下拉测定与细菌细胞共表达相结合，作为测试具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用的省时工具

摘要

在这里，我们描述了一种使用一组兼容载体对差异标记蛋白质进行细菌共表达的方法，然后使用传统的下拉技术来研究无法 在体外组装的蛋白质复合物。

摘要

下拉是一种简单且广泛使用的蛋白质-蛋白质相互作用测定。然而，它在研究体 外不能有效组装的蛋白质复合物方面存在局限性。这种复合物可能需要共翻译组装和分子伴侣的存在;它们要么形成稳定的低聚物，在 体外 不能解离和重新结合，要么在没有结合伴侣的情况下不稳定。为了克服这些问题，可以使用基于差异标记蛋白的细菌共表达的方法，使用一组兼容的载体，然后使用传统的下拉技术。与传统的下拉相比，该工作流程更省时，因为它缺乏单独纯化相互作用蛋白及其后续孵育的耗时步骤。另一个优点是更高的可重复性，因为 体外 环境中存在的蛋白质暴露于蛋白水解和氧化的步骤数量明显较少，并且持续时间更短。当发现其他 体外 技术不合适时，该方法成功地应用于研究许多蛋白质 - 蛋白质相互作用。该方法可用于批量测试蛋白质-蛋白质相互作用。对于BTB结构域与固有无序蛋白质之间的相互作用以及锌指相关结构域的异二聚体的研究，显示了具有代表性的结果。

引言

常规下拉广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用¹。然而，纯化的蛋白质通常不能在体外有效相互作用²，³，其中一些在没有结合伴侣^4，5的情况下是不溶的。这些蛋白质可能需要共翻译组装或分子伴侣⁵，⁶，⁷，^8，9的存在。常规下拉的另一个限制是测试结构域之间可能的异多聚化活性，这些结构域可以作为稳定的同源低聚物以共翻译8，^{10的形式存在，}因为它们中的许多在孵育期间不能在体外解离和重新结合。发现共表达有助于克服这些问题^3，11。使用细菌中相容载体的共表达成功用于纯化大型多亚基大分子复合物，包括Polycomb抑制复合物PRC2 12，RNA聚合酶II介质头模块13，噬菌体T4底板14，SAGA复合物去泛素化酶模块^15，16和铁蛋白¹⁷。通常用于共表达的复制起源是ColE1，p15A¹⁸，CloDF13¹⁹和RSF²⁰。在市售的Duet表达系统中，这些来源与不同的抗生素抗性基因和方便的多个克隆位点相结合，产生多顺反子载体，允许表达多达八种蛋白质。这些来源具有不同的拷贝数，可以以不同的组合使用，以实现靶蛋白的平衡表达水平²¹。为了测试蛋白质-蛋白质相互作用，使用了各种亲和标签;最常见的是6x组氨酸，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和麦芽糖结合蛋白（MBP），每种都对相应的树脂具有特定的亲和力。GST和MBP还增强了标记蛋白的溶解度和稳定性²²。

还开发了许多涉及真核细胞中蛋白质共表达的方法，其中最突出的是酵母双杂交测定（Y2H）²³。Y2H测定便宜，简单，并且允许测试多种相互作用;但是，其工作流程需要 1 周以上才能完成。还有一些不太常用的基于哺乳动物细胞的测定，例如荧光双杂交测定（F2H）²⁴ 和细胞阵列蛋白质 - 蛋白质相互作用测定（CAPPIA）²⁵。F2H测定相对较快，允许观察其天然细胞环境中的蛋白质相互作用，但涉及使用昂贵的成像设备。所有这些方法都比原核表达具有优势，可提供天然真核翻译和折叠环境;然而，它们通过转录激活或荧光能量转移间接检测相互作用，这通常会产生伪影。此外，真核细胞可能包含目标蛋白质的其他相互作用伙伴，这可以干扰高等真核生物蛋白质之间二元相互作用的测试。

本研究描述了一种通过常规下拉技术对差异标记蛋白进行细菌共表达的方法。该方法允许研究需要共表达的靶蛋白之间的相互作用。与传统的下拉相比，它更省时，允许对多个目标进行批量测试，这在大多数情况下具有优势。使用兼容载体的共表达比多顺反子共表达更方便，因为它不需要费力的克隆步骤。

研究方案

方法工作流程的示意图如图 1所示。

1. 大肠杆菌的共转化

1. 使用标准克隆方法制备靶蛋白的表达载体。
   注意:通常，一个好的起点是使用带有氨苄青霉素抗性基因和ColE1来源的常规pGEX/pMAL载体表达GST/MBP标记蛋白，以及使用具有p15A或RSF来源和卡那霉素抗性的兼容载体来表达6xHis标记的蛋白质，在某些情况下与硫氧还蛋白或SUMO标签结合使用以增加溶解度。通常，在实验之前需要测试几种标签组合。该方法本身便于批量测试靶蛋白的表达条件。需要注意的是，大多数Rosetta菌株已经含有p15A来源的质粒，用于表达稀有密码子的tRNA;因此，如果可能选择使用这种菌株，则应避免使用p15A质粒。有关详细信息，请参阅 材料表 。
   1. 在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养适当菌株的细菌至0.1-0.2的光密度（OD）。本研究以BL21（DE3）菌株为例。
      注意:建议使用新鲜制备的感受态细胞，以实现与两个载体的高效共转化。如果需要对两个以上的向量进行共变换，最好按顺序变换，以达到良好的变换效率。电穿孔是一个不错的选择。
   2. 在4°C下以9，000× g 离心1.0mL细菌悬浮液1分钟，弃去上清液。
   3. 加入 0.5 mL 冰冷缓冲液转化缓冲液 （TB）（10 mM MOPS [pH 6.7]、250 mM KCl、55 mM MnCl 2 和 15 mM CaCl₂），并在冰上孵育 10 分钟。
   4. 在4°C下以8，000× g 离心30秒，弃去上清液。
   5. 加入 100 μL TB 缓冲液，加入每种载体 100 ng，并在冰上孵育 30 分钟。分别转换单个载体以研究没有共表达的蛋白质行为。此外，将表达载体与空的共表达载体成对进行共转化，用于非特异性结合对照。
      注意:在本研究提供的示例中，pGEX / pMAL载体与与GST / MBP cDNA融合的相应cDNA与兼容的pACYC衍生载体结合使用，这些载体带有与硫氧还蛋白cDNA融合的cDNA编码伙伴蛋白结构域。
   6. 在42°C下加热150秒，然后在冰上冷却1分钟。
   7. 加入1mL不含抗生素的液体LB培养基，并在37°C下孵育90分钟。LB-琼脂平板上的平板含有0.5%葡萄糖和相应的抗生素（常见浓度为:50毫克/升氨苄西林;20毫克/升卡那霉素;50毫克/升链霉素;35毫克/升氯霉素）。将板在37°C孵育过夜。

2. 表达式

1. 用 2 mL 液体 LB 培养基将平板中的细胞冲洗到 50 mL 含有相应抗生素的 LB 培养基中（常见浓度为:50mg/L 氨苄西林;20 mg/L 卡那霉素;50 mg/L 链霉素;35 mg/L 氯霉素）。加入金属离子或其他已知的辅助因子（在本研究提供的示例中，向培养基中加入0.2 mM ZnCl₂ ）。将含有20%甘油的等分试样储存在-70°C下，以便随后重复实验。
   注意:建议直接从平板中冲洗多个菌落，以排除由于两个质粒之间偶尔发生重组事件而导致单个分离克隆中表达不良的可能性。
2. 在37°C下以220rpm的恒定旋转培养细胞至OD为0.5-0.7，冷却至室温（RT），并将异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）加入至1mM。储存 20 μL 等分试样的细胞悬液作为未诱导样品的对照。
3. 将细胞在18°C下以220rpm的恒定旋转孵育过夜。
   注意:孵育的最佳时间和温度可能会有所不同;18°C过夜对大多数蛋白质效果最好，建议默认尝试。如果观察到强烈的非特异性结合，则将孵育时间减少到2-3小时。
4. 将细菌悬浮液分成两部分（如果使用两个以上的不同标签，则分成更多部分），并储存 20 μL 等分试样的细胞悬液以确认蛋白质表达。以4，000 x g 离心15分钟。
   注意:暂停点:细菌沉淀可以在-70°C下储存至少6个月。

3. 下拉测定

注意:详细程序描述了用6xHis或MBP / GST标记的蛋白质。所有程序均在4°C下进行。

1. 将细菌沉淀重悬于1mL冰冷的裂解缓冲液中，并在实验前立即加入蛋白酶抑制剂和还原剂（见下文）。使用金属螯合树脂时避免使用二硫蓈醇（DTT），因为它会去除金属离子。调整测试蛋白质的缓冲液组成。适用于大多数蛋白质的裂解缓冲液的常见配方是:
   1. 6xHis-下拉:混合30 mM HEPES（pH 7.5），400 mM NaCl，10 mM咪唑，0.1%NP40，10%[w / w]甘油，5 mMβ-巯基乙醇，1 mM苯基甲基富磷酰氟（PMSF）和1:1，000稀释的蛋白酶抑制剂混合物（见 材料表）。
   2. GST 或 MBP 下拉:混合 20 mM Tris（25 °C 时 pH 7.5）、150 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM 氯化镁₂、0.1 mM 氯化锌₂、0.1% NP40、10% [w/w] 甘油、5 mM DTT、1 mM PMSF 和 1:1，000 稀释的蛋白酶抑制剂混合物（参见 材料表）。
2. 通过在冰上超声处理来破坏细胞。储存20μl等分试样用于电泳。
   注意:通常，每个样本需要 20-25 个脉冲，每次 5 秒，间隔 15 秒，输出功率为 20 W。应为每台仪器调整适当的超声处理功率，以避免过热并确保细胞完全破碎。为了获得更好的性能，强烈建议使用高通量多尖端超声仪探头。
3. 以20，000× g 离心30分钟。收集 20 μL 澄清裂解物用于后续 SDS-PAGE 分析。
4. 用 1 mL 冰冷的裂解缓冲液平衡树脂（每个样品 50 μL）10 分钟，以 2，000 x g 离心 30 秒，弃去上清液。
5. 向树脂中加入细胞裂解物（总蛋白质浓度:20-50mg / mL），以15rpm的恒定旋转孵育10分钟，以2，000× g 离心30秒，弃去上清液。收集 20 μL 未结合级分用于后续 SDS-PAGE 分析。
6. 加入 1 mL 冰冷洗涤缓冲液并孵育 1 分钟。以2，000× g 离心30秒，弃去上清液。洗涤缓冲液的常见配方是:
   1. 6xHis-下拉:混合 30 mM HEPES （pH 7.5）、400 mM NaCl、30 mM 咪唑、0.1% NP40、10% [w/w] 甘油和 5 mM β-巯基乙醇。
   2. GST 或 MBP 下拉:混合 20 mM Tris（25 °C 时 pH 7.5）、500 mM 氯化钠、10 mM KCl、10 mM 氯化镁 2、0.1 mM 氯化锌₂、0.1% NP40、10% [w/w] 甘油和 5 mM DTT。
7. 进行两次长时间洗涤:加入1mL冰冷洗涤缓冲液，以15rpm的恒定旋转孵育10-30分钟，以2，000× g 离心30秒，弃去上清液。
8. 加入 1 mL 冰冷洗涤缓冲液，孵育 1 分钟，以 2，000 x g 离心 30 秒，弃去上清液。
9. 用 50 μL 洗脱缓冲液在摇床中以 1，200 rpm 洗脱结合的蛋白质 10 分钟。洗脱缓冲液的常用配方是:
   1. 6xHis-下拉:混合30 mM HEPES（pH 7.5），400 mM NaCl，300 mM咪唑和5 mM β-巯基乙醇。
   2. GST 下拉:20 mM Tris（25 °C 时 pH 7.5）、150 mM NaCl、50 mM 谷胱甘肽（使用碱性 Tris 调节至 pH 7.5）和 5 mM DTT。
   3. MBP 下拉:混合 20 mM Tris（25 °C 时 pH 7.5）、150 mM 氯化钠、40 mM 麦芽糖和 5 mM DTT。
10. 用SDS-PAGE分析洗脱的蛋白质。
    注意:丙烯酰胺的百分比应根据蛋白质的大小进行调整。在本研究提供的示例中，使用12%丙烯酰胺凝胶，在三甘氨酸-SDS缓冲液（2mM Tris，250mM甘氨酸，0.1%SDS）中以180 V的恒定电压运行。负载蛋白质的量不应相等，因为在不同的实验中可以拉下不同数量的相互作用蛋白质。

结果

所描述的方法常规用于许多不同的目标。这里介绍的是一些使用传统下拉技术可能无法获得的代表性结果。首先是研究特异性ZAD（锌指相关结构域）二聚化¹¹。ZAD形成稳定和特异性的二聚体，异二聚体只能在副同源组内密切相关的结构域之间产生。由这些结构域形成的二聚体是稳定的，至少几天内不会解离;因此，混合纯化的ZAD不会产生任何可检测的结合。同时，MBP和硫氧还蛋白-...

讨论

所描述的方法允许测试不能在 体外 有效组装并需要共表达的蛋白质 - 蛋白质相互作用。该方法是研究异源二聚化蛋白质的少数合适方法之一，这些蛋白质也能够进行同源二聚化，因为当单独纯化时，这些蛋白质形成稳定的同源二聚体，在实验^3，11期间通常不能解离和重新结合。

与传统的下拉相比，所述方法的工作流程更具?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-ELEMENT probe	Sonics	630-0586	The high throughput 8-element sonicator probes
Agar	AppliChem	A0949
Amylose resin	New England Biolabs	E8021	Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics	AppliChem	A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Centrifuge	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutathione	AppliChem	A9782
Glutathione agarose	Pierce	16100	Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF	AppliChem	A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII	Calbiochem	539138	Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS	AppliChem	A2263
Tris	AppliChem	A2264
VC505 sonicator	Sonics	CV334	Ultrasonic liquid processor
ZnCl2	AppliChem	A6285