JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем исследовании описываются методологии культивирования, замораживания, оттаивания, обработки, окрашивания, маркировки и изучения целых сфероидов и органоидов под различными микроскопами, в то время как они остаются нетронутыми в гидрогеле в многоцелевом устройстве.

Аннотация

Органоиды и сфероиды, трехмерные растущие структуры в лабораториях клеточных культур, становятся все более признанными в качестве превосходных моделей по сравнению с двумерными моделями культур, поскольку они лучше имитируют человеческое тело и имеют преимущества перед исследованиями на животных. Тем не менее, эти исследования обычно сталкиваются с проблемами воспроизводимости и последовательности. Во время длительных экспериментальных процессов - с переносом органоидов и сфероидов между различными сосудами клеточной культуры, пипеткой и центрифугированием - эти восприимчивые и хрупкие 3D-растущие структуры часто повреждаются или теряются. В конечном счете, результаты существенно влияют, так как 3D-структуры не могут поддерживать те же характеристики и качество. Методы, описанные здесь, минимизируют эти стрессовые этапы и обеспечивают безопасную и последовательную среду для органоидов и сфероидов на протяжении всей последовательности обработки, пока они все еще находятся в гидрогеле в многоцелевом устройстве. Исследователи могут выращивать, замораживать, оттаивать, обрабатывать, окрашивать, маркировать, а затем исследовать структуру органоидов или сфероидов с помощью различных высокотехнологичных инструментов, от конфокальных до электронных микроскопов, используя одно многоцелевое устройство. Эта технология улучшает воспроизводимость, надежность и валидность исследований, сохраняя при этом стабильную и защитную среду для 3D-растущих структур во время обработки. Кроме того, устранение стрессовых шагов сводит к минимуму ошибки обработки, сокращает время и снижает риск загрязнения.

Введение

Будущее клеточных исследований и терапии лежит в 3D клеточных культурах 1,2,3. Органоидные и сфероидные модели сокращают разрыв между экспериментами in vitro и моделями на животных, создавая лучшие модели, которые имитируют развитие человеческого тела, физиологию и болезни 4,5,6,7,8,9. Однако воспроизводимость и повторяемость этих моделей остаются сложными. Кроме того, обработка, сбор, перенос и центрифугирование этих структур с помощью современных технологий приводит к потере или повреждению органоидов и сфероидов во многих условиях, что значительно влияет на результаты.

Несмотря на множество протоколов гистологического окрашивания, иммуногистохимического окрашивания, иммунофлуоресцентной маркировки и криоконсервации, не существует универсального подхода, связанного со стандартизацией экспериментальных условий, обработкой и обработкой этих деликатных структур без их потери или повреждения. Современные протоколы также невероятно длинные, чередующиеся от нескольких дней до нескольких недель, и включают в себя сложные процедуры с различными реагентами 10,11,12,13,14. Кроме того, сбор, пипетка, центрифугирование и перенос 3D-растущих структур между сосудами клеточной культуры и криовиалами вызывают изменения в позиционировании структур и механических сил и в конечном итоге влияют на дифференцировку и созревание органоидов и сфероидов. Сообщалось, что топология тканей, позиционирование клеток и механические силы значительно влияют на дифференцировку и созревание клеток 6,15,16,17.

Поэтому желательно усовершенствовать современные традиционные технологии получения органоидов и сфероидов со стабильным качеством. Способ/устройство, которое пропустит центрифугирование и другие этапы, описанные выше, и обеспечит материал в единой безопасной среде от начала до конца нескольких процессов, было бы полезно для получения наиболее последовательных и надежных данных. Кроме того, это сократит временные, трудовые и финансовые ограничения.

Многоцелевое устройство (MD), описанное здесь, обеспечивает единую безопасную среду для нескольких процессов органоидов и сфероидов (дополнительный рисунок 1). Это устройство и дополняющие его протоколы исключают этапы сбора, пипетирования, передачи и центрифугирования. Органоиды и сфероиды остаются в своей среде in vitro во время последовательных процессов. Эта среда в основном содержит природные или синтетические компоненты внеклеточного матрикса, такие как коммерчески доступные гидрогели. Другими словами, методы, описанные здесь, позволяют обрабатывать, исследовать и замораживать целый образец органоидов / сфероидов, все еще находясь в капле гидрогеля.

Биосовместимое устройство устойчиво к температурам от 60 °C до -160 °C, что позволяет восстанавливать органоиды/стероиды в резервуаре с жидким азотом при -160 °C или готовить смоляные блоки для электронной микроскопии при 60 °C. Ниша в устройстве была разработана для определения ограниченного пространства для 3D-растущих структур и стимулирования образования сфероидов или органоидов на основе предыдущих исследований 18,19,20,21,22,23. Эта часть устройства прозрачна и содержит специфический пластик, который обеспечивает высокое оптическое качество (показатель преломления: 1,43; значение аббе: 58; толщина: 7,8 мил [0,0078 дюйма или 198 мкм]). Как ниша, так и окружающая «боковая» часть вызывают автофлуоресценцию. Прозрачная ниша в центре имеет площадь 80мм2, в то время как боковая часть составляет 600мм2. Глубина контейнера составляет 15 мм, а толщина – 1,5 мм. Эти особенности, помимо размеров и конструкции прибора, позволяют производить наблюдения под разными типами высокотехнологичных микроскопов и готовить образцы к электронно-микроскопическим исследованиям (рисунок 2). Система закрытия устройства обеспечивает два положения, одно из которых герметично в морозильной камере, а другое позволяет потоку газа в инкубаторе. Анализы пролиферации и цитотоксичности CCK8 демонстрируют аналогичное воздействие на клетки по сравнению с традиционными чашками для клеточной культуры (дополнительный рисунок 2). Тест на исключение синего трипана демонстрирует высокую жизнеспособность клеток (94%) во время клеточной культуры в MD (рисунок 3).

Процессы, которые могут быть выполнены для одного образца в одном устройстве, включают (1) культивирование, (2) гистологическое окрашивание, (3) иммуноокрашивание, включая иммуногистохимическую и иммунофлуоресцентную маркировку, (4) замораживание, (5) оттаивание, (6) исследование под оптическими микроскопами, такими как микроскопы яркого поля, темного поля, флуоресценции, конфокальные микроскопы и микроскопы сверхвысокого разрешения, (7) покрытие и исследование непосредственно под сканирующим электронным микроскопом или (8) подготовку к просвечивающей электронной микроскопии ( Рисунок 2).

Существуют различные методологии для гистологического окрашивания, иммуногистохимической маркировки или флуоресцентной маркировки органоидов и сфероидов 10,11,12,13,14,24,25. Сбор их из гидрогеля является первым и основным этапом современной технологии. После этого этапа некоторые методы позволяют полностью установить иммуномаркировку. Извлеченные органоиды встроены в парафин, разделены и помечены для окрашивания и иммуноокрашения в других. Однако разделы могут не представлять весь образец и предоставлять только ограниченные данные, связанные с 3D-архитектурой структуры. Кроме того, повреждение этих 3D-структур и потеря антигенности являются хорошо известными побочными эффектами этих технологий.

Дополняющие новые протоколы микроскопических исследований в этой статье позволяют анализировать цельномонтные образцы, все еще находящиеся в гидрогеле. Протоколы, описанные здесь, включают два недавно разработанных состава: раствор для иммуногистохимии (S-IHC) и раствор для иммунофлуоресцентной маркировки (S-IF). Методы с этими решениями позволяют исследователям получать более точные данные, поскольку нет вредных последствий традиционных рабочих процессов, таких как центрифугирование, пипетка и перенос деликатных структур. Протокол, описанный здесь, также устраняет необходимость в сборах, блокировании, очистке и извлечении антигенов и сокращает всю процедуру до 6-8 ч. Кроме того, методика позволяет одновременно добавлять от одного до трех антител к одному и тому же S-IF. Таким образом, можно получить результаты в один и тот же день даже после нескольких экспериментов по маркировке, что является еще одним преимуществом протокола, описанного здесь; Традиционные протоколы маркировки иммунофлуоресценции обычно занимают от 3 дней до нескольких недель 10,11,12,13,14.

Встраивание парафина, еще один вредный шаг, снижающий антигенность, также опущено. 3D-структура остается в своей среде in vitro от начала до конца микроскопического исследования. Поскольку 3D-структура остается в условиях выращивания, данные экспрессии и локализации белка лучше имитируют условия in vivo. Ожидаются более точные результаты, поскольку методология исключает этапы, влияющие на экспрессию антигена образца. В таблицах 1 и 2 показано, как эти новые протоколы устраняют этапы, экономят время и трудозатраты в лаборатории, а также снижают затраты и отходы по сравнению с традиционными рабочими процессами.

В дополнение к критическим шагам, описанным выше, другой проблемой является обеспечение криоконсервационной среды и метода сохранения 3D-структуры образца с более высокими показателями жизнеспособности клеток 26,27,28,29,30,31. Криоконсервация необходима для создания стабильной модельной системы и обеспечения биобанкинга органоидов и сфероидов32,33. Биобанкинг всей оригинальной 3D-структуры позволит более точно повторить естественное состояние здоровья или болезни. Ключевыми соображениями являются удобство и надежность криоконсервации и оттаивания органоидов/сфероидов. Восстановление органоидов после оттепели очень низкое в большинстве современных технологий, часто менее 50%. Тем не менее, недавние исследования показали многообещающие результаты с улучшенными показателями выживаемости 26,27,28,29. Lee et al. продемонстрировали, что 78% сфероидных клеток выжили после криоконсервации, когда они использовали раствор Университета Висконсина, содержащий 15% DMSO28. Коэффициент выживаемости клеток увеличился до 83% в исследовании Arai et al.29. Тем не менее, результаты после криоконсервации значительно влияют, поскольку 3D-структуры не могут поддерживать те же характеристики и качество. Кроме того, безсывороточные реагенты необходимы для надлежащей производственной практики в фармацевтических и диагностических учреждениях. Традиционные рабочие процессы используют среду, содержащую фетальную бычью сыворотку (FBS) и диметилсульфоксид (DMSO) для метода медленного замораживания, оба из которых связаны с инвалидностью. FBS является продуктом животного происхождения и может иметь варианты партии. ДМСО является очень успешным криопротектором, но длительное воздействие, особенно во время оттаивания, может вызвать цитотоксические эффекты30,31.

В этой статье также описывается методология замораживания / оттаивания целых органоидов или сфероидов, все еще находящихся в гидрогеле. В исследовании используются две формулы для замораживания органоидов и сфероидов: (1) 10% ДМСО, содержащий традиционный морозильный раствор (ФС) и (2) безкриоконсервационная среда без сыворотки и ДМСО. Эта криоконсервационная среда содержит компоненты внеклеточного матрикса, которые отличаются от современных формул. Внеклеточный матрикс содержит два основных класса макромолекул, протеогликанов и волокнистых белков, которые необходимы для физического формирования каркасов для клеточных компонентов, но также инициируют процессы, необходимые для морфогенеза, дифференцировки и гомеостаза 34,35,36,37,38,39,40 . Коллагены обеспечивают прочность на растяжение, регулируют адгезию клеток, поддерживают хемотаксис и миграцию, а также направляют развитие тканей37. Кроме того, волокна эластина обеспечивают отдачу тканям, которые подвергаются повторному растяжению38. Третий фиброзный белок, фибронектин, направляет организацию интерстициального внеклеточного матрикса и играет решающую роль в опосредовании прикрепления клеток и функционирует как внеклеточный механорегулятор39. Du et al. продемонстрировали криопротекторное действие гидролизата куриного коллагена на естественную модельную систему41 актомиозина. Их результаты показывают, что гидролизат коллагена может ингибировать рост кристаллов льда, уменьшать замораживание-денатурацию и окисление белка аналогично коммерческим криопротекторам и обеспечивать лучшую структуру геля после циклов замораживания-оттаивания. Таким образом, добавление компонентов внеклеточного матрикса в криоконсервационную среду обеспечивает более безопасную и защитную среду для образца и поддерживает заживление живых структур после замораживания-оттаивания.

Кроме того, настоящее исследование описывает простой протокол для маркировки цитоплазматических мембран и ядер живых органоидов и сфероидов, пока они все еще находятся в гидрогеле.

протокол

1. Культивирование органоидов и сфероидов

  1. Поместите гидрогель на лед на ночь (в холодильник или холодную камеру) для размораживания.
  2. Поместите коммерчески доступное многоцелевое устройство (MD; см. Таблицу материалов) в инкубатор за 1 день до эксперимента (37 °C, 5% CO2) для нагревания.
  3. Поместите стерильные ширококонечные наконечники пипеток в холодильник при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1-1.3 должны быть выполнены в День 0, а шаги 1.4-1.11 должны быть выполнены в День 1.
  4. Поместите гидрогель на лед в ламинарную вытяжку на 15 минут.
    1. Необязательно: Разбавьте гидрогель в культуральной среде холодных клеток в соответствии с рекомендацией производителя.
  5. Поместите на лед трубку, содержащую гранулу клеток HepG2 (коммерчески полученная клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы; см. Таблицу материалов).
  6. Пластина 30-35 мкл 100% гидрогеля в нише предварительно разогретого устройства для создания капли геля.
  7. Поместите 10 000 клеток HepG2 в середину верхней части каждой капли гидрогеля (рисунок 2) и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C.
  8. Покройте каплю гидрогеля 200 мкл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) 10% фетальной бычьей сывороткой.
  9. Закройте крышку MD в правильном положении, чтобы обеспечить поток газа, и поместите устройство в инкубатор.
  10. Кормите клетки 200 мкл DMEM с 10% FBS через день.
  11. Проверьте рост сфероидов под перевернутым микроскопом (рисунок 3). Образование сфероидов начинается после3-го дня. На видео 1 показано расположение сфероидов на разных уровнях в гидрогелевом куполе.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Настоятельно рекомендуется осторожно аспирировать жидкость, окружающую гидрогель, и медленно добавлять новую жидкость в окружающую среду, чтобы предотвратить повреждение капель гидрогеля.

2. Окрашивание гематоксилином и эозином целых органоидов/сфероидов в гидрогель

  1. Прогреть фиксатор (4% параформальдегид; PFA), PBS и гематоксилин (см. Таблицу материалов) до 37 °C.
  2. Аспирировать среду, окружающую каплю гидрогеля, пипеткой, добавить 100-200 мкл 4% PFA для фиксации и инкубировать в течение 15-20 мин при 37 °C.
  3. Аспирировать 4% PFA и добавить 200 мкл PBS для промывки 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C. Затем аспирируют PBS и инкубируют с 200 мкл раствора гематоксилина в течение 15-20 мин при 37 °C.
  4. Аспирировать гематоксилин и добавить 200 мкл dH2Oдля промывки 3x в течение 10 мин при 37 °C. Аспирировать dH2Oи инкубировать с 200 мкл этанола в течение 5-10 мин при 37 °C.
  5. Аспирировать этанол и инкубировать с 200 мкл Эозина (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °С. Аспирировать Эозин и добавить 200 мкл dH2Oдля промывки в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
  6. Аспирировать dH2Oи добавить 100 мкл глицерина, чтобы покрыть каплю гидрогеля в качестве монтажной среды.
  7. Дополнительно: Установите нишу с помощью крышки. Этот шаг может быть опущен, чтобы избежать сжатия органоидов / сфероидов значительного размера.
  8. Плотно закройте крышку MD, чтобы избежать высыхания до осмотра. Образец стабилен для исследования не менее 6 месяцев.

3. Иммуногистохимия цельногорных органоидов/сфероидов в гидрогеле

  1. Нагреть коммерчески полученный раствор для иммуногистохимии (S-IHC; см. Таблицу материалов) до 37 °C.
  2. Инкубируют органоиды или сфероиды в гидрогеле с 3% перекисью водорода (H2O2) в 200 мкл dH2Oв течение 5 мин при 37 °C.
  3. Аспирировать раствор перекиси водорода и промыть в dH2Oв течение 5 мин при 37 °C. Аспирировать dH2Oи инкубировать дважды со 100 мкл S-IHC при 37 °C в течение 10 мин каждый.
  4. Аспирировать S-IHC и инкубировать со 100 мкл первичных антител (см. Таблицу материалов), разбавленных в S-IHC в течение 1-2 ч при 37 °C (в соответствии с рекомендациями производителя относительно рабочего разбавления).
  5. Аспирировать раствор первичного антитела и инкубировать со 100 мкл S-IHC 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C.
  6. Аспират 100 мкл S-IHC и инкубат с биотинилированным вторичным антителом (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °C.
  7. Аспирировать раствор вторичного антитела и инкубировать со 100 мкл S-IHC 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C. Аспирировать S-IHC и инкубировать со 100 мкл пероксидазы хрена (HRP), меченной стрептавидином (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °C.
  8. Аспирировать HRP меченый стрептавидин и инкубировать со 100 мкл S-IHC 3x в течение 5 мин каждый при 37 °C.
  9. Аспирировать S-IHC и инкубировать со 100 мкл смеси растворов хромогена DAB/AEC (см. Таблицу материалов) в течение 5-10 мин при 37 °C.
  10. Контролируйте интенсивность окрашивания под световым микроскопом.
  11. Стирайте с dH2O 3x в течение 2 мин каждый.
  12. Необязательно: Инкубировать со 100 мкл гематоксилина (см. Таблицу материалов) для ядерного контрокрашивания в течение 5 мин при 37 °C.
  13. Аспирировать гематоксилин и промыть в dH2Oв течение 5 мин.
  14. Аспирировать dH2Oи покрыть каплю гидрогеля 100 мкл глицерина в качестве монтажной среды.
  15. Плотно закройте крышку МД до микроскопического исследования.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Этапы извлечения антигена и блокирования белка в этом протоколе опущены, поскольку S-IHC исключает эти шаги.

4. Иммунофлуоресцентная маркировка целых органоидов/сфероидов в гидрогеле

  1. Разогрейте следующие материалы до 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, раствор первичных антител в S-IF, раствор вторичных антител в S-IF, ядерное пятно и глицерин (см. Таблицу материалов).
  2. Аспирировать клеточную культуральную среду и зафиксировать 200 мкл 4% PFA в течение 15-30 мин при 37 °C. Аспирировать фиксатор и мыть в S-IF 3x в течение 10 мин каждый при 37 °C.
  3. Добавьте dH2O в сторону, окружающую нишу, чтобы обеспечить влажность во время следующих шагов.
  4. Аспирировать S-IF, окружающий каплю гидрогеля, и инкубировать каплю гидрогеля со 100 мкл раствора первичного антитела (см. Таблицу материалов) в S-IF в течение 30-60 мин при 37 °C.
  5. Аспирировать раствор первичных антител и промывать в S-IF 3x в течение 10 мин каждый при 37 °C.
  6. Аспирировать S-IF и инкубировать со 100 мкл раствора вторичных антител (см. Таблицу материалов) в S-IF в течение 30-60 мин при 37 °C в темноте.
  7. Аспирировать раствор вторичных антител и промыть PBS 3x в течение 10 мин каждый при 37 °C в темноте.
  8. Аспирировать PBS и инкубировать со 100 мкл ядерно-ДНК-пятна, содержащего монтажную среду или глицерин при 37 °C в темноте.
  9. Заполните нишу глицерином, чтобы избежать высыхания.
  10. Необязательно: Накройте нишу чехлом. Этот шаг может быть опущен, чтобы избежать сжатия органоидов / сфероидов.
  11. Плотно закройте MD. Образцы в MD могут храниться при 4 °C в темноте в течение не менее 6 месяцев с минимальной потерей флуоресценции.
  12. Используйте следующие настройки для конфокального микроскопического исследования: установите значение точечного отверстия всех каналов равным 20,1, удерживайте постоянную мастера усиления на уровне 550 для 488 нм, 485 для 550 нм и 450 для 594 нм, сохраняйте постоянную мощность лазера для всех экспериментов и самый низкий процент в 2,0.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Первичные антитела: Анти-Na-K АТФаза (1:100), Антиаргиназа (1:50), Антиальбумин (1:50), Анти-Бета-галактозидаза (1:25), Антимитохондриальное антитело (1:100), Анти-Гольджи Антитело (1:50), Анти-Цитокератин 5 (1:100), Антитело Ov6 (1:100). Вторичные антитела: Козий анти-Кролик IgG (H + L) - 488, Коза против Кролика IgG (H + L) - 550, Коза против Мыши IgG (H + L) -488, Коза против Мыши IgG (H + L) -550, Коза против Курицы IgY (H + L) -647. Разведение для всех вторичных антител составляет 1:100. Кроме того, также используется FITC-Фаллоидин (1:100), конъюгированное антитело (см. Таблицу материалов).

5. Плазматическая мембрана и маркировка ядра живых органоидов и сфероидов в гидрогеле

  1. Приготовьте раствор для маркировки, содержащий агглютинин зародышей пшеницы Alexa (5,0 мкг/мл) и Hoechst (2 мкМ) в сбалансированном растворе соли Хэнка (HBSS), согласно рекомендациям производителя (см. Таблицу материалов), и прогрейте до 37 °C.
  2. Аспирировать клеточную культуральную среду и добавить 100 мкл маркировочного раствора, чтобы покрыть каплю гидрогеля. Инкубировать в течение 15-30 мин при 37 °C.
  3. Снимите раствор для маркировки и дважды промойте в PBS 2x в течение 10 мин каждый при 37 °C. Необязательно: Фиксировать с 200 мкл 4% формальдегида в течение 15 мин при 37 °C.
  4. Накройте каплю гидрогеля глицерином в качестве монтажной среды. Дополнительно: Установите нишу с помощью защитного стекла.
  5. Плотно закройте крышку MD и держите его в холодильнике в темноте до флуоресценции / конфокального микроскопического исследования. Он стабилен в течение не менее 6 месяцев.

6. Замораживание и размораживание цельномонтных органоидов/сфероидов в гидрогеле

  1. Заморозьте органоиды, выполнив следующие действия.
    1. Разогрейте коммерчески полученный морозильный раствор (ФС; см. Таблицу материалов) до 37 °C.
    2. Мягко аспирируйте клеточную культуральную среду, окружающую купол гидрогеля.
    3. Осторожно добавьте 200 мкл FS. Инкубировать образец с FS при 37 °C в течение 1 ч.
    4. Плотно закройте крышку устройства и поместите его в пенопластовую коробку. Поместите эту пенопластовую коробку в другую пенопластовую коробку, как показано на дополнительном рисунке 3. Плотно закройте оба пенопластовых ящика. Два пенопластовых ящика внутри друг друга обеспечивают диапазон градиента охлаждения температуры от 1 до 2°С/мин образца в морозильной камере с температурой -20 °C.
    5. Поместите коробку при -20 °C в течение 2 ч. Переложите коробку в морозильную камеру при температуре -80 °C и оставьте на ночь.
    6. Достаньте образец из коробок. Образец в MD можно хранить в морозильной камере -80 °C в течение 6 месяцев.
    7. Перенесите MD, содержащий образец, в резервуар для жидкого азота для долгосрочного хранения.
  2. Разморозьте органоиды, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Извлеките МД, содержащий образец, из морозильной камеры/азотного резервуара и поместите его непосредственно в инкубатор при температуре 37 °C. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
    2. Добавьте в нишу 200 мкл теплой питательной среды (отношение FS к клеточной культуральной среде составляет 1:1) и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C.
    3. Добавьте в нишу больше теплой питательной среды (отношение ФС к клеточной культуральной среде составляет 1:2) и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C.
    4. Аспирируйте смесь среды и ФС осторожно. Приступают к сканирующей электронной микроскопии (стадия 7) и просвечивающей электронной микроскопии (стадия 8) визуализации органоидов/сфероидов в гидрогеле.

7. Сканирующая электронная микроскопия целых органоидов/сфероидов

  1. Разогрейте фиксирующий и постфиксативный раствор Карновского (см. Таблицу материалов) до комнатной температуры (RT).
  2. Аспирировать клеточную культуральную среду, окружающую гидрогель в МД. Поместите образец в MD на льду в ламинарную вытяжку на 15 минут.
  3. Очень мягко аспирируйте сжиженный гидрогель, окружающий органоиды/сфероиды. Ограниченное количество матригеля может оставаться в нише, чтобы избежать повреждения и потери образца.
  4. Фиксатор Карновского (2% PFA, 2,5% глутаральдегида в буфере 0,15 М какодилата и 2 мМ CaCl2; см. Таблицу материалов) при РТ в течение 1 ч.
  5. Аккуратно аспирировать фиксатор и промыть дистиллированной водой (dH2O) 3x в течение 15 мин каждый.
  6. Аспирировать dH2Oосторожно и зафиксировать постфиксативным раствором (1% водный тетроксид осмия [OsO4]; см. Таблицу материалов) при РТ в течение 1 ч.
  7. Осторожно аспирировать постфиксирующее средство и промыть дистиллированной водой (dH2O) 3x в течение 15 мин каждый.
  8. Обезвоживание в градуированном ряду этанола (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), смеси этанола/ацетона (1:1; 1:2) и абсолютного ацетона при РТ в течение 15 мин каждый.
  9. Высушите сушилкой критической точки.
  10. Покройте образец в устройстве 6-нм золотом/палладием с помощью напыляющего коатера (см. Таблицу материалов) в течение 90 с.
  11. Наблюдать под сканирующим электронным микроскопом с помощью вторичного электронного детектора в линзе при 2-3 кВ в вакуумном режиме (5 х 10-6 мА). Делайте снимки с рабочим расстоянием 8,1–8,2 мм и увеличением 675x, 1050x и 1570x.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Все шаги выполняются в MD. Используйте 200-250 мкл раствора для каждого шага.

8. Просвечивающая электронная микроскопия цельномонтовых органоидов/сфероидов в гидрогеле

  1. Разогрейте фиксатор Карновского до 37 °C. Аспирировать клеточную культуральную среду, окружающую гидрогель в МД.
  2. Зафиксируйте образец фиксатором Карновского на RT в течение 1 ч. Стирайте с dH2O 3x в течение 15 мин каждый.
  3. Постфиксируют с 2% водным раствором OsO4 и 2,5% ферроцианида калия на RT в течение 45 мин. Стирайте с dH2O 3x в течение 10 мин каждый.
  4. Инкубировать в 0,5% тиокарбогидразида (ТКП; см. Таблицу материалов) при РТ в течение 30 мин. Стирайте с dH2O 3x в течение 10 мин каждый.
  5. Инкубировать в 2% водном растворе OsO4 при RT в течение 30 мин. Стирайте с dH2O 3x в течение 10 мин каждый.
  6. Инкубировать в 2% растворе уранилацетата (см. Таблицу материалов) на РТ в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе сфероиды можно хранить при температуре 4 °C в течение ночи.
  7. Инкубировать в растворе аспартата свинца (см. Таблицу материалов) при 60 °C в течение 45 мин. Стирайте с dH2O 3x в течение 10 мин каждый.
  8. Обезвоживание в градуированной серии этанола (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) и абсолютного ацетона на RT в течение 15 мин каждый.
  9. Обрабатывайте смесью (1:1; 1:2) ацетона/эпоновой смолы и чистой эпоновой смолы (см. Таблицу материалов) при РТ в течение 2 ч каждая.
  10. Полимеризуйте смолу при 60 °C в течение ночи (минимум 16 ч). После полимеризации удалите смоляной блок из MD, как показано на дополнительном рисунке 4.
  11. Прикрепите смоляной блок к более крупному с помощью смоляного клея. Обрежьте блок и доберитесь до расположения органоидов или сфероидов.
  12. Получайте полутонкие (1000 нм) и ультратонкие сечения (60 нм) с помощью ультрамикротома (см. Таблицу материалов).
  13. Поместите ультратонкие срезы на 100-сетчатые медные решетки и наблюдайте под сканирующим электронным микроскопом с детектором STEM при ускоряющем напряжении 30 кВ. Снимайте изображения с рабочим расстоянием 44 мм и увеличением 2580x, 5020x и 6060x.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Используйте 200-250 мкл раствора для каждого этапа. Шаги 8.1-8.10 выполняются в MD.

Результаты

Настоящая статья представляет собой многоцелевое устройство (MD) и дополняющие методологии для культивирования, замораживания, оттаивания, гистологического окрашивания, иммуногистохимического окрашивания, иммунофлуоресцентной маркировки, покрытия и обработки целых органоидов или с...

Обсуждение

MD, дополняя описанные здесь составы и протоколы, способствует быстрому и спонтанному 3D-росту органоидов и сфероидов в более контролируемой среде и продолжает эксперимент в тех же условиях. Образец остается в одной и той же среде в течение всего процесса, и почти 100% 3D-архитектур выращива...

Раскрытие информации

Ранан Гулхан Актас владеет патентными заявками MD, S-IHC, S-IF и FS. Ольгу Энис Ток принимал участие в разработке этих продуктов. Ольгу Энис Ток и Гамзе Демирель являются членами команды R&D компании под названием Cellorama. Юсуф Мустафа Саатчи, Зейнеп Акбулут и Озгеджан Каялар не имеют никаких конфликтов интересов.

Благодарности

Мы благодарны Дейлу Мертесу из Чикагского университета за подготовку диаграмм, доктору Мехмету Серифу Айдыну за его техническую поддержку в Стамбульском научно-исследовательском институте медицинских наук и технологий Университета Медипол и доктору Ране Каземи из Университета Малтепе за редактирование рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute Ethanol (EtOH)Merck8187602500Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
AcetoneMerck8222512500Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal AntibodyBiocare MedicalCP 028 AStore at +4 °C
Anti-albumin antibodyAbcamEPR20195Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonalAbcam134435Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5Abcam53121Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal AntibodyBiocare MedicalACI 3058 A, BStore at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC1016-500GDissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Centrifuge tubes, 15 mL Nest601051
Centrifuge tubes, 50 mL Nest602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 IncubatorPanasonicKM-CC17RU2
Copper GridsElectron Microscopy SciencesG100-CuUltra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point DryerLeicaEM CPD300For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture  Sigma AldrichAEC101Store at +4 °C
Diamond knifeDiatomeUltra 45°, 40-USUse for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biologyBiofroxx67-68-5
Disposable Plastic Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Store at +4 °C
Eosin Y Solution AlcoholicBright Slide2.BS01-105-1000
Epon resin Sigma45359-1EA-FEpoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)CelloramaCellO-FStore at +4 °C
Glass knife makerLeicaEM KMR3For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% Electron Microscopy Sciences16210Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solutionSigma Aldrich56-81-5Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647InvitrogenA32933Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35502Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84540Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35552Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84541Store at +4 °C
Hematoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 cellsATCCHB-8065Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6R&D SystemsMAB2020Store at -20 °C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R&D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acidSigma11189-100GStore at RT
Lead aspartate solutionDissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrateElectron Microscopy Sciences17900Store at RT
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal MicroscopeZeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
Nuclear-DNA stainInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stainThermoFischer Scientific62248DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%Electron Microscopy Sciences19190Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibodyR&D systemsMAB2020Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% Sigma1.04005.1000Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tabletsMP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISSZeissItem no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mLNest620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachmentZeissGeminiSEM 500We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2Electron Microscopy Sciences11655Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 °C
Specimen trimming deviceLeicaEM TRIM2For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coaterLeicaEM ACE200Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GDilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2CFor glue polymerized epon block with sample to holder epon block
UltramicrotomeLeicaEM UC7For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µLNest171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µLIsolabL-002
Universal Pipette Tips, 200 µL Nest110919HA01
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

Ссылки

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены