Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

Resumen

Aquí, describimos un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles, seguido de las técnicas convencionales de pulldown para estudiar complejos de proteínas que no pueden ensamblarse in vitro.

Resumen

Pulldown es un ensayo de interacción proteína-proteína fácil y ampliamente utilizado. Sin embargo, tiene limitaciones en el estudio de complejos de proteínas que no se ensamblan eficazmente in vitro. Tales complejos pueden requerir ensamblaje co-traduccional y la presencia de chaperonas moleculares; O bien forman oligómeros estables que no pueden disociarse y volver a asociarse in vitro o son inestables sin un compañero de unión. Para superar estos problemas, es posible utilizar un método basado en la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles seguidos por las técnicas convencionales de pulldown. El flujo de trabajo es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional porque carece de los pasos que consumen mucho tiempo de purificación separada de proteínas que interactúan y su posterior incubación. Otra ventaja es una mayor reproducibilidad debido a un número significativamente menor de pasos y un período de tiempo más corto en el que las proteínas que existen dentro del ambiente in vitro están expuestas a proteólisis y oxidación. El método se aplicó con éxito para estudiar una serie de interacciones proteína-proteína cuando se descubrió que otras técnicas in vitro no eran adecuadas. El método se puede utilizar para probar por lotes las interacciones proteína-proteína. Se muestran resultados representativos para estudios de interacciones entre el dominio BTB y proteínas intrínsecamente desordenadas, y de heterodímeros de dominios asociados a dedos de zinc.

Introducción

El pulldown convencional es ampliamente utilizado para estudiar las interacciones proteína-proteína¹. Sin embargo, las proteínas purificadas a menudo no interactúan eficazmente in vitro^2,3, y algunas de ellas son insolubles sin su compañero de unión ^4,5. Tales proteínas pueden requerir ensamblaje co-traduccional o la presencia de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Otra limitación del pulldown convencional es el ensayo de una posible actividad de heteromultimerización entre dominios que pueden existir como homooligómeros estables ensamblados co-traduccionalmente ^8,10, ya que muchos de ellos no pueden disociarse y reasociarse in vitro durante el tiempo de incubación. La coexpresión fue encontrada útil para superar tales problemas ^3,11. La coexpresión utilizando vectores compatibles en bacterias se utilizó con éxito para purificar grandes complejos macromoleculares de múltiples subunidades, incluido el complejo represivo polycomb PRC2¹², el módulo¹³ de la cabeza mediadora de la ARN polimerasa II, la placa base del bacteriófago T4 14, el módulo^15,16 de la desubiquitinasa del complejo SAGA y la ferritina¹⁷. Los orígenes de replicación comúnmente utilizados para la coexpresión son ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ y RSF²⁰. En el sistema de expresión Duet disponible comercialmente, estos orígenes se combinan con diferentes genes de resistencia a antibióticos y sitios de clonación múltiples convenientes para producir vectores policistrónicos, lo que permite la expresión de hasta ocho proteínas. Estos orígenes tienen diferentes números de copias y pueden ser utilizados en combinaciones variables para lograr niveles de expresión equilibrados de proteínas diana²¹. Para probar las interacciones proteína-proteína, se utilizan varias etiquetas de afinidad; las más comunes son 6xHistidina, glutatión-S-transferasa (GST) y proteína de unión a maltosa (MBP), cada una de las cuales tiene una afinidad específica con la resina correspondiente. GST y MBP también mejoran la solubilidad y estabilidad de las proteínas marcadas²².

También se han desarrollado varios métodos que involucran la coexpresión de proteínas en células eucariotas, el más destacado de los cuales es el ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H)²³. El ensayo Y2H es barato, fácil y permite probar múltiples interacciones; sin embargo, su flujo de trabajo tarda más de 1 semana en completarse. También hay algunos ensayos basados en células de mamíferos menos utilizados, por ejemplo, el ensayo fluorescente de dos híbridos (F2H)²⁴ y el ensayo de interacción proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)²⁵. El ensayo F2H es relativamente rápido, lo que permite observar las interacciones de proteínas en su entorno celular nativo, pero implica el uso de costosos equipos de imágenes. Todos estos métodos tienen una ventaja sobre la expresión procariota que proporciona la traducción eucariota nativa y el entorno de plegado; Sin embargo, detectan la interacción indirectamente, ya sea por activación transcripcional o por transferencia de energía fluorescente, que a menudo produce artefactos. Además, las células eucariotas pueden contener otros socios de interacción de proteínas de interés, que pueden interferir con la prueba de interacciones binarias entre proteínas de eucariotas superiores.

El presente estudio describe un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente seguido de técnicas convencionales de pulldown. El método permite estudiar las interacciones entre proteínas diana que requieren coexpresión. Es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional, lo que permite la prueba por lotes de múltiples objetivos, lo que lo hace ventajoso en la mayoría de los casos. La coexpresión utilizando vectores compatibles es más conveniente que la coexpresión policistrónica, ya que no requiere un paso laborioso de clonación.

Protocolo

La representación esquemática del flujo de trabajo del método se muestra en la figura 1.

1. Cotransformación de E. coli

1. Preparar vectores de expresión para proteínas diana utilizando métodos de clonación estándar.
   NOTA: Típicamente, un buen punto de partida es utilizar vectores pGEX/pMAL convencionales con un gen de resistencia a la ampicilina y un origen ColE1 para la expresión de proteínas marcadas con GST/MBP y un vector compatible con origen p15A o RSF y resistencia a la kanamicina para expresar proteínas marcadas con 6xHis, en algunos casos combinadas con tiorredoxina o etiqueta SUMO para aumentar la solubilidad. Por lo general, varias combinaciones de etiquetas deben probarse antes del experimento. El método descrito en sí mismo es conveniente para probar por lotes las condiciones de expresión de las proteínas objetivo. Es importante tener en cuenta que la mayoría de las cepas de Rosetta ya contienen el plásmido con origen p15A para expresar los ARNt para codones raros; por lo tanto, si el uso de tales cepas es una opción posible, se deben evitar los plásmidos p15A. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.
   1. Cultivar bacterias de una cepa apropiada en medios Luria-Bertani (LB) a 37 °C hasta una densidad óptica (OD) de 0,1-0,2. La cepa BL21 (DE3) se utilizó como ejemplo en este estudio.
      NOTA: Se recomienda utilizar células competentes recién preparadas para lograr una cotransformación eficiente con dos vectores. Si es necesario co-transformar más de dos vectores, es mejor transformarlos secuencialmente para lograr una buena eficiencia de transformación. La electroporación es una buena alternativa.
   2. Centrifugar 1,0 ml de la suspensión bacteriana durante 1 min a 9.000 x g a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   3. Agregue 0,5 ml de tampón de transformación del tampón (TB) helado (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 y 15 mM CaCl₂) e incube durante 10 min en hielo.
   4. Centrifugar durante 30 s a 8.000 x g a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   5. Agregue 100 μL de tampón TB, agregue 100 ng de cada vector e incube durante 30 minutos en hielo. Transformar por separado vectores individuales para estudiar el comportamiento de las proteínas sin coexpresión. Además, cotransforme vectores de expresión en pares con vectores de coexpresión vacíos para controles de enlace no específicos.
      NOTA: En los ejemplos proporcionados en este estudio, se utilizaron vectores pGEX/pMAL con ADNc correspondientes fusionados con ADNc GST/MBP en combinación con vectores compatibles derivados de pACYC que llevaban dominios de proteínas asociadas que codifican ADNc fusionados con ADNc de tiorredoxina.
   6. Calentar a 42 °C durante 150 s, luego enfriar durante 1 minuto sobre hielo.
   7. Añadir 1 ml de medio LB líquido sin antibióticos e incubar a 37 °C durante 90 min. Placa en placas de agar LB que contienen 0,5% de glucosa y antibióticos correspondientes (las concentraciones comunes son: 50 mg / L de ampicilina; 20 mg / L de kanamicina; 50 mg / L de estreptomicina; 35 mg / L de cloranfenicol). Incubar las placas durante la noche a 37 °C.

2. Expresión

1. Enjuague las células de la placa con 2 ml de medio LB líquido en 50 ml de medio LB con los antibióticos correspondientes (las concentraciones comunes son: 50 mg / L de ampicilina; 20 mg / L de kanamicina; 50 mg / L de estreptomicina; 35 mg / L de cloranfenicol). Agregue iones metálicos u otros cofactores conocidos (en los ejemplos proporcionados en este estudio, se agregó 0.2 mM ZnCl₂ a los medios). Conservar una alícuota con glicerol al 20% a -70 °C para repetir posteriormente el experimento.
   NOTA: Se recomienda eliminar varias colonias directamente de la placa para excluir la posibilidad de mala expresión en un solo clon aislado debido a eventos ocasionales de recombinación entre dos plásmidos.
2. Cultivar las células con una rotación constante de 220 rpm a 37 °C a un OD de 0.5-0.7, enfriar a temperatura ambiente (RT) y agregar isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a 1 mM. Almacenar una alícuota de 20 μL de suspensión celular como control de la muestra no inducida.
3. Incubar las células con una rotación constante de 220 rpm a 18 °C durante la noche.
   NOTA: El tiempo y la temperatura óptimos de incubación pueden variar; 18 ° C durante la noche funciona mejor para la mayoría de las proteínas y se recomienda probarlo por defecto. Reduzca el tiempo de incubación a 2-3 h si se observa una fuerte unión no específica.
4. Divida la suspensión bacteriana en dos partes (o más si se usaron más de dos etiquetas diferentes) y almacene una alícuota de 20 μL de la suspensión celular para confirmar la expresión de proteínas. Centrifugadora a 4.000 x g durante 15 min.
   NOTA: Punto de pausa: los pellets bacterianos pueden almacenarse a -70 °C durante al menos 6 meses.

3. Ensayo pulldown

NOTA: Los procedimientos detallados se describen para las proteínas marcadas con 6xHis o MBP/GST. Todos los procedimientos se realizan a 4°C.

1. Resuspender los gránulos bacterianos en 1 ml de tampón de lisis helada con inhibidores de la proteasa y agentes reductores (ver más abajo) agregados inmediatamente antes del experimento. Evite el ditiotreitol (DTT) cuando use resinas quelantes de metales, ya que elimina los iones metálicos. Ajuste la composición tampón para las proteínas probadas. Las recetas comunes de tampones de lisis que se encuentran adecuados para la mayoría de las proteínas son:
   1. 6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol, 5 mM beta-mercaptoetanol, 1 mM fenilmetilsfulfonilfluoruro (PMSF) y una dilución 1:1,000 del cóctel inhibidor de proteasa (ver Tabla de materiales).
   2. Pulldown GST o MBP: mezcle 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl₂, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF y una dilución 1:1,000 del cóctel inhibidor de proteasa (ver Tabla de materiales).
2. Interrumpir las células por sonicación en hielo. Conservar una alícuota de 20 μl para electroforesis.
   NOTA: Normalmente, se requieren 20-25 pulsos de 5 s con intervalos de 15 s con una potencia de salida de 20 W por muestra. La potencia de sonicación adecuada debe ajustarse para cada instrumento para evitar el sobrecalentamiento y garantizar la interrupción total de la celda. Para lograr un mejor rendimiento, se recomienda encarecidamente utilizar sondas sonicadoras multipunta de alto rendimiento.
3. Centrifugadora a 20.000 x g durante 30 min. Recoger 20 μL del lisado clarificado para su posterior análisis SDS-PAGE.
4. Equilibrar la resina (50 μL para cada muestra) con 1 ml de tampón de lisis helada durante 10 min, centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.
5. Añadir lisados celulares (concentración total de proteínas: 20-50 mg/ml) a la resina, incubar durante 10 min a una rotación constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante. Recoger 20 μL de la fracción no unida para su posterior análisis SDS-PAGE.
6. Agregue 1 ml de tampón de lavado helado e incubar durante 1 minuto. Centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante. Las recetas comunes para los tampones de lavado son:
   1. 6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol y 5 mM beta-mercaptoetanol.
   2. Pulldown GST o MBP: mezcle 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl₂, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol y 5 mM DTT.
7. Realice dos lavados largos: agregue 1 ml de tampón de lavado helado, incubar durante 10-30 minutos con una rotación constante de 15 rpm, centrifugar a 2,000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.
8. Agregue 1 ml de tampón de lavado helado, incubar durante 1 minuto, centrifugar a 2,000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.
9. Eluya las proteínas unidas con 50 μL del tampón de elución en un agitador a 1.200 rpm durante 10 min. Las recetas comunes de tampones de elución son:
   1. 6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol y 5 mM beta-mercaptoetanol.
   2. GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathione (ajustado a pH 7.5 con Tris básico) y 5 mM TDT.
   3. MBP-pulldown: Mezclar 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltosa y 5 mM TDT.
10. Analizar las proteínas eluidas con SDS-PAGE.
    NOTA: El porcentaje de acrilamida debe ajustarse al tamaño de las proteínas. En los ejemplos proporcionados en este estudio, se utilizaron geles de acrilamida al 12%, que funcionan en tampón tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM de glicina, 0,1% SDS) a un voltaje constante de 180 V. Los geles se tiñeron hirviendo en azul de Coomassie al 0,2% R250, ácido acético al 10% y isopropanol al 30%, y se decoloraron hirviendo en ácido acético al 10%. La cantidad de proteína cargada no debe ser igual, ya que varias cantidades de proteínas que interactúan pueden reducirse en diferentes experimentos.

Resultados

El método descrito se utilizó rutinariamente con muchos objetivos diferentes. Aquí se presentan algunos resultados representativos que probablemente no se puedan obtener utilizando técnicas convencionales de pulldown. El primero es el estudio de la dimerización específica ZAD (Zinc-finger-associated domain)¹¹. Los ZAD forman dímeros estables y específicos, con heterodímeros posibles solo entre dominios estrechamente relacionados dentro de grupos parálogos. Los dímeros formados por estos...

Discusión

El método descrito permite probar las interacciones proteína-proteína que no se pueden ensamblar eficientemente in vitro y requieren coexpresión. El método es uno de los pocos enfoques adecuados para estudiar proteínas heterodimerizantes, que también son capaces de homodimerización ya que, cuando se purifican por separado, tales proteínas forman homodímeros estables que con mayor frecuencia no pueden disociarse y volver a asociarse durante el experimento ^3,11

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-ELEMENT probe	Sonics	630-0586	The high throughput 8-element sonicator probes
Agar	AppliChem	A0949
Amylose resin	New England Biolabs	E8021	Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics	AppliChem	A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Centrifuge	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutathione	AppliChem	A9782
Glutathione agarose	Pierce	16100	Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF	AppliChem	A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII	Calbiochem	539138	Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS	AppliChem	A2263
Tris	AppliChem	A2264
VC505 sonicator	Sonics	CV334	Ultrasonic liquid processor
ZnCl2	AppliChem	A6285