning Costar Stripette individually wrapped
15 mL conical tubes	Falcon	352196	sterile
20 µL filter tips	USA Scientifc Inc.	P1121	sterile, barrier
25 mL serological pipette	Corning	29443-049	Corning Costar Stripette individually wrapped
50 mL conical tubes	Corning	430828	graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior	Integra Bioscience	6317	sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior	Integra Bioscience	6318	sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips	Integra Bioscience	6405	long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips	Integra Bioscience	6404	long, sterile filter
384-well plate	Greiner	781091	CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals	Axygen Scientific	PCR-AS-200	polyester-based
Aluminum foil wrap	Walmart
Biosafty cabinet II	NuAire	NU-540-300
Cell counter	Nexcelom	AutoT4
cell counting slides	Nexcelom	SD-100	20 µL chamber
CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Forma Series II
Desk Lamp	SunvaleeyTEK	RS1000B
Dimethyl sulfoxide	MilliporeSigma	276855	anhydous, >99.9%
Drug plate	Corning	3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Corning	21-031-CV	DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol	Koptec	2000
F-12K Nutrient Mixture	Corning	45000-354	(Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum	Equitech-Bio	SFBU30
Fluorescent calcium assay kit	ENZO Lifescience	ENZ-51017	10x96 tests
G418 sulfate	Gibco Invitrogen	10131-027	Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer	MilliporeSigma	55037C	HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer	Gibco Invitrogen	15630-080	1 Molar
HTS data storage plateform	CDD vault		https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system	Integra Bioscience	Viaflo	384/12.5 µL
Plate centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall ST8
Plate reader	BMG technology	Clariostar
Poly-D-lysine	MilliporeSigma	P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide	Genscript	custom order	QFSPWGamide
T-75 flask	Falcon	353136