Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement à l’aide d’un ensemble de vecteurs compatibles, suivie des techniques conventionnelles de pulldown pour étudier les complexes protéiques qui ne peuvent pas s’assembler in vitro.

Résumé

Pulldown est un test d’interaction protéine-protéine facile et largement utilisé. Cependant, il a des limites dans l’étude des complexes protéiques qui ne s’assemblent pas efficacement in vitro. De tels complexes peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel et la présence de chaperons moléculaires; Soit ils forment des oligomères stables qui ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro , soit ils sont instables sans partenaire liant. Pour surmonter ces problèmes, il est possible d’utiliser une méthode basée sur la co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement en utilisant un ensemble de vecteurs compatibles suivi des techniques conventionnelles de pulldown. Le flux de travail est plus rapide que le pulldown traditionnel, car il manque les étapes fastidieuses de purification séparée des protéines en interaction et de leur incubation ultérieure. Un autre avantage est une reproductibilité plus élevée en raison d’un nombre significativement plus petit d’étapes et d’une période de temps plus courte pendant laquelle les protéines qui existent dans l’environnement in vitro sont exposées à la protéolyse et à l’oxydation. La méthode a été appliquée avec succès pour étudier un certain nombre d’interactions protéine-protéine lorsque d’autres techniques in vitro se sont révélées inappropriées. La méthode peut être utilisée pour tester par lots les interactions protéine-protéine. Des résultats représentatifs sont présentés pour les études des interactions entre le domaine BTB et les protéines intrinsèquement désordonnées, et des hétérodimères des domaines associés aux doigts de zinc.

Introduction

Le pulldown conventionnel est largement utilisé pour étudier les interactions protéine-protéine¹. Cependant, les protéines purifiées n’interagissent souvent pas efficacement in vitro^2,3, et certaines d’entre elles sont insolubles sans leur partenaire de liaison ^4,5. De telles protéines peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel ou la présence de chaperons moléculaires 5,6,7,8,9. Une autre limitation du pulldown conventionnel est le test d’une activité d’hétéromultimérisation possible entre des domaines qui peuvent exister sous forme d’homo-oligomères stables assemblés co-translationnellement ^8,10, car beaucoup d’entre eux ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro pendant le temps d’incubation. La co-expression s’est avérée utile pour surmonter ces problèmes ^3,11. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles chez les bactéries a été utilisée avec succès pour purifier de grands complexes macromoléculaires multi-sous-unités, y compris le complexe répressif polycomb PRC2¹², le module de tête de médiateur de l’ARN polymérase II¹³, la plaque de base du bactériophage T4¹⁴, le module de déubiquitinylase du complexe SAGA ^15,16 et la ferritine¹⁷. Les origines de réplication couramment utilisées pour la co-expression sont ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ et RSF²⁰. Dans le système d’expression Duet disponible dans le commerce, ces origines sont combinées avec différents gènes de résistance aux antibiotiques et plusieurs sites de clonage pratiques pour produire des vecteurs polycistroniques, permettant l’expression de jusqu’à huit protéines. Ces origines ont des numéros de copie différents et peuvent être utilisées dans différentes combinaisons pour atteindre des niveaux d’expression équilibrés des protéines cibles²¹. Pour tester les interactions protéine-protéine, diverses étiquettes d’affinité sont utilisées; les plus courantes sont la 6xHistidine, la glutathion-S-transférase (GST) et la protéine de liaison au maltose (MBP), chacune ayant une affinité spécifique avec la résine correspondante. La GST et le MBP améliorent également la solubilité et la stabilité des protéines marquées²².

Un certain nombre de méthodes impliquant la co-expression des protéines dans les cellules eucaryotes ont également été développées, dont la plus importante est le test à deux hybrides de levure (Y2H)²³. Le test Y2H est bon marché, facile et permet de tester de multiples interactions; Cependant, son flux de travail prend plus de 1 semaine à compléter. Il existe également quelques essais à base de cellules de mammifères moins fréquemment utilisés, par exemple, le test fluorescent à deux hybrides (F2H)²⁴ et le test d’interaction protéine-protéine (CAPPIA)²⁵. Le test F2H est relativement rapide, permettant d’observer les interactions protéiques dans leur environnement cellulaire natif, mais implique l’utilisation d’équipements d’imagerie coûteux. Toutes ces méthodes ont un avantage sur l’expression procaryote fournissant la traduction eucaryote native et l’environnement de repliement; Cependant, ils détectent l’interaction indirectement, soit par activation transcriptionnelle, soit par transfert d’énergie fluorescente, ce qui produit souvent des artefacts. En outre, les cellules eucaryotes peuvent contenir d’autres partenaires d’interaction de protéines d’intérêt, ce qui peut interférer avec le test des interactions binaires entre les protéines des eucaryotes supérieurs.

La présente étude décrit une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement suivie de techniques conventionnelles de pulldown. La méthode permet d’étudier les interactions entre les protéines cibles qui nécessitent une co-expression. Il est plus rapide que le pulldown traditionnel, permettant de tester par lots plusieurs cibles, ce qui le rend avantageux dans la plupart des cas. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles est plus pratique que la co-expression polycistronique car elle ne nécessite pas d’étape de clonage laborieuse.

Protocole

La représentation schématique du flux de travail de la méthode est illustrée à la figure 1.

1. Co-transformation d’E. coli

1. Préparer des vecteurs d’expression pour les protéines cibles à l’aide de méthodes de clonage standard.
   REMARQUE: En règle générale, un bon point de départ consiste à utiliser des vecteurs pGEX/pMAL conventionnels portant un gène de résistance à l’ampicilline et une origine ColE1 pour l’expression de protéines marquées GST/MBP et un vecteur compatible d’origine p15A ou RSF et de résistance à la kanamycine pour exprimer des protéines marquées 6xHis, dans certains cas combinées avec de la thiorédoxine ou du SUMO-tag pour augmenter la solubilité. Habituellement, plusieurs combinaisons d’étiquettes doivent être testées avant l’expérience. La méthode décrite elle-même est pratique pour tester par lots les conditions d’expression des protéines cibles. Il est important de noter que la plupart des souches de Rosetta contiennent déjà le plasmide d’origine p15A pour exprimer les ARNt pour les codons rares; donc si l’utilisation de telles souches est une option possible, les plasmides p15A doivent être évités. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails.
   1. Cultiver des bactéries d’une souche appropriée dans un milieu Luria-Bertani (LB) à 37 °C jusqu’à une densité optique (DO) de 0,1 à 0,2. La souche BL21(DE3) a été utilisée à titre d’exemple dans cette étude.
      NOTE: Il est recommandé d’utiliser des cellules compétentes fraîchement préparées pour obtenir une co-transformation efficace avec deux vecteurs. Si plus de deux vecteurs doivent être co-transformés, il est préférable de les transformer séquentiellement pour obtenir une bonne efficacité de transformation. L’électroporation est une bonne alternative.
   2. Centrifuger 1,0 mL de la suspension bactérienne pendant 1 min à 9 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.
   3. Ajouter 0,5 mL de tampon de transformation (TB) glacé (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 et 15 mM CaCl₂) et incuber pendant 10 min sur glace.
   4. Centrifuger pendant 30 s à 8 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.
   5. Ajouter 100 μL de tampon TB, ajouter 100 ng de chaque vecteur et incuber pendant 30 minutes sur de la glace. Transformez séparément des vecteurs uniques pour étudier le comportement des protéines sans co-expression. En outre, co-transformez les vecteurs d’expression par paires avec des vecteurs de co-expression vides pour les contrôles de liaison non spécifiques.
      NOTE: Dans les exemples fournis dans cette étude, des vecteurs pGEX/pMAL avec des ADNc correspondants fusionnés à des ADNc GST/MBP ont été utilisés en combinaison avec des vecteurs compatibles dérivés de pACYC portant des domaines protéiques partenaires codant pour l’ADNc codant pour l’ADNc fusionné à l’ADNc de thiorédoxine.
   6. Chauffer à 42 °C pendant 150 s, puis refroidir pendant 1 min sur glace.
   7. Ajouter 1 mL de milieu LB liquide sans antibiotiques et incuber à 37 °C pendant 90 min. Plaque sur des plaques de LB-agar contenant 0,5 % de glucose et les antibiotiques correspondants (les concentrations courantes sont les suivantes : 50 mg/L d’ampicilline; 20 mg/L de kanamycine; 50 mg/L de streptomycine; 35 mg/L de chloramphénicol). Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.

2. Expression

1. Rincer les cellules de la plaque avec 2 mL de milieu LB liquide dans 50 mL de milieu LB avec les antibiotiques correspondants (les concentrations courantes sont : 50 mg/L d’ampicilline; 20 mg/L de kanamycine; 50 mg/L de streptomycine; 35 mg/L de chloramphénicol). Ajouter des ions métalliques ou d’autres cofacteurs connus (dans les exemples fournis dans cette étude, 0,2 mM ZnCl₂ a été ajouté au milieu). Conservez une partie aliquote contenant 20 % de glycérol à -70 °C pour une répétition ultérieure de l’expérience.
   REMARQUE: Il est recommandé de rincer plusieurs colonies directement de la plaque pour exclure la possibilité d’une mauvaise expression dans un seul clone isolé en raison d’événements de recombinaison occasionnels entre deux plasmides.
2. Faire pousser les cellules avec une rotation constante de 220 tr/min à 37 °C jusqu’à une DO de 0,5 à 0,7, refroidir à température ambiante (RT) et ajouter l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 1 mM. Conserver une partie aliquote de 20 μL de suspension cellulaire comme témoin de l’échantillon non induit.
3. Incuber les cellules avec une rotation constante de 220 rpm à 18 °C pendant la nuit.
   REMARQUE: Le temps et la température optimaux d’incubation peuvent varier; 18 ° C pendant la nuit fonctionne mieux pour la plupart des protéines et il est conseillé d’être essayé par défaut. Réduire le temps d’incubation à 2-3 h si une forte liaison non spécifique est observée.
4. Divisez la suspension bactérienne en deux parties (ou plus si plus de deux étiquettes différentes ont été utilisées) et conservez une partie aliquote de 20 μL de la suspension cellulaire pour confirmer l’expression de la protéine. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min.
   REMARQUE: Point de pause: les granulés bactériens peuvent être conservés à -70 ° C pendant au moins 6 mois.

3. Essai de pulldown

REMARQUE: Les procédures détaillées sont décrites pour les protéines marquées avec 6xHis ou MBP / GST. Toutes les procédures sont effectuées à 4°C.

1. Remettez en suspension les pastilles bactériennes dans 1 mL de tampon de lyse glacé avec des inhibiteurs de protéase et des agents réducteurs (voir ci-dessous) ajoutés immédiatement avant l’expérience. Évitez le dithiotreitol (DTT) lorsque vous utilisez des résines chélatantes des métaux, car il élimine les ions métalliques. Ajustez la composition tampon pour les protéines testées. Les recettes courantes de tampons de lyse qui conviennent à la plupart des protéines sont:
   1. 6xHis-pulldown : Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0,1 % NP40, 10 % [p/p] glycérol, 5 mM bêta-mercaptoéthanol, 1 mM de phénylméthylsfulfonylfluorure (PMSF) et une dilution de 1:1 000 du cocktail inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux).
   2. GST ou MBP-pulldown: Mélanger 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF et une dilution 1:1 000 du cocktail inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux).
2. Perturber les cellules par sonication sur glace. Conservez une partie aliquote de 20 μl pour l’électrophorèse.
   REMARQUE: En règle générale, 20-25 impulsions de 5 s avec des intervalles de 15 s avec une puissance de sortie de 20 W sont nécessaires par échantillon. Le pouvoir de sonication approprié doit être ajusté pour chaque instrument afin d’éviter la surchauffe et d’assurer une perturbation totale des cellules. Pour obtenir de meilleures performances, il est fortement recommandé d’utiliser des sondes sonicatrices multi-pointes à haut débit.
3. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min. Prélever 20 μL du lysat clarifié pour une analyse ultérieure SDS-PAGE.
4. Équilibrer la résine (50 μL pour chaque échantillon) avec 1 mL de tampon de lyse glacée pendant 10 min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.
5. Ajouter des lysats cellulaires (concentration totale en protéines : 20-50 mg/mL) à la résine, incuber pendant 10 min à une rotation constante de 15 tr/min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant. Prélever 20 μL de la fraction non liée pour l’analyse SDS-PAGE ultérieure.
6. Ajouter 1 mL de tampon de lavage glacé et incuber pendant 1 min. Centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant. Les recettes courantes pour les tampons de lavage sont:
   1. 6xHis-pulldown: Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazole, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol et 5 mM bêta-mercaptoéthanol.
   2. GST ou MBP-pulldown: Mélanger 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol et 5 mM DTT.
7. Effectuer deux longs lavages : ajouter 1 mL de tampon de lavage à froid glacé, incuber pendant 10 à 30 min avec une rotation constante de 15 tr/min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.
8. Ajouter 1 mL de tampon de lavage glacé, incuber pendant 1 min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.
9. Éluer les protéines liées avec 50 μL de tampon d’élution dans un agitateur à 1 200 tr/min pendant 10 min. Les recettes courantes de tampons d’élution sont:
   1. 6xHis-pulldown: Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazole et 5 mM bêta-mercaptoéthanol.
   2. GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM de glutathion (ajusté à pH 7,5 avec Tris basique) et 5 mM de TNT.
   3. MBP-pulldown : Mélanger 20 mM de Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM de NaCl, 40 mM de maltose et 5 mM de TNT.
10. Analysez les protéines éluées avec SDS-PAGE.
    NOTE: Le pourcentage d’acrylamide doit être ajusté à la taille des protéines. Dans les exemples fournis dans cette étude, des gels d’acrylamide à 12 % ont été utilisés, fonctionnant dans un tampon tris-glycine-SDS (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,1 % SDS) à tension constante de 180 V. Les gels ont été colorés par ébullition dans 0,2% de bleu de Coomassie R250, 10% d’acide acétique et 30% d’isopropanol, et décolorés par ébullition dans 10% d’acide acétique. La quantité de protéines chargées ne devrait pas être égale, car différentes quantités de protéines en interaction peuvent être tirées vers le bas dans différentes expériences.

Résultats

La méthode décrite a été utilisée couramment avec de nombreuses cibles différentes. Voici quelques résultats représentatifs qui ne peuvent probablement pas être obtenus en utilisant des techniques conventionnelles de pulldown. La première est l’étude de la dimérisation spécifique ZAD (Zinc-finger-associated domain)¹¹. Les ZAD forment des dimères stables et spécifiques, les hétérodimères n’étant possibles qu’entre des domaines étroitement liés au sein de groupes paralogue...

Discussion

La méthode décrite permet de tester les interactions protéine-protéine qui ne peuvent pas être assemblées efficacement in vitro et nécessitent une co-expression. La méthode est l’une des rares approches appropriées pour étudier les protéines hétérodimérantes, qui sont également capables d’homodimérisation puisque, lorsqu’elles sont purifiées séparément, ces protéines forment des homodimères stables qui ne peuvent le plus souvent pas se dissocier et se réassocie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-ELEMENT probe	Sonics	630-0586	The high throughput 8-element sonicator probes
Agar	AppliChem	A0949
Amylose resin	New England Biolabs	E8021	Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics	AppliChem	A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Centrifuge	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutathione	AppliChem	A9782
Glutathione agarose	Pierce	16100	Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF	AppliChem	A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII	Calbiochem	539138	Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS	AppliChem	A2263
Tris	AppliChem	A2264
VC505 sonicator	Sonics	CV334	Ultrasonic liquid processor
ZnCl2	AppliChem	A6285