JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الدراسة منهجيات زراعة وتجميد وإذابة ومعالجة وتلطيخ ووضع العلامات وفحص كرويات وعضويات كاملة تحت مجاهر مختلفة ، بينما تظل سليمة في هيدروجيل داخل جهاز متعدد الأغراض.

Abstract

أصبحت الكائنات العضوية والكروية ، وهي هياكل متنامية ثلاثية الأبعاد في مختبرات زراعة الخلايا ، معترف بها بشكل متزايد كنماذج متفوقة مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد ، لأنها تحاكي جسم الإنسان بشكل أفضل ولها مزايا على الدراسات على الحيوانات. ومع ذلك ، تواجه هذه الدراسات عادة مشاكل في التكاثر والاتساق. خلال العمليات التجريبية الطويلة - مع نقل المواد العضوية والكروية بين أوعية زراعة الخلايا المختلفة ، والماصات ، وأجهزة الطرد المركزي - غالبا ما تتلف هذه الهياكل المتنامية 3D الحساسة والهشة أو تضيع. في النهاية ، تتأثر النتائج بشكل كبير ، لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. تقلل الطرق الموضحة هنا من هذه الخطوات المجهدة وتضمن بيئة آمنة ومتسقة للعضويات والكروية طوال تسلسل المعالجة بينما لا تزال في هيدروجيل في جهاز متعدد الأغراض. يمكن للباحثين أن ينمووا ، ويتجمدوا ، ويذوبوا ، ويعالجوا ، ويلطخوا ، ويلصقوا ، ثم يفحصون بنية الكائنات العضوية أو الكروية تحت أدوات مختلفة عالية التقنية ، من المجاهر البؤرية إلى المجاهر الإلكترونية ، باستخدام جهاز واحد متعدد الأغراض. تعمل هذه التقنية على تحسين قابلية استنساخ الدراسات وموثوقيتها وصلاحيتها ، مع الحفاظ على بيئة مستقرة ووقائية للهياكل المتنامية 3D أثناء المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التخلص من الخطوات المجهدة يقلل من أخطاء المعالجة ، ويقلل من الوقت المستغرق ، ويقلل من خطر التلوث.

Introduction

يكمن مستقبل أبحاث الخلايا والعلاج في مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد1،2،3. تعمل النماذج العضوية والكروية على سد الفجوة بين التجارب في المختبر والنماذج الحيوانية من خلال إنشاء نماذج أفضل تحاكي نمو جسم الإنسان وعلم وظائف الأعضاء والأمراض4،5،6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن قابلية استنساخ وتكرار هذه النماذج لا تزال صعبة. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع هذه الهياكل وحصادها ونقلها وطردها بالطرد المركزي باستخدام التقنيات الحالية يؤدي إلى فقدان أو تلف المواد العضوية والكروية في العديد من الظروف ، مما يؤثر بشكل كبير على النتائج.

على الرغم من العديد من البروتوكولات الخاصة بالتلوين النسيجي ، والتلوين الكيميائي المناعي ، ووضع العلامات المناعية ، والحفظ بالتبريد ، لا يوجد نهج عالمي يتعلق بتوحيد الظروف التجريبية ، والتعامل مع هذه الهياكل الحساسة ومعالجتها دون فقدانها أو إتلافها. البروتوكولات الحالية هي أيضا طويلة بشكل لا يصدق ، بالتناوب من بضعة أيام إلى عدة أسابيع ، وتشمل إجراءات معقدة مع الكواشف المختلفة10،11،12،13،14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحصاد ، والماصات ، والطرد المركزي ، ونقل الهياكل المتنامية 3D بين أوعية زراعة الخلايا و cryovials تسبب تغييرات في وضع الهياكل والقوى الميكانيكية ، وتؤثر في النهاية على تمايز ونضج المواد العضوية والكروية. تم الإبلاغ عن أن طوبولوجيا الأنسجة ، وتحديد مواقع الخلايا ، والقوى الميكانيكية تؤثر بشكل كبير على تمايز الخلايا ونضجها6،15،16،17.

لذلك ، من المستحسن تحسين التقنيات التقليدية الحالية لتوليد المواد العضوية والكروية بجودة مستقرة. إن الطريقة / الجهاز الذي سيتخطى الطرد المركزي والخطوات الأخرى الموضحة أعلاه ويوفر المواد في بيئة آمنة واحدة من بداية العمليات المتعددة إلى نهايتها سيكون مفيدا للوصول إلى البيانات الأكثر اتساقا وموثوقية. بالإضافة إلى ذلك ، سيؤدي ذلك إلى تقليل قيود الوقت والعمالة والتكلفة.

يوفر الجهاز متعدد الأغراض (MD) الموصوف هنا بيئة آمنة واحدة لعمليات متعددة من المواد العضوية والكروية (الشكل التكميلي 1). يلغي هذا الجهاز والبروتوكولات المكملة خطوات الحصاد والماصات والنقل والطرد المركزي. تبقى المواد العضوية والكروية في بيئتها المختبرية أثناء العمليات المتسلسلة. تتكون هذه البيئة بشكل أساسي من مكونات مصفوفة خارج الخلية طبيعية أو اصطناعية ، مثل الهلاميات المائية المتاحة تجاريا. بمعنى آخر ، تسمح الطرق الموضحة هنا بمعالجة عينة كاملة من المواد العضوية / الكروية وفحصها وتجميدها أثناء وجودها في قطرة هيدروجيل.

الجهاز المتوافق حيويا مقاوم لدرجات الحرارة بين 60 درجة مئوية و -160 درجة مئوية ، مما يجعل من الممكن استعادة المواد العضوية / المنشطات في خزان النيتروجين السائل عند -160 درجة مئوية أو تحضير كتل الراتنج للمجهر الإلكتروني عند 60 درجة مئوية. تم تصميم مكانة الجهاز لتحديد مساحة محدودة للهياكل المتنامية ثلاثية الأبعاد وتحفيز تكوين الأجسام الكروية أو العضوية بناء على الدراسات السابقة18،19،20،21،22،23. هذا الجزء من الجهاز شفاف ويحتوي على بلاستيك محدد يوفر جودة بصرية عالية (معامل الانكسار: 1.43 ؛ قيمة آبي: 58 ؛ السماكة: 7.8 مل [0.0078 بوصة أو 198 ميكرومتر]). يتسبب كل من الكوة والجزء "الجانبي" المحيط في التألق الذاتي. تبلغ مساحة الكوة الشفافة في الوسط 80 مم 2 ، بينما يبلغ الجزء الجانبي 600 مم2. عمق الحاوية 15 مم ، وسمكها 1.5 مم. هذه الميزات ، بالإضافة إلى حجم وتصميم الجهاز ، تجعل من الممكن إجراء ملاحظات تحت أنواع مختلفة من المجهر عالي التقنية وإعداد العينات للفحوصات المجهرية الإلكترونية (الشكل 2). يوفر نظام إغلاق الجهاز وضعين ، أحدهما مغلق في الثلاجة والآخر يسمح بتدفق الغاز في الحاضنة. تظهر فحوصات انتشار CCK8 والسمية الخلوية تأثيرات مماثلة على الخلايا مقارنة بأطباق زراعة الخلايا التقليدية (الشكل التكميلي 2). يوضح اختبار استبعاد التريبان الأزرق قابلية عالية للخلايا (94٪) أثناء زراعة الخلايا في MD (الشكل 3).

تشمل العمليات التي يمكن إجراؤها لعينة واحدة في الجهاز الواحد (1) الزراعة ، (2) التلوين النسيجي ، (3) التلطيخ المناعي ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية الكيميائية والتألقية المناعية ، (4) التجميد ، (5) الذوبان ، (6) الفحص تحت المجاهر الضوئية ، مثل برايتفيلد ، داركفيلد ، مضان ، مجاهر ، بؤرية ، وفائقة الدقة ، (7) طلاء وفحص مباشرة تحت المجهر الإلكتروني الماسح ، أو (8) التحضير للمجهر الإلكتروني النافذ ( الشكل 2).

توجد منهجيات مختلفة للتلطيخ النسيجي ، أو وضع العلامات المناعية الكيميائية ، أو وضع العلامات الفلورية على المواد العضوية والكروية 10،11،12،13،14،24،25. حصادها من هيدروجيل هو الخطوة الأولى والرئيسية للتكنولوجيا الحالية. بعد هذه الخطوة ، تسمح بعض الطرق بوضع العلامات المناعية بالكامل. يتم تضمين المواد العضوية المحصودة في البارافين ، مجزأة ، وموسومة للتلطيخ والمناعة في الآخرين. ومع ذلك ، قد لا تقدم الأقسام العينة بأكملها وتوفر بيانات محدودة فقط تتعلق ببنية 3D للهيكل. علاوة على ذلك ، فإن الأضرار التي لحقت بهذه الهياكل 3D وفقدان المستضدات هي الآثار الجانبية المعروفة لهذه التقنيات.

تسمح البروتوكولات الجديدة التكميلية للفحوصات المجهرية في هذه المقالة بتحليل عينات كاملة لا تزال في هيدروجيل. تتضمن البروتوكولات الموصوفة هنا تركيبتين مطورتين حديثا: محلول للكيمياء الهيستولوجية المناعية (S-IHC) ومحلول لوضع العلامات المناعية (S-IF). تسمح طرق هذه الحلول للباحثين بالحصول على بيانات أكثر دقة ، حيث لا توجد آثار ضارة لسير العمل التقليدي ، مثل الطرد المركزي ، وسحب العينات ، ونقل الهياكل الحساسة. يلغي البروتوكول الموصوف هنا أيضا الحاجة إلى خطوات الحصاد والحجب والتطهير واسترجاع المستضد ، ويقصر الإجراء بأكمله إلى 6-8 ساعات. علاوة على ذلك ، تسمح المنهجية بإضافة واحد إلى ثلاثة أجسام مضادة في وقت واحد إلى نفس S-IF. لذلك ، من الممكن الحصول على النتائج في نفس اليوم حتى بعد تجارب وضع العلامات المتعددة ، وهي ميزة أخرى للبروتوكول الموصوف هنا ؛ عادة ما تستغرق بروتوكولات وضع العلامات المناعية التقليدية الكاملة ما بين 3 أيام وعدة أسابيع10،11،12،13،14.

كما تم حذف تضمين البارافين ، وهو خطوة ضارة أخرى تقلل من المستضد. يبقى هيكل 3D في بيئته في المختبر من بداية إلى نهاية الفحص المجهري. نظرا لأن بنية 3D لا تزال في ظروف نموها ، فإن تعبير البروتين وبيانات التوطين تحاكي ظروف الجسم الحي بشكل أفضل. من المتوقع الحصول على نتائج أكثر دقة ، لأن المنهجية تلغي الخطوات التي تؤثر على تعبير مستضد العينة. يوضح الجدول 1 والجدول 2 كيف أن هذه البروتوكولات الجديدة تلغي الخطوات ، وتوفر الوقت والعمل في المختبر ، وتقلل التكاليف ومنتجات النفايات مقارنة بسير العمل التقليدي.

بالإضافة إلى الخطوات الحاسمة الموضحة أعلاه ، هناك مشكلة أخرى تتمثل في توفير وسيط حفظ بالتبريد وطريقة للحفاظ على بنية 3D للعينة بمعدلات صلاحية خلية أعلى26،27،28،29،30،31. يعد الحفظ بالتبريد ضروريا لإنشاء نظام نموذجي مستقر وتمكين البنوك الحيوية للعضويات والكروية32,33. البنوك الحيوية سيسمح هيكل 3D الأصلي بأكمله بتلخيص أكثر إخلاصا للحالة الطبيعية للصحة أو المرض. الاعتبارات الرئيسية هي راحة وموثوقية الحفظ بالتبريد وذوبان المواد العضوية / الكروية. الانتعاش العضوي بعد الذوبان منخفض جدا في معظم التقنيات الحالية ، وغالبا ما يكون أقل من 50٪. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة نتائج واعدة مع تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة26،27،28،29. أظهر Lee et al. أن 78٪ من الخلايا الكروية نجت بعد الحفظ بالتبريد عندما استخدموا محلول جامعة ويسكونسن الذي يحتوي على 15٪ DMSO28. زادت نسبة بقاء الخلية إلى 83٪ في دراسة Arai et al.29. ومع ذلك ، تتأثر النتائج بعد الحفظ بالتبريد بشكل كبير لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكواشف الخالية من المصل مطلوبة لممارسة التصنيع الجيدة في الإعدادات الصيدلانية والتشخيصية. تستخدم تدفقات العمل التقليدية وسيطا يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS) وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لطريقة التجميد البطيء ، وكلاهما مرتبط بالإعاقات. FBS هو منتج مشتق من الحيوانات ويمكن أن يكون له اختلافات في الدفعات. DMSO هو مادة واقية من التبريد ناجحة للغاية ، ولكن التعرض طويل الأمد ، خاصة أثناء الذوبان ، قد يسبب تأثيرات سامة للخلايا30,31.

توضح هذه المقالة أيضا منهجية التجميد / الذوبان للعضويات أو الكرويات بأكملها أثناء وجودها في هيدروجيل. تم استخدام صيغتين لتجميد المواد العضوية والكروية في الدراسة: (1) 10٪ DMSO يحتوي على محلول تجميد تقليدي (FS) و (2) وسط حفظ بالتبريد خال من المصل و DMSO. يحتوي وسيط الحفظ بالتبريد هذا على مكونات مصفوفة خارج الخلية ، والتي تختلف عن الصيغ الحالية. تتكون المصفوفة خارج الخلية من فئتين رئيسيتين من الجزيئات الكبيرة ، البروتيوغليكان ، والبروتينات الليفية ، والتي تعتبر ضرورية للسقالات الفيزيائية للمكونات الخلوية ، ولكنها تبدأ أيضا العمليات المطلوبة لتشكل الأنسجة والتمايز والتوازن34،35،36،37،38،39،40 . توفر الكولاجين قوة الشد ، وتنظم التصاق الخلايا ، وتدعم الانجذاب الكيميائي والهجرة ، وتطور الأنسجة المباشر37. بالإضافة إلى ذلك ، توفر ألياف الإيلاستين ارتدادا للأنسجة التي تخضع لتمدد متكرر38. يوجه بروتين ليفي ثالث ، الفبرونيكتين ، تنظيم المصفوفة الخلالية خارج الخلية وله دور حاسم في التوسط في ارتباط الخلية ويعمل كمنظم ميكانيكي خارج الخلية39. أظهر Du et al. التأثير الواقي من البرودة لهيدروليزات كولاجين الدجاج على نظام نموذج الأكتوميوسين الطبيعي41. تشير نتائجهم إلى أن تحلل الكولاجين يمكن أن يمنع نمو بلورات الجليد ، ويقلل من تمسخ تجميد البروتين والأكسدة بشكل مشابه للمواد الواقية من التبريد التجارية ، ويوفر بنية هلام أفضل بعد دورات التجميد والذوبان. لذلك ، فإن إضافة مكونات المصفوفة خارج الخلية إلى وسائط الحفظ بالتبريد توفر بيئة أكثر أمانا وحماية للعينة وتدعم الهياكل الحية للشفاء بعد التجميد والذوبان.

بالإضافة إلى ذلك ، تصف الدراسة الحالية بروتوكولا مباشرا لتسمية الأغشية السيتوبلازمية ونوى الكائنات العضوية الحية والكروية أثناء وجودها في الهيدروجيل.

Protocol

1. زراعة المواد العضوية والكروية

  1. ضع الهيدروجيل على الثلج طوال الليل (في الثلاجة أو غرفة باردة) ليذوب.
  2. ضع الجهاز متعدد الأغراض المتاح تجاريا (MD ؛ انظر جدول المواد) في الحاضنة قبل يوم واحد من التجربة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) للتدفئة.
  3. ضع أطراف ماصة معقمة عريضة الأطراف في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 1.1-1.3 في اليوم 0 ، ويجب تنفيذ الخطوات 1.4-1.11 في اليوم الأول.
  4. ضع الهيدروجيل على الثلج في غطاء تدفق رقائقي لمدة 15 دقيقة.
    1. اختياري: قم بتخفيف الهيدروجيل في وسط زراعة الخلايا الباردة وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
  5. ضع الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات من خلايا HepG2 (خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية الذي تم الحصول عليه تجاريا ؛ انظر جدول المواد) على الجليد.
  6. لوحة 30-35 ميكرولتر من هيدروجيل 100 ٪ داخل مكانة الجهاز قبل تسخينه لإنشاء قطرة هلام.
  7. ضع 10000 خلية HepG2 في منتصف الجزء العلوي من كل قطرة هيدروجيل (الشكل 2) ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. قم بتغطية قطرة الهيدروجيل ب 200 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني.
  9. قم بتغطية غطاء MD في الموضع الصحيح للسماح بتدفق الغاز ، وضع الجهاز في الحاضنة.
  10. قم بتغذية الخلايا ب 200 ميكرولتر من DMEM بنسبة 10٪ FBS كل يوم.
  11. تحقق من نمو الأجسام الكروية تحت المجهر المقلوب (الشكل 3). يبدأ التكوين الكرويبعد اليوم 3 . يظهر الفيديو 1 موقع الأجسام الكروية على مستويات مختلفة في قبة هيدروجيل.
    ملاحظات: يوصى بشدة بشفط السائل المحيط بالهيدروجيل برفق وإضافة السائل الجديد ببطء إلى البيئة لمنع إتلاف قطرات الهيدروجيل.

2. تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين المثبت (4٪ بارافورمالدهيد ؛ PFA) ، PBS ، والهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
  2. استنشاق الوسط المحيط بقطرة هيدروجيل باستخدام ماصة ، وأضف 100-200 ميكرولتر من 4٪ PFA لإصلاحه ، واحتضانه لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. استنشاق 4٪ PFA وإضافة 200 ميكرولتر من PBS لغسل 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط PBS واحتضان 200 ميكرولتر من محلول الهيماتوكسيلين لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. شفاط الهيماتوكسيلين وأضف 200 ميكرولتر من dH2O لغسل 3x لمدة 10 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية. استنشاق dH2O واحتضان 200 ميكرولتر من الإيثانول لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. نضح الإيثانول واحتضانه ب 200 ميكرولتر من Eosin (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. نضح Eosin وأضف 200 ميكرولتر من dH2O ليغسل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. استنشاق dH2O وإضافة 100 ميكرولتر من الجلسرين لتغطية قطرة هيدروجيل كوسيط تركيب.
  7. اختياري: قم بتركيب مكانه باستخدام غطاء غطاء. يمكن حذف هذه الخطوة لتجنب الضغط على المواد العضوية / الكروية ذات الحجم الكبير.
  8. أغلق غطاء MD بإحكام لتجنب الجفاف حتى الفحص. العينة مستقرة للفحص لمدة 6 أشهر على الأقل.

3. الكيمياء الهيستولوجية المناعية للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين المحلول الذي تم الحصول عليه تجاريا للكيمياء الهيستولوجية المناعية (S-IHC ؛ انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
  2. احتضان المواد العضوية أو الكروية في الهيدروجيل مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) في 200 ميكرولتر من dH2O لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. نضح محلول بيروكسيد الهيدروجين واغسله في dH2O لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. شفاط dH2O واحتضن مرتين ب 100 ميكرولتر من S-IHC عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  4. قم بشفط S-IHC واحتضان 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي (انظر جدول المواد) المخفف في S-IHC لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية (باتباع توصيات الشركة المصنعة فيما يتعلق بتخفيف العمل).
  5. استنشاق محلول الأجسام المضادة الأساسي واحتضانه ب 100 ميكرولتر من S-IHC 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية.
  6. استنشاق 100 ميكرولتر من S-IHC واحتضان بجسم مضاد ثانوي بيوتينيل (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  7. استنشاق محلول الأجسام المضادة الثانوي واحتضانه ب 100 ميكرولتر من S-IHC 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية. استنشاق S-IHC واحتضان 100 ميكرولتر من بيروكسيديز الفجل (HRP) المسمى الستربتافيدين (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. استنشاق HRP المسمى ستربتافيدين واحتضان 100 ميكرولتر من S-IHC 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية.
  9. قم بشفط S-IHC واحتضانه ب 100 ميكرولتر من خليط محلول كروموجين DAB / AEC (انظر جدول المواد) لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  10. مراقبة شدة تلطيخ تحت المجهر الضوئي.
  11. يغسل ب dH2O 3x لمدة دقيقتين لكل منهما.
  12. اختياري: احتضان 100 ميكرولتر من الهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) للتلطيخ النووي لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  13. نضح الهيماتوكسيلين واغسله في dH2O لمدة 5 دقائق.
  14. قم بشفط dH2O وقم بتغطية قطرة هيدروجيل ب 100 ميكرولتر من الجلسرين كوسائط تركيب.
  15. أغلق غطاء MD بإحكام حتى الفحص المجهري.
    ملاحظات: تم حذف خطوات استرجاع المستضد وحجب البروتين في هذا البروتوكول لأن S-IHC يلغي هذه الخطوات.

4. وضع العلامات المناعية للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين المواد التالية إلى 37 درجة مئوية: 4٪ PFA ، PBS ، S-IF ، محلول الأجسام المضادة الأساسي في S-IF ، محلول الأجسام المضادة الثانوي في S-IF ، البقع النووية ، والجلسرين (انظر جدول المواد).
  2. قم بشفط وسط زراعة الخلية وثبته ب 200 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شفاط المثبت واغسله في S-IF 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما عند 37 درجة مئوية.
  3. أضف dH2O إلى الجانب المحيط بالمكان المناسب لتوفير الرطوبة أثناء الخطوات التالية.
  4. قم بشفط S-IF المحيط بقطرة الهيدروجيل واحتضان قطرة الهيدروجيل ب 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) في S-IF لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. استنشاق محلول الأجسام المضادة الأساسي وغسله في S-IF 3x لمدة 10 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية.
  6. قم بشفط S-IF واحتضان 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي (انظر جدول المواد) في S-IF لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  7. استنشاق محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسله باستخدام PBS 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  8. استنشاق PBS واحتضان 100 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي النووي التي تحتوي على وسط متصاعد أو جلسرين عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  9. املأ مكانه بالجلسرين لتجنب التجفيف.
  10. اختياري: قم بتغطية مكانه بغطاء غطاء. يمكن حذف هذه الخطوة لتجنب الضغط على المواد العضوية / الكروية.
  11. أغلق MD بإحكام. يمكن تخزين العينات في MDs عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 6 أشهر على الأقل مع الحد الأدنى من فقدان التألق.
  12. استخدم الإعدادات التالية للفحص المجهري متحد البؤر: اضبط قيمة الثقب لجميع القنوات على 20.1 ، واحتفظ بثابت الكسب الرئيسي عند 550 ل 488 نانومتر ، و 485 ل 550 نانومتر ، و 450 ل 594 نانومتر ، والحفاظ على طاقة الليزر ثابتة لجميع التجارب ، وأقل نسبة عند 2.0.
    ملاحظات: الأجسام المضادة الأولية: Anti-Na-K ATPase (1:100) ، مضاد الأرجيناز (1:50) ، مضاد الألبومين (1:50) ، مضاد بيتا غالاكتوزيداز (1:25) ، جسم مضاد مضاد للميتوكوندريا (1:100) ، جسم مضاد مضاد لجولجي (1:50) ، مضاد للسيتوكيراتين 5 (1:100) ، جسم مضاد Ov6 (1:100). الأجسام المضادة الثانوية: الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) - 488 ، الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) -550 ، الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) -488 ، الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) -550 ، الماعز المضاد للدجاج IgY (H + L) -647. التخفيف لجميع الأجسام المضادة الثانوية هو 1: 100. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استخدام FITC-Phalloidin (1: 100) ، وهو جسم مضاد مترافق (انظر جدول المواد).

5. غشاء البلازما ووضع العلامات على النواة من الكائنات العضوية الحية والكروية في هيدروجيل

  1. قم بإعداد محلول وضع العلامات الذي يحتوي على أليكسا فلور جنين القمح agglutinin (5.0 ميكروغرام / مل) و Hoechst (2 ميكرومتر) في محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) ، وقم بالتسخين حتى 37 درجة مئوية.
  2. نضح وسط زراعة الخلية وإضافة 100 ميكرولتر من محلول وضع العلامات لتغطية قطرة هيدروجيل. احتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بإزالة محلول الملصقات واغسله مرتين في PBS 2x لمدة 10 دقائق لكل منهما عند 37 درجة مئوية. اختياري: ثبت ب 200 ميكرولتر من 4٪ فورمالديهايد لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. قم بتغطية قطرة هيدروجيل بالجلسرين كوسيط تركيب. اختياري: قم بتركيب مكانه بغطاء زجاجي.
  5. أغلق غطاء MD بإحكام واحتفظ به في الثلاجة في الظلام حتى الفحص المجهري الفلوري / متحد البؤر. إنه مستقر لمدة 6 أشهر على الأقل.

6. تجميد وذوبان المواد العضوية / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتجميد المواد العضوية باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بتسخين محلول التجميد الذي تم الحصول عليه تجاريا (FS ؛ انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
    2. قم بشفط وسائط زراعة الخلايا المحيطة بقبة الهيدروجيل برفق.
    3. أضف 200 ميكرولتر من FS بلطف. احتضان العينة مع FS عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. أغلق غطاء الجهاز بإحكام وضعه في صندوق رغوي. ضع صندوق الرغوة هذا في صندوق رغوة آخر ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 3. أغلق صندوقي الرغوة بإحكام. يوفر صندوقان من الرغوة داخل بعضهما البعض نطاق تدرج تبريد درجة الحرارة من 1 إلى 2 درجة مئوية / دقيقة من العينة في الفريزر -20 درجة مئوية.
    5. ضع الصندوق على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. انقل الصندوق إلى فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية واتركه طوال الليل.
    6. أخرج العينة من الصناديق. يمكن الاحتفاظ بالعينة الموجودة في MD في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
    7. انقل MD الذي يحتوي على العينة إلى خزان النيتروجين السائل لتخزينه على المدى الطويل.
  2. قم بإذابة المواد العضوية باتباع الخطوات أدناه.
    1. أخرج MD الذي يحتوي على العينة من الفريزر / خزان النيتروجين وضعه مباشرة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ إلى مكانه (نسبة FS إلى وسط استزراع الخلية هي 1: 1) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. أضف المزيد من وسط الاستزراع الدافئ إلى الكوة (نسبة FS إلى وسط زراعة الخلية هي 1: 2) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. استنشاق الخليط المتوسط و FS برفق. انتقل إلى المجهر الإلكتروني الماسح (الخطوة 7) والمجهر الإلكتروني النافذ (الخطوة 8) تصوير المواد العضوية / الكروية الكاملة في الهيدروجيل.

7. المسح المجهري الإلكتروني للعضويات / الكروية الكاملة

  1. قم بتسخين محلول Karnovsky المثبت وما بعد التثبيت (انظر جدول المواد) لدرجة حرارة الغرفة (RT).
  2. استنشاق وسط زراعة الخلية المحيطة بالهيدروجيل في MD. ضع العينة في MD على الثلج في غطاء التدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة.
  3. استنشاق هيدروجيل المسال المحيط بالمواد العضوية / الكروية بلطف شديد. يمكن أن تبقى كمية محدودة من matrigel في مكانه لتجنب إتلاف العينة وفقدانها.
  4. ثبت باستخدام مثبت Karnovsky (2٪ PFA ، 2.5٪ جلوتارالدهيد في 0.15 M Cacodylate buffer ، و 2 mM CaCl2 ؛ انظر جدول المواد) في RT لمدة 1 ساعة.
  5. شفاط المثبت برفق واغسله بالماء المقطر (dH2O) 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  6. قم بشفط dH2O برفق وقم بتثبيته بمحلول ما بعد التثبيت (1٪ رابع أكسيد الأوزميوم المائي [OsO4] ؛ انظر جدول المواد) عند RT لمدة 1 ساعة.
  7. شفاط ما بعد التثبيت برفق واغسله بالماء المقطر (dH2O) 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  8. يجفف في سلسلة متدرجة من الإيثانول (30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 96٪ ، 100٪) ، خليط من الإيثانول / الأسيتون (1: 1 ؛ 1: 2) ، والأسيتون المطلق عند RT لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  9. جفف باستخدام مجفف نقطة حرجة.
  10. قم بتغطية العينة في الجهاز ب 6 نانومتر من الذهب / البلاديوم باستخدام طبقة رش (انظر جدول المواد) لمدة 90 ثانية.
  11. راقب تحت المجهر الإلكتروني الماسح باستخدام كاشف إلكترون ثانوي داخل العدسة عند 2-3 كيلو فولت في وضع الفراغ (5 × 10-6 مللي أمبير). التقط صورا بمسافة عمل تبلغ 8.1-8.2 مم وبتكبير 675 ضعفا و1050 ضعفا و1570 ضعفا.
    ملاحظات: يتم تنفيذ جميع الخطوات في MD. استخدم 200-250 ميكرولتر من المحلول لكل خطوة.

8. المجهر الإلكتروني النافذ للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين مثبت Karnovsky إلى 37 درجة مئوية. استنشاق وسط زراعة الخلية المحيطة بالهيدروجيل في MD.
  2. إصلاح العينة مع مثبت Karnovsky في RT لمدة 1 ساعة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  3. بعد الإصلاح مع 2٪ ماء OsO4 و 2.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم في RT لمدة 45 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  4. احتضان 0.5٪ ثيوكاربوهيدرازيد (TCH ؛ انظر جدول المواد) في RT لمدة 30 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  5. احتضان في 2 ٪ OsO4 المائي في RT لمدة 30 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  6. احتضان في محلول أسيتات اليورانيل 2 ٪ (انظر جدول المواد) في RT لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن الاحتفاظ بالأجسام الكروية عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  7. احتضان في محلول أسبارتات الرصاص (انظر جدول المواد) عند 60 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  8. يجفف في سلسلة متدرجة من الإيثانول (50٪ ، 70٪ ، 90٪ ، 100٪ [x2]) والأسيتون المطلق عند RT لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  9. تعامل مع مزيج من (1: 1 ؛ 1: 2) الأسيتون / راتنج إيبون وراتنج إيبون النقي (انظر جدول المواد) في RT لمدة 2 ساعة لكل منهما.
  10. بلمرة الراتنج عند 60 درجة مئوية طوال الليل (بحد أدنى 16 ساعة). بعد البلمرة ، قم بإزالة كتلة الراتنج من MD ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 4.
  11. نعلق كتلة الراتنج إلى واحدة أكبر مع الغراء الراتنج. تقليم الكتلة والوصول إلى موقع المواد العضوية أو كروية.
  12. احصل على أقسام شبه رفيعة (1000 نانومتر) ورقيقة جدا (60 نانومتر) باستخدام ميكروتوم فائق (انظر جدول المواد).
  13. ضع المقاطع الرفيعة جدا على 100 شبكة نحاسية وراقبها تحت المجهر الإلكتروني الماسح باستخدام كاشف STEM بجهد متسارع يبلغ 30 كيلو فولت. التقط صورا بمسافة عمل تبلغ 44 مم وبتكبير 2580 × و5020 × و6060 ضعفا.
    ملاحظات: استخدم 200-250 ميكرولتر من المحلول لكل خطوة. يتم تنفيذ الخطوات 8.1-8.10 في MD.

النتائج

تمثل هذه المقالة جهازا متعدد الأغراض (MD) ومنهجيات تكميلية للزراعة والتجميد والذوبان والتلوين النسيجي والتلوين الكيميائي المناعي ووضع العلامات المناعية والطلاء ومعالجة المواد العضوية أو الكروية بأكملها بينما لا تزال في هيدروجيل في بيئة واحدة مصممة بشكل فريد. تم تصميم الدراسة الحالية لإ?...

Discussion

MD ، المكمل للتركيبات والبروتوكولات الموصوفة هنا ، يسهل النمو السريع والعفوي 3D للعضويات والكروية في بيئة أكثر تحكما ويواصل التجربة في نفس الظروف. تبقى العينة في نفس البيئة خلال العملية بأكملها ، ويبقى ما يقرب من 100٪ من البنى المتنامية 3D سليمة في الحاوية. هذا يحسن التجانس أثناء التجارب المت?...

Disclosures

يمتلك رنان جولهان أكتاس طلبات براءات اختراع MD و S-IHC و S-IF و FS. شارك Olgu Enis Tok في تطوير هذه المنتجات. أولغو إينيس توك وغامزي ديميريل هما عضوان في فريق البحث والتطوير في الشركة المسماة Cellorama. ليس لدى يوسف مصطفى ساتشي وزينب أكبولوت وأوزجيجان كايالار أي تضارب في المصالح يعلنونه.

Acknowledgements

نحن ممتنون لديل ميرتس من جامعة شيكاغو لإعداد الرسوم البيانية، وللدكتور محمد شريف أيدين لدعمه الفني في معهد أبحاث العلوم والتقنيات الصحية بجامعة اسطنبول ميديبول، وللدكتورة رنا كاظمي من جامعة مالتيبي لتحرير المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute Ethanol (EtOH)Merck8187602500Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
AcetoneMerck8222512500Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal AntibodyBiocare MedicalCP 028 AStore at +4 °C
Anti-albumin antibodyAbcamEPR20195Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonalAbcam134435Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5Abcam53121Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal AntibodyBiocare MedicalACI 3058 A, BStore at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC1016-500GDissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Centrifuge tubes, 15 mL Nest601051
Centrifuge tubes, 50 mL Nest602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 IncubatorPanasonicKM-CC17RU2
Copper GridsElectron Microscopy SciencesG100-CuUltra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point DryerLeicaEM CPD300For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture  Sigma AldrichAEC101Store at +4 °C
Diamond knifeDiatomeUltra 45°, 40-USUse for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biologyBiofroxx67-68-5
Disposable Plastic Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Store at +4 °C
Eosin Y Solution AlcoholicBright Slide2.BS01-105-1000
Epon resin Sigma45359-1EA-FEpoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)CelloramaCellO-FStore at +4 °C
Glass knife makerLeicaEM KMR3For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% Electron Microscopy Sciences16210Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solutionSigma Aldrich56-81-5Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647InvitrogenA32933Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35502Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84540Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35552Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84541Store at +4 °C
Hematoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 cellsATCCHB-8065Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6R&D SystemsMAB2020Store at -20 °C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R&D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acidSigma11189-100GStore at RT
Lead aspartate solutionDissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrateElectron Microscopy Sciences17900Store at RT
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal MicroscopeZeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
Nuclear-DNA stainInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stainThermoFischer Scientific62248DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%Electron Microscopy Sciences19190Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibodyR&D systemsMAB2020Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% Sigma1.04005.1000Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tabletsMP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISSZeissItem no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mLNest620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachmentZeissGeminiSEM 500We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2Electron Microscopy Sciences11655Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 °C
Specimen trimming deviceLeicaEM TRIM2For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coaterLeicaEM ACE200Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GDilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2CFor glue polymerized epon block with sample to holder epon block
UltramicrotomeLeicaEM UC7For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µLNest171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µLIsolabL-002
Universal Pipette Tips, 200 µL Nest110919HA01
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

References

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved