АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которым следуют традиционные методы вытягивания для изучения белковых комплексов, которые не могут собираться in vitro.

Аннотация

Pulldown - это простой и широко используемый анализ белково-белкового взаимодействия. Однако у него есть ограничения в изучении белковых комплексов, которые не собираются эффективно in vitro. Такие комплексы могут потребовать котрансляционной сборки и присутствия молекулярных шаперонов; Либо они образуют стабильные олигомеры, которые не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro , либо нестабильны без связывающего партнера. Чтобы преодолеть эти проблемы, можно использовать метод, основанный на бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которыми следуют обычные методы вытягивания. Рабочий процесс более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, поскольку в нем отсутствуют трудоемкие этапы отдельной очистки взаимодействующих белков и их последующей инкубации. Другим преимуществом является более высокая воспроизводимость из-за значительно меньшего количества стадий и более короткого периода времени, в течение которого белки, существующие в среде in vitro , подвергаются протеолизу и окислению. Метод был успешно применен для изучения ряда белок-белковых взаимодействий, когда другие методы in vitro оказались непригодными. Метод может быть использован для пакетного тестирования белок-белковых взаимодействий. Показаны репрезентативные результаты исследований взаимодействий между доменом BTB и внутренне неупорядоченными белками, а также гетеродимеров доменов, связанных с цинковым пальцем.

Введение

Обычный вытягивание широко используется для изучения белково-белковых взаимодействий1. Однако очищенные белки часто не взаимодействуют эффективно in vitro2,3, а некоторые из них нерастворимы без своего партнера по связыванию 4,5. Такие белки могут потребовать котрансляционной сборки или присутствия молекулярных шаперонов 5,6,7,8,9. Другим ограничением обычного вытягивания является тестирование возможной гетеромультимеризационной активности между доменами, которые могут существовать в виде стабильных гомоолигомеров, собранных котрансляционно 8,10, поскольку многие из них не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro во время инкубации. Было обнаружено, что совместное выражение полезно для преодоления таких проблем 3,11. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов в бактериях была успешно использована для очистки больших мультисубъединичных макромолекулярных комплексов, включая поликомбный репрессивный комплекс PRC212, РНК-полимеразу II медиаторный головной модуль13, базовую пластинубактериофага Т4 14, комплекс SAGA деубиквитинилазный модуль 15,16 и ферритин17. Источниками репликации, обычно используемыми для совместной экспрессии, являются ColE1, p15A18, CloDF1319 и RSF20. В коммерчески доступной системе экспрессии Duet эти источники сочетаются с различными генами устойчивости к антибиотикам и удобными несколькими сайтами клонирования для получения полицистронных векторов, позволяющих экспрессировать до восьми белков. Эти источники имеют разное количество копий и могут использоваться в различных комбинациях для достижения сбалансированных уровней экспрессии целевых белков21. Для проверки белок-белковых взаимодействий используются различные аффинные метки; наиболее распространенными являются 6xгистидин, глутатион-S-трансфераза (GST) и мальтозосвязывающий белок (MBP), каждый из которых имеет специфическое сродство к соответствующей смоле. GST и MBP также повышают растворимость и стабильность меченых белков22.

Также был разработан ряд методов, включающих коэкспрессию белка в эукариотических клетках, наиболее известным из которых является двухгибридный анализ дрожжей (Y2H)23. Анализ Y2H дешев, прост и позволяет тестировать несколько взаимодействий; Однако его рабочий процесс занимает более 1 недели. Существует также несколько менее часто используемых анализов на основе клеток млекопитающих, например, флуоресцентный двухгибридный анализ (F2H)24 и анализ белково-белкового взаимодействия клеточного массива (CAPPIA)25. Анализ F2H является относительно быстрым, что позволяет наблюдать белковые взаимодействия в их родной клеточной среде, но требует использования дорогостоящего оборудования для визуализации. Все эти методы имеют преимущество перед прокариотической экспрессией, обеспечивая нативную эукариотическую среду трансляции и складывания; Однако они обнаруживают взаимодействие косвенно, либо путем активации транскрипции, либо путем флуоресцентного переноса энергии, что часто приводит к артефактам. Кроме того, эукариотические клетки могут содержать других партнеров по взаимодействию интересующих белков, что может мешать тестированию бинарных взаимодействий между белками высших эукариот.

В настоящем исследовании описывается метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с последующим использованием традиционных методов вытягивания. Метод позволяет изучать взаимодействия между белками-мишенями, требующими коэкспрессии. Он более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, позволяя проводить пакетное тестирование нескольких целей, что делает его выгодным в большинстве случаев. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов более удобна, чем полицистронная коэкспрессия, поскольку не требует трудоемкого этапа клонирования.

протокол

Схематическое изображение рабочего процесса метода показано на рисунке 1.

1. Котрансформация кишечной палочки

  1. Подготовьте векторы экспрессии для белков-мишеней, используя стандартные методы клонирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, хорошей отправной точкой является использование обычных векторов pGEX/pMAL, несущих ген резистентности к ампициллину и происхождение ColE1 для экспрессии белков, меченных GST/MBP, и совместимого вектора с происхождением p15A или RSF и резистентностью к канамицину для экспрессии белков, меченных 6xHis, в некоторых случаях в сочетании с тиоредоксином или SUMO-меткой для повышения растворимости. Обычно перед экспериментом необходимо протестировать несколько комбинаций тегов. Описанный метод сам по себе удобен для пакетного тестирования условий экспрессии белков-мишеней. Важно отметить, что большинство штаммов Rosetta уже содержат плазмиду с происхождением p15A для экспрессии тРНК для редких кодонов, поэтому, если использование таких штаммов является возможным вариантом, следует избегать плазмид p15A. Подробности см. в Таблице материалов .
    1. Выращивайте бактерии соответствующего штамма в среде Лурия-Бертани (LB) при температуре 37 °C до оптической плотности (OD) 0,1-0,2. Штамм BL21 (DE3) был использован в качестве примеров в этом исследовании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать свежеприготовленные компетентные клетки для достижения эффективного котрансформации с двумя векторами. Если необходимо сопреобразовать более двух векторов, лучше преобразовывать их последовательно, чтобы добиться хорошей эффективности преобразования. Хорошей альтернативой является электропорация.
    2. Центрифугу 1,0 мл бактериальной суспензии в течение 1 мин при 9000 x g при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Добавьте 0,5 мл ледяного буферного буфера трансформации (TB) (10 мМ MOPS [pH 6,7], 250 мМ KCl, 55 мМ MnCl2 и 15 мМ CaCl2) и инкубируйте в течение 10 минут на льду.
    4. Центрифугу в течение 30 с при 8 000 x g при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    5. Добавьте 100 мкл буфера TB, добавьте по 100 нг каждого вектора и инкубируйте в течение 30 минут на льду. Отдельно преобразуйте одиночные векторы для изучения поведения белка без коэкспрессии. Кроме того, можно совместно преобразовывать векторы выражений в парах с пустыми векторами совместного выражения для неспецифических элементов управления привязкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В примерах, приведенных в этом исследовании, векторы pGEX/pMAL с соответствующими кДНК, слитыми с кДНК GST/MBP, использовались в сочетании с совместимыми векторами, полученными из pACYC, несущими кДНК, кодирующие белковые домены-партнеры, слитые с кДНК тиоредоксина.
    6. Нагрейте при температуре 42 °C в течение 150 с, затем охладите в течение 1 минуты на льду.
    7. Добавьте 1 мл жидкой среды LB без антибиотиков и инкубируйте при 37 ° C в течение 90 мин. Планшет на планшетах LB-агара, содержащий 0,5% глюкозы и соответствующие антибиотики (общие концентрации: 50 мг/л ампициллина; 20 мг/л канамицина; 50 мг/л стрептомицина; 35 мг/л хлорамфеникола). Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C.

2. Экспрессия

  1. Промойте клетки из планшета 2 мл жидкой среды LB в 50 мл среды LB с соответствующими антибиотиками (общие концентрации: 50 мг / л ампициллина; 20 мг / л канамицина; 50 мг / л стрептомицина; 35 мг / л хлорамфеникола). Добавьте ионы металлов или другие известные кофакторы (в примерах, приведенных в этом исследовании, всреду добавляли 0,2 мМ ZnCl2). Храните аликвоту с 20% глицерином при -70 °C для последующего повторения эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется промывать несколько колоний непосредственно с пластины, чтобы исключить возможность плохой экспрессии в одном изолированном клоне из-за случайных событий рекомбинации между двумя плазмидами.
  2. Вырастите клетки при постоянном вращении 220 об/мин при 37 °C до OD 0,5-0,7, охладите до комнатной температуры (RT) и добавьте изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до 1 мМ. Храните аликвоту 20 мкл клеточной суспензии в качестве контроля неиндуцированного образца.
  3. Инкубируйте клетки при постоянном вращении 220 об/мин при 18 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время и температура инкубации могут варьироваться; 18 ° C в течение ночи лучше всего подходит для большинства белков, и рекомендуется попробовать по умолчанию. Сокращают время инкубации до 2-3 ч, если наблюдается сильное неспецифическое связывание.
  4. Разделите бактериальную суспензию на две части (или более, если использовалось более двух разных меток) и храните аликвоту 20 мкл клеточной суспензии для подтверждения экспрессии белка. Центрифуга при 4 000 x g в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: бактериальные гранулы можно хранить при температуре -70 °C не менее 6 месяцев.

3. Анализ вытягивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры описаны для белков, помеченных либо 6xHis, либо MBP/GST. Все процедуры проводятся при температуре 4°С.

  1. Ресуспендируют бактериальные гранулы в 1 мл ледяного буфера для лизиса с ингибиторами протеазы и восстановителями (см. Ниже), добавленными непосредственно перед экспериментом. Избегайте дитиотрейтола (DTT) при использовании металл-хелатирующих смол, поскольку он удаляет ионы металлов. Отрегулируйте состав буфера для тестируемых белков. Распространенными рецептами буферов для лизиса, которые подходят для большинства белков, являются:
    1. 6xHis-pulldown: смешайте 30 мМ HEPES (pH 7,5), 400 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 0,1% NP40, 10% [мас./мас.] глицерина, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и разбавление коктейля ингибитора протеазы в соотношении 1:1000 (см. Таблицу материалов).
    2. GST- или MBP-pulldown: смешайте 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2, 0,1 мМ ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [мас./мас.] глицерина, 5 мМ DTT, 1 мМ PMSF и разведение коктейля ингибитора протеазы в соотношении 1:1,000 (см. Таблицу материалов).
  2. Разрушают клетки с помощью обработки ультразвуком на льду. Храните аликвоту 20 мкл для электрофореза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на образец требуется 20-25 импульсов по 5 с с интервалом 15 с с выходной мощностью 20 Вт. Соответствующая мощность обработки ультразвуком должна быть отрегулирована для каждого прибора, чтобы избежать перегрева и обеспечить полное разрушение клеток. Для достижения лучшей производительности настоятельно рекомендуется использовать высокопроизводительные ультразвуковые зонды с несколькими наконечниками.
  3. Центрифуга при 20 000 x g в течение 30 мин. Соберите 20 мкл осветленного лизата для последующего анализа SDS-PAGE.
  4. Уравновесьте смолу (50 мкл для каждого образца) 1 мл ледяного буфера для лизиса в течение 10 мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Добавьте клеточные лизаты (общая концентрация белка: 20-50 мг / мл) в смолу, инкубируйте в течение 10 мин при постоянном вращении 15 об / мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость. Соберите 20 мкл несвязанной фракции для последующего анализа SDS-PAGE.
  6. Добавьте 1 мл ледяного буфера для стирки и выдерживайте в течение 1 минуты. Центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость. Распространенные рецепты буферов для стирки:
    1. 6xHis-pulldown: смешайте 30 мМ HEPES (pH 7,5), 400 мМ NaCl, 30 мМ имидазола, 0,1% NP40, 10% глицерина и 5 мМ бета-меркаптоэтанола.
    2. GST- или MBP-pulldown: смешайте 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2, 0,1 мМ ZnCl2, 0,1% NP40, 10% глицерина и 5 мМ DTT.
  7. Выполните две длительные стирки: добавьте 1 мл ледяного буфера для стирки, выдержите в течение 10-30 минут при постоянном вращении 15 об / мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Добавьте 1 мл ледяного буфера для стирки, выдержите в течение 1 мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Разбавляют связанные белки 50 мкл элюирующего буфера в шейкере при 1 200 об/мин в течение 10 мин. Распространенными рецептами элюирующих буферов являются:
    1. 6xHis-pulldown: смешайте 30 мМ HEPES (рН 7,5), 400 мМ NaCl, 300 мМ имидазола и 5 мМ бета-меркаптоэтанола.
    2. GST-pulldown: 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 150 мМ NaCl, 50 мМ глутатиона (с поправкой на pH 7,5 с базовым Tris) и 5 мМ DTT.
    3. MBP-pulldown: смешайте 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 150 мМ NaCl, 40 мМ мальтозы и 5 мМ DTT.
  10. Проанализируйте элюированные белки с помощью SDS-PAGE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процентное содержание акриламида должно быть скорректировано в соответствии с размером белков. В примерах, приведенных в этом исследовании, использовали 12% акриламидные гели, работающие в буфере трис-глицин-SDS (2 мМ Tris, 250 мМ глицина, 0,1% SDS) при постоянном напряжении 180 В. Гели окрашивали кипячением в 0,2% синем Кумасси R250, 10% уксусной кислотой и 30% изопропанолом и деокрашивали кипячением в 10% уксусной кислоте. Количество загруженного белка не должно быть равным, так как различные количества взаимодействующих белков могут быть вытянуты в разных экспериментах.

Результаты

Описанный метод обычно использовался со многими различными целями. Здесь представлены некоторые репрезентативные результаты, которые, вероятно, не могут быть получены с использованием обычных методов вытягивания. Во-первых, это изучение димеризации специфического ZAD (домена, связанн?...

Обсуждение

Описанный метод позволяет тестировать белок-белковые взаимодействия, которые не могут быть эффективно собраны in vitro и требуют коэкспрессии. Метод является одним из немногих подходящих подходов для изучения гетеродимеризирующих белков, которые также способны к гомодимеризации, т...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке проектов РНФ 19-74-30026 (разработка и валидация метода) и 19-74-10099 (анализ белково-белкового взаимодействия); грант Министерства науки и высшего образования Российской Федерации 075-15-2019-1661 (анализ репрезентативных белок-белковых взаимодействий).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
8-ELEMENT probeSonics630-0586The high throughput 8-element sonicator probes
AgarAppliChemA0949
Amylose resinNew England BiolabsE8021Resin for purification of MBP-tagged proteins
AntibioticsAppliChemA4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanolAppliChemA1108
BL21(DE3) Novagen69450-M
CaCl2AppliChemA4689
CentrifugeEppendorf5415R (Z605212)
GlutathioneAppliChemA9782
Glutathione agarosePierce16100Resin for purification of GST-tagged proteins
GlycerolAppliChemA2926
HEPES AppliChemA3724
HisPur Ni-NTA Superflow AgaroseThermo Scientific25214Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
ImidazoleAppliChemA1378
IPTGAppliChemA4773
KClAppliChemA2939
LBAppliChem414753
MaltoseAppliChemA3891
MOPSAppliChemA2947
NaClAppliChemA2942
NP40Roche11754599001
pACYCDuet-1Sigma-Aldrich71147Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1Sigma-Aldrich71340Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSFAppliChemA0999
Protease Inhibitor Cocktail VIICalbiochem539138Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1Sigma-Aldrich71341Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS AppliChemA2263
Tris AppliChemA2264
VC505 sonicatorSonicsCV334Ultrasonic liquid processor
ZnCl2AppliChemA6285

Ссылки

  1. Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
  2. Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
  3. Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
  4. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
  5. Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
  6. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  7. Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
  8. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  9. Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
  10. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
  11. Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
  12. Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
  13. Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
  14. Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
  15. Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
  16. Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
  17. Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
  18. Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
  19. Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
  20. Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
  21. Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
  22. Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
  23. Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
  24. Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
  25. Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
  26. Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
  27. Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
  28. Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
  29. Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены