Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف طريقة للتعبير البكتيري المشترك للبروتينات الموسومة تفاضليا باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة ، تليها تقنيات السحب التقليدية لدراسة مجمعات البروتين التي لا يمكن أن تتجمع في المختبر.

Abstract

Pulldown هو اختبار تفاعل البروتين والبروتين سهل الاستخدام ويستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن لها قيودا في دراسة مجمعات البروتين التي لا تتجمع بشكل فعال في المختبر. قد تتطلب هذه المجمعات تجميعا متعديا مشتركا ووجود مرافقين جزيئيين ؛ إما أنها تشكل أوليغومرات مستقرة لا يمكنها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر أو تكون غير مستقرة بدون شريك ملزم. للتغلب على هذه المشاكل ، من الممكن استخدام طريقة تعتمد على التعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة متبوعة بتقنيات السحب التقليدية. يعد سير العمل أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالقائمة المنسدلة التقليدية لأنه يفتقر إلى الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا للتنقية المنفصلة للبروتينات المتفاعلة وحضانتها التالية. ميزة أخرى هي قابلية استنساخ أعلى بسبب عدد أقل بكثير من الخطوات وفترة زمنية أقصر تتعرض فيها البروتينات الموجودة في البيئة في المختبر للتحلل البروتيني والأكسدة. تم تطبيق الطريقة بنجاح لدراسة عدد من تفاعلات البروتين والبروتين عندما وجد أن التقنيات الأخرى في المختبر غير مناسبة. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين على دفعات. تظهر النتائج التمثيلية لدراسات التفاعلات بين مجال BTB والبروتينات المضطربة جوهريا ، و heterodimers من المجالات المرتبطة بإصبع الزنك.

Introduction

يستخدم السحب التقليدي على نطاق واسع لدراسة تفاعلات البروتينوالبروتين 1. ومع ذلك ، غالبا ما لا تتفاعل البروتينات النقية بشكل فعال في المختبر2,3 ، وبعضها غير قابل للذوبان بدون شريكهاالملزم 4,5. قد تتطلب هذه البروتينات تجميعا متعديا مشتركا أو وجود مرافقين جزيئيين5،6،7،8،9. هناك قيد آخر للسحب التقليدي وهو اختبار نشاط التعدد غير المتجانس المحتمل بين المجالات التي يمكن أن توجد كمتجانسات متجانسة مستقرة مجمعة بشكل مشترك8،10 ، حيث لا يمكن للعديد منها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر خلال وقت الحضانة. وجد أن التعبير المشترك مفيد في التغلب على مثل هذه المشاكل 3,11. تم استخدام التعبير المشترك باستخدام النواقل المتوافقة في البكتيريا بنجاح لتنقية المجمعات الجزيئية الكبيرة متعددة الوحدات الفرعية ، بما في ذلك المركب القمعي متعدد المشبك PRC2 12 ، وحدة رأس وسيط RNA polymeraseII 13 ، صفيحة الأساس للبكتيريا T414 ، وحدة deubiquitinylase المعقدة SAGA15،16 ، والفيريتين17. أصول النسخ المتماثل المستخدمة بشكل شائع للتعبير المشترك هي ColE1 و p15A18 و CloDF1319 و RSF20. في نظام التعبير Duet المتاح تجاريا ، يتم دمج هذه الأصول مع جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية ومواقع استنساخ متعددة ملائمة لإنتاج ناقلات polycistronic ، مما يسمح بالتعبير عن ما يصل إلى ثمانية بروتينات. هذه الأصول لها أرقام نسخ مختلفة ويمكن استخدامها في مجموعات مختلفة لتحقيق مستويات تعبير متوازنة للبروتينات المستهدفة21. لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين ، يتم استخدام علامات تقارب مختلفة ؛ الأكثر شيوعا هي 6xHistidine و glutathione-S-transferase (GST) وبروتين ربط المالتوز (MBP) ، ولكل منها تقارب محدد مع الراتنج المقابل. تعمل GST و MBP أيضا على تعزيز قابلية ذوبان واستقرار البروتينات الموسومة22.

كما تم تطوير عدد من الطرق التي تنطوي على التعبير المشترك للبروتين في الخلايا حقيقية النواة ، وأبرزها مقايسة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) 23. اختبار Y2H رخيص وسهل ويسمح باختبار تفاعلات متعددة ؛ ومع ذلك ، يستغرق سير العمل أكثر من 1 أسبوع لإكماله. هناك أيضا عدد قليل من المقايسات القائمة على خلايا الثدييات الأقل استخداما ، على سبيل المثال ، مقايسة الفلورسنت ثنائية الهجين (F2H) 24 ومقايسة تفاعل البروتين والبروتين في مجموعة الخلايا (CAPPIA) 25. اختبار F2H سريع نسبيا ، مما يسمح بمراقبة تفاعلات البروتين في بيئتها الخلوية الأصلية ، ولكنه يتضمن استخدام معدات تصوير باهظة الثمن. كل هذه الطرق لها ميزة على التعبير بدائية النواة التي توفر الترجمة حقيقية النواة الأصلية وبيئة قابلة للطي. ومع ذلك ، فإنها تكتشف التفاعل بشكل غير مباشر ، إما عن طريق التنشيط النسخي أو عن طريق نقل الطاقة الفلورية ، والتي غالبا ما تنتج القطع الأثرية. أيضا ، قد تحتوي الخلايا حقيقية النواة على شركاء تفاعل آخرين للبروتينات ذات الأهمية ، والتي يمكن أن تتداخل مع اختبار التفاعلات الثنائية بين بروتينات حقيقيات النوى العليا.

تصف الدراسة الحالية طريقة للتعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي تليها تقنيات السحب التقليدية. تسمح هذه الطريقة بدراسة التفاعلات بين البروتينات المستهدفة التي تتطلب التعبير المشترك. إنه أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالسحب التقليدي ، مما يسمح باختبار الدفعات لأهداف متعددة ، مما يجعله مفيدا في معظم الحالات. يعد التعبير المشترك باستخدام المتجهات المتوافقة أكثر ملاءمة من التعبير المشترك متعدد السيسترونيك لأنه لا يتطلب خطوة استنساخ شاقة.

Protocol

يظهر التمثيل التخطيطي لسير عمل الطريقة في الشكل 1.

1. التحول المشترك للإشريكية القولونية

  1. تحضير متجهات التعبير للبروتينات المستهدفة باستخدام طرق الاستنساخ القياسية.
    ملاحظة: عادة ما تكون نقطة البداية الجيدة هي استخدام نواقل pGEX / pMAL التقليدية التي تحمل جين مقاومة الأمبيسلين وأصل ColE1 للتعبير عن البروتينات الموسومة ب GST / MBP وناقل متوافق مع أصل p15A أو RSF ومقاومة الكانامايسين للتعبير عن البروتينات الموسومة ب 6xHis، في بعض الحالات مقترنة إما بثيوريدوكسين أو علامة SUMO لزيادة الذوبان. عادة ، يجب اختبار عدة مجموعات من العلامات قبل التجربة. الطريقة الموصوفة نفسها ملائمة لاختبار الدفعات لظروف التعبير عن البروتينات المستهدفة. من المهم ملاحظة أن معظم سلالات رشيد تحتوي بالفعل على البلازميد مع أصل p15A للتعبير عن tRNAs للكودون النادر ؛ وبالتالي إذا كان استخدام مثل هذه السلالات خيارا ممكنا ، فيجب تجنب البلازميدات p15A. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.
    1. تنمو البكتيريا من سلالة مناسبة في وسط Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة مئوية إلى كثافة بصرية (OD) من 0.1-0.2. تم استخدام سلالة BL21 (DE3) كأمثلة في هذه الدراسة.
      ملاحظة: يوصى باستخدام خلايا مختصة معدة حديثا لتحقيق التحول المشترك الفعال مع متجهين. إذا كانت هناك حاجة إلى تحويل أكثر من متجهين ، فمن الأفضل تحويلهما بالتتابع لتحقيق كفاءة تحويل جيدة. التثقيب الكهربائي هو بديل جيد.
    2. جهاز طرد مركزي 1.0 مل من المعلق البكتيري لمدة دقيقة واحدة عند 9000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    3. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت لتحويل المخزن المؤقت البارد (TB) (10 mM MOPS [pH 6.7] ، 250 mM KCl ، 55 mM MnCl 2 ، و 15 mM CaCl2) واحتضانها لمدة 10 دقائق على الجليد.
    4. أجهزة طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 8000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    5. أضف 100 ميكرولتر من محلول السل ، وأضف 100 نانوغرام من كل ناقل ، واحتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد. تحويل النواقل المفردة بشكل منفصل لدراسة سلوك البروتين دون التعبير المشترك. بالإضافة إلى ذلك، التحويل المشترك لمتجهات التعبير في أزواج مع متجهات التعبير المشترك الفارغة لعناصر تحكم الربط غير المحددة.
      ملاحظة: في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تم استخدام نواقل pGEX / pMAL مع cDNAs المقابلة المدمجة في GST / MBP cDNAs بالاشتراك مع ناقلات متوافقة مشتقة من pACYC تحمل مجالات بروتين شريك ترميز cDNA مدمجة في Thioredoxin cDNA.
    6. يسخن على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 150 ثانية ، ثم يبرد لمدة 1 دقيقة على الثلج.
    7. أضف 1 مل من السائل LB Media بدون مضادات حيوية واحتضانه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. لوحة على صفائح LB-agar تحتوي على 0.5٪ جلوكوز والمضادات الحيوية المقابلة (التركيزات الشائعة هي: 50 ملغم / لتر أمبيسلين ؛ 20 ملغ / لتر كاناميسين ؛ 50 ملغ / لتر ستربتومايسين ؛ 35 ملغ / لتر كلورامفينيكول). احتضان الأطباق طوال الليل على حرارة 37 درجة مئوية.

2. التعبير

  1. اغسل الخلايا من الصفيحة ب 2 مل من وسائط LB السائلة إلى 50 مل من وسائط LB مع المضادات الحيوية المقابلة (التركيزات الشائعة هي: 50 مجم / لتر أمبيسيلين ؛ 20 مجم / لتر كاناميسين ؛ 50 مجم / لتر ستربتومايسين ؛ 35 مجم / لتر كلورامفينيكول). أضف أيونات المعادن أو غيرها من العوامل المساعدة المعروفة (في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تمت إضافة 0.2 mM ZnCl2 إلى الوسائط). قم بتخزين القسمة مع 20٪ من الجلسرين عند -70 درجة مئوية لتكرار التجربة لاحقا.
    ملاحظة: يوصى بطرد العديد من المستعمرات مباشرة من اللوحة لاستبعاد إمكانية التعبير السيئ في استنساخ واحد معزول بسبب أحداث إعادة التركيب العرضية بين اثنين من البلازميدات.
  2. قم بتنمية الخلايا بدوران ثابت يبلغ 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية إلى OD من 0.5-0.7 ، وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، وأضف الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى 1 mM. قم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية كعنصر تحكم في العينة غير المستحثة.
  3. احتضان الخلايا مع دوران ثابت من 220 دورة في الدقيقة عند 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: قد يختلف الوقت الأمثل ودرجة حرارة الحضانة. 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعمل بشكل أفضل لمعظم البروتينات وينصح بتجربتها افتراضيا. تقليل وقت الحضانة إلى 2-3 ساعات إذا لوحظ ارتباط قوي غير محدد.
  4. قسم المعلق البكتيري إلى جزأين (أو أكثر إذا تم استخدام أكثر من علامتين مختلفتين) وقم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من معلق الخلية لتأكيد تعبير البروتين. جهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: نقطة التوقف: يمكن تخزين الكريات البكتيرية في -70 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.

3. مقايسة القائمة المنسدلة

ملاحظة: يتم وصف الإجراءات التفصيلية للبروتينات الموسومة إما ب 6xhis أو MBP / GST. يتم تنفيذ جميع الإجراءات عند 4 درجات مئوية.

  1. أعد تعليق الكريات البكتيرية في 1 مل من محلول التحلل المثلج البارد مع مثبطات الأنزيم البروتيني وعوامل الاختزال (انظر أدناه) المضافة مباشرة قبل التجربة. تجنب ديثيوتريتول (DTT) عند استخدام راتنجات مخلبية معدنية لأنه يزيل أيونات المعادن. اضبط تركيبة المخزن المؤقت للبروتينات المختبرة. الوصفات الشائعة لمخازن التحلل التي تم العثور عليها مناسبة لمعظم البروتينات هي:
    1. 6xHis-pulldown: امزج 30 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول إيميدازول ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] جلسرين ، 5 مللي مول بيتا ميركابتوإيثانول ، 1 مللي متر فينيل ميثيل فولفونيل فلوريد (PMSF) ، وتخفيف 1: 1000 من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد).
    2. GST- أو MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl 2 ، 0.1 مللي مول ZnCl2 ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] جلسرين ، 5 مللي متر DTT ، 1 مللي مول PMSF ، وتخفيف 1: 1000 من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد).
  2. تعطيل الخلايا عن طريق صوتنة على الجليد. تخزين حصص 20 ميكرولتر للكهربائي.
    ملاحظة: عادة ، يلزم 20-25 نبضة من 5 ثوان مع فترات 15 ثانية مع طاقة خرج 20 واط لكل عينة. يجب ضبط قوة الصوتنة المناسبة لكل أداة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة وضمان تعطيل الخلية بالكامل. لتحقيق أداء أفضل ، يوصى بشدة باستخدام مجسات صوتي متعددة الأطراف عالية الإنتاجية.
  3. جهاز طرد مركزي عند 20000 × جرام لمدة 30 دقيقة. اجمع 20 ميكرولتر من المحللة الموضحة لتحليل SDS-PAGE اللاحق.
  4. قم بموازنة الراتنج (50 ميكرولتر لكل عينة) مع 1 مل من محلول تحلل الثلج البارد لمدة 10 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
  5. أضف محللات الخلايا (تركيز البروتين الكلي: 20-50 مجم / مل) إلى الراتنج ، واحتضانها لمدة 10 دقائق عند دوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية. اجمع 20 ميكرولتر من الكسر غير المنضم لتحليل SDS-PAGE اللاحق.
  6. أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج والاحتضان لمدة دقيقة واحدة. أجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية. الوصفات الشائعة لمخازن الغسيل هي:
    1. 6xHis-pulldown: مزيج 30 مللي متر HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 30 مللي متر إيميدازول ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] الجلسرين ، و 5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول.
    2. GST- أو MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 500 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl 2 ، 0.1 مللي مول ZnCl2 ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] الجلسرين ، و 5 مللي متر DTT.
  7. قم بإجراء غسلتين طويلتين: أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج ، واحتضانه لمدة 10-30 دقيقة مع دوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة ، وأجهزة طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
  8. أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج ، واحتضانه لمدة دقيقة واحدة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
  9. قم بإزالة البروتينات المرتبطة ب 50 ميكرولتر من محلول الشطف في شاكر عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. الوصفات الشائعة لمخازن الشطف هي:
    1. 6xHis-pulldown: امزج 30 مللي متر HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 300 مللي متر إيميدازول ، و 5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول.
    2. سحب ضريبة السلع والخدمات: 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 50 مللي مول الجلوتاثيون (المعدل إلى الرقم الهيدروجيني 7.5 مع Tris الأساسي) ، و 5 مللي متر DTT.
    3. MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 40 مللي متر مالتوز ، و 5 مللي متر DTT.
  10. تحليل البروتينات المستخلصة باستخدام SDS-PAGE.
    ملاحظة: يجب تعديل نسبة مادة الأكريلاميد حسب حجم البروتينات. في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تم استخدام 12٪ من المواد الهلامية الأكريلاميد ، تعمل في محلول tris-glycine-SDS (2 mM Tris ، 250 mM Glycine ، 0.1٪ SDS) بجهد ثابت يبلغ 180 فولت. تم تلطيخ المواد الهلامية بالغليان في 0.2٪ Coomassie blue R250 ، و 10٪ حمض الخليك ، و 30٪ إيزوبروبانول ، وإزالة تلطيخها بالغليان في 10٪ حمض الأسيتيك. يجب ألا تكون كمية البروتين المحمل متساوية ، حيث يمكن سحب كميات مختلفة من البروتينات المتفاعلة في تجارب مختلفة.

النتائج

تم استخدام الطريقة الموصوفة بشكل روتيني مع العديد من الأهداف المختلفة. تظهر هنا بعض النتائج التمثيلية التي من المحتمل ألا يمكن الحصول عليها باستخدام تقنيات السحب التقليدية. الأول هو دراسة DIMERIZATION محددة ZAD (المجال المرتبط بإصبع الزنك)11. تشكل ZADs ثنائيات مستقرة ومحددة ، مع إمكاني...

Discussion

تسمح الطريقة الموصوفة باختبار تفاعلات البروتين والبروتين التي لا يمكن تجميعها بكفاءة في المختبر وتتطلب تعبيرا مشتركا. هذه الطريقة هي واحدة من الطرق القليلة المناسبة لدراسة البروتينات غير المتجانسة ، والتي هي أيضا قادرة على homodimerization لأنه ، عند تنقيتها بشكل منفصل ، تشكل هذه البروتين?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مشاريع مؤسسة العلوم الروسية 19-74-30026 (تطوير الطريقة والتحقق من صحتها) و 19-74-10099 (مقايسات التفاعل بين البروتين والبروتين) ؛ ومن قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي - منحة 075-15-2019-1661 (تحليل تفاعلات البروتين والبروتين التمثيلية).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
8-ELEMENT probeSonics630-0586The high throughput 8-element sonicator probes
AgarAppliChemA0949
Amylose resinNew England BiolabsE8021Resin for purification of MBP-tagged proteins
AntibioticsAppliChemA4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanolAppliChemA1108
BL21(DE3) Novagen69450-M
CaCl2AppliChemA4689
CentrifugeEppendorf5415R (Z605212)
GlutathioneAppliChemA9782
Glutathione agarosePierce16100Resin for purification of GST-tagged proteins
GlycerolAppliChemA2926
HEPES AppliChemA3724
HisPur Ni-NTA Superflow AgaroseThermo Scientific25214Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
ImidazoleAppliChemA1378
IPTGAppliChemA4773
KClAppliChemA2939
LBAppliChem414753
MaltoseAppliChemA3891
MOPSAppliChemA2947
NaClAppliChemA2942
NP40Roche11754599001
pACYCDuet-1Sigma-Aldrich71147Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1Sigma-Aldrich71340Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSFAppliChemA0999
Protease Inhibitor Cocktail VIICalbiochem539138Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1Sigma-Aldrich71341Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS AppliChemA2263
Tris AppliChemA2264
VC505 sonicatorSonicsCV334Ultrasonic liquid processor
ZnCl2AppliChemA6285

References

  1. Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
  2. Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
  3. Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
  4. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
  5. Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
  6. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  7. Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
  8. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  9. Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
  10. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
  11. Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
  12. Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
  13. Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
  14. Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
  15. Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
  16. Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
  17. Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
  18. Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
  19. Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
  20. Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
  21. Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
  22. Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
  23. Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
  24. Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
  25. Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
  26. Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
  27. Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
  28. Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
  29. Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved