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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente studio descrive le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la lavorazione, la colorazione, l'etichettatura e l'esame di interi sferoidi e organoidi sotto vari microscopi, mentre rimangono intatti in un idrogel all'interno di un dispositivo multiuso.

Abstract

Gli organoidi e gli sferoidi, strutture di crescita tridimensionale nei laboratori di coltura cellulare, stanno diventando sempre più riconosciuti come modelli superiori rispetto ai modelli di coltura bidimensionale, poiché imitano meglio il corpo umano e hanno vantaggi rispetto agli studi sugli animali. Tuttavia, questi studi affrontano comunemente problemi di riproducibilità e coerenza. Durante i lunghi processi sperimentali - con trasferimenti di organoidi e sferoidi tra diversi vasi di coltura cellulare, pipettaggio e centrifugazione - queste strutture di crescita 3D sensibili e fragili sono spesso danneggiate o perse. In definitiva, i risultati sono significativamente influenzati, poiché le strutture 3D non possono mantenere le stesse caratteristiche e qualità. I metodi qui descritti riducono al minimo questi passaggi stressanti e garantiscono un ambiente sicuro e coerente per organoidi e sferoidi durante tutta la sequenza di lavorazione mentre sono ancora in un idrogel in un dispositivo multiuso. I ricercatori possono crescere, congelare, scongelare, elaborare, colorare, etichettare e quindi esaminare la struttura di organoidi o sferoidi sotto vari strumenti ad alta tecnologia, dai microscopi confocali a quelli elettronici, utilizzando un unico dispositivo multiuso. Questa tecnologia migliora la riproducibilità, l'affidabilità e la validità degli studi, pur mantenendo un ambiente stabile e protettivo per le strutture in crescita 3D durante la lavorazione. Inoltre, l'eliminazione dei passaggi stressanti riduce al minimo gli errori di gestione, riduce il tempo impiegato e diminuisce il rischio di contaminazione.

Introduzione

Il futuro della ricerca e della terapia cellulare risiede nelle colture cellulari 3D 1,2,3. I modelli organoidi e sferoidi colmano il divario tra esperimenti in vitro e modelli animali creando modelli migliori che imitano lo sviluppo, la fisiologia e le malattie del corpo umano 4,5,6,7,8,9. Tuttavia, la riproducibilità e la ripetibilità di questi modelli rimangono impegnative. Inoltre, la manipolazione, la raccolta, il trasferimento e la centrifugazione di queste strutture con le tecnologie attuali provocano la perdita o il danneggiamento degli organoidi e degli sferoidi in molte condizioni, influenzando significativamente i risultati.

Nonostante molti protocolli per la colorazione istologica, la colorazione immunoistochimica, l'etichettatura con immunofluorescenza e la crioconservazione, non esiste un approccio universale relativo alla standardizzazione delle condizioni sperimentali, alla gestione e all'elaborazione di queste delicate strutture senza perderle o danneggiarle. I protocolli attuali sono anche incredibilmente lunghi, alternati da pochi giorni a diverse settimane, e includono procedure complesse con vari reagenti 10,11,12,13,14. Inoltre, la raccolta, il pipettaggio, la centrifugazione e il trasferimento di strutture di crescita 3D tra vasi di coltura cellulare e crioviali causano cambiamenti nel posizionamento delle strutture e delle forze meccaniche e, in ultima analisi, influenzano la differenziazione e la maturazione degli organoidi e degli sferoidi. È stato riportato che la topologia tissutale, il posizionamento delle cellule e le forze meccaniche influenzano significativamente la differenziazione e la maturazione cellulare 6,15,16,17.

Pertanto, è auspicabile migliorare le attuali tecnologie convenzionali per generare organoidi e sferoidi con qualità stabile. Un metodo/dispositivo che salterà la centrifugazione e le altre fasi sopra descritte e fornirà il materiale in un unico ambiente sicuro dall'inizio alla fine dei molteplici processi sarebbe utile per raggiungere i dati più coerenti e affidabili. Inoltre, ciò ridurrà i vincoli di tempo, manodopera e costi.

Il dispositivo multiuso (MD) qui descritto fornisce un unico ambiente sicuro per più processi di organoidi e sferoidi (Figura supplementare 1). Questo dispositivo e i protocolli complementari eliminano le fasi di raccolta, pipettaggio, trasferimento e centrifugazione. Gli organoidi e gli sferoidi rimangono nel loro ambiente in vitro durante i processi sequenziali. Questo ambiente comprende principalmente componenti della matrice extracellulare naturale o sintetica, come gli idrogel disponibili in commercio. In altre parole, i metodi qui descritti consentono di elaborare, esaminare e congelare un campione intero di organoidi / sferoidi mentre è ancora in una goccia di idrogel.

Il dispositivo biocompatibile è resistente a temperature comprese tra 60 °C e -160 °C, il che rende possibile ripristinare gli organoidi/steroidi in un serbatoio di azoto liquido a -160 °C o preparare blocchi di resina per microscopia elettronica a 60 °C. La nicchia nel dispositivo è stata progettata per definire uno spazio limitato per le strutture di crescita 3D e stimolare la formazione di sferoidi o organoidi sulla base degli studi precedenti 18,19,20,21,22,23. Quella parte del dispositivo è trasparente e contiene una plastica specifica che fornisce un'elevata qualità ottica (indice di rifrazione: 1,43; valore di abbe: 58; spessore: 7,8 mil [0,0078 in o 198 μm]). Sia la nicchia che la parte "laterale" circostante causano l'autofluorescenza. La nicchia trasparente al centro ha un'area di 80 mm 2, mentre la parte laterale è di 600 mm2. La profondità del contenitore è di 15 mm e lo spessore è di 1,5 mm. Queste caratteristiche, oltre alle dimensioni e al design del dispositivo, consentono di effettuare osservazioni con diversi tipi di microscopio ad alta tecnologia e preparare i campioni per gli esami al microscopio elettronico (Figura 2). Il sistema di chiusura del dispositivo prevede due posizioni, una sigillata nel congelatore e l'altra che consente il flusso di gas nell'incubatore. I saggi di proliferazione e citotossicità di CCK8 dimostrano effetti simili sulle cellule rispetto ai tradizionali piatti di coltura cellulare (Figura supplementare 2). Il test di esclusione del blu di Trypan dimostra un'elevata vitalità cellulare (94%) durante la coltura cellulare nel MD (Figura 3).

I processi che possono essere eseguiti per un campione nel singolo dispositivo comprendono (1) coltura, (2) colorazione istologica, (3) immunocolorazione, compresa la marcatura immunoistochimica e immunofluorescenza, (4) congelamento, (5) scongelamento, (6) esame al microscopio ottico, come microscopi a campo chiaro, campo scuro, fluorescenza, confocale e super-risoluzione, (7) rivestimento ed esame direttamente al microscopio elettronico a scansione o (8) preparazione per la microscopia elettronica a trasmissione ( Figura 2).

Esistono diverse metodologie per la colorazione istologica, la marcatura immunoistochimica o la marcatura fluorescente di organoidi e sferoidi 10,11,12,13,14,24,25. La loro raccolta dall'idrogel è il primo e principale passo della tecnologia attuale. Dopo questo passaggio, alcuni metodi consentono l'immuno-marcatura a montaggio intero. Gli organoidi raccolti sono incorporati in paraffina, sezionati ed etichettati per la colorazione e l'immunocolorazione in altri. Tuttavia, le sezioni potrebbero non presentare l'intero campione e fornire solo dati limitati relativi all'architettura 3D della struttura. Inoltre, il danneggiamento di queste strutture 3D e la perdita di antigenicità sono effetti collaterali ben noti di queste tecnologie.

I nuovi protocolli complementari per gli esami microscopici in questo articolo consentono un'analisi di campioni interi ancora in un idrogel. I protocolli qui descritti includono due formulazioni di nuova concezione: soluzione per immunoistochimica (S-IHC) e soluzione per l'etichettatura immunofluorescenza (S-IF). I metodi con queste soluzioni consentono ai ricercatori di ottenere dati più accurati, poiché non ci sono effetti dannosi dei flussi di lavoro tradizionali, come centrifugazione, pipettaggio e trasferimento delle strutture delicate. Il protocollo qui descritto elimina anche la necessità di fasi di raccolta, blocco, pulizia e recupero dell'antigene e riduce l'intera procedura a 6-8 ore. Inoltre, la metodologia consente di aggiungere simultaneamente da uno a tre anticorpi allo stesso S-IF. Pertanto, è possibile ottenere i risultati nello stesso giorno anche dopo gli esperimenti di etichettatura multipla, che è un altro vantaggio del protocollo qui descritto; I tradizionali protocolli di etichettatura con immunofluorescenza a montaggio intero richiedono in genere da 3 giorni a diverse settimane 10,11,12,13,14.

Anche l'incorporazione di paraffina, un altro passaggio dannoso che riduce l'antigenicità, viene omesso. La struttura 3D rimane nel suo ambiente in vitro dall'inizio alla fine dell'esame microscopico. Poiché la struttura 3D rimane nelle sue condizioni di crescita, l'espressione proteica e i dati di localizzazione imitano meglio le condizioni in vivo . Sono attesi risultati più accurati, poiché la metodologia elimina i passaggi che influenzano l'espressione dell'antigene del campione. Le Tabelle 1 e 2 dimostrano come questi nuovi protocolli eliminino i passaggi, risparmino tempo e manodopera in laboratorio e riducano i costi e i prodotti di scarto rispetto ai flussi di lavoro tradizionali.

Oltre ai passaggi cruciali sopra descritti, un altro problema è fornire un mezzo di crioconservazione e un metodo per preservare la struttura 3D del campione con tassi di vitalità cellulare più elevati 26,27,28,29,30,31. La crioconservazione è essenziale per creare un sistema modello stabile e consentire la biobanca di organoidi e sferoidi32,33. Il biobanking dell'intera struttura 3D originale consentirà una ricapitolazione più fedele dello stato naturale di salute o malattia. Le considerazioni chiave sono la convenienza e l'affidabilità della crioconservazione e lo scongelamento di organoidi/sferoidi. Il recupero degli organoidi post-disgelo è molto basso nella maggior parte delle tecnologie attuali, spesso inferiore al 50%. Tuttavia, studi recenti hanno mostrato risultati promettenti con tassi di sopravvivenza migliorati26,27,28,29. Lee et al. hanno dimostrato che il 78% delle cellule sferoidi è sopravvissuto dopo la crioconservazione quando hanno usato la soluzione dell'Università del Wisconsin contenente il 15% di DMSO28. Il rapporto di sopravvivenza cellulare è aumentato all'83% nello studio di Arai et al.29. Tuttavia, i risultati dopo la crioconservazione sono significativamente influenzati poiché le strutture 3D non possono mantenere le stesse caratteristiche e qualità. Inoltre, sono necessari reagenti privi di siero per le buone pratiche di fabbricazione in ambito farmaceutico e diagnostico. I flussi di lavoro tradizionali utilizzano un terreno contenente siero bovino fetale (FBS) e dimetilsolfossido (DMSO) per il metodo di congelamento lento, entrambi associati a svantaggi. FBS è un prodotto di derivazione animale e può avere variazioni di lotto. Il DMSO è un crioprotettore di grande successo, ma l'esposizione a lungo termine, specialmente durante lo scongelamento, potrebbe causare effetti citotossici30,31.

Questo articolo descrive anche la metodologia di congelamento / scongelamento di interi organoidi o sferoidi mentre sono ancora in un idrogel. Nello studio vengono utilizzate due formule per il congelamento di organoidi e sferoidi: (1) 10% di DMSO contenente una soluzione di congelamento tradizionale (FS) e (2) un mezzo di crioconservazione privo di siero e DMSO. Questo mezzo di crioconservazione contiene componenti della matrice extracellulare, che sono diversi dalle formule attuali. La matrice extracellulare comprende due classi principali di macromolecole, proteoglicani e proteine fibrose, che sono essenziali per l'impalcatura fisica dei costituenti cellulari, ma avviano anche i processi necessari per la morfogenesi dei tessuti, la differenziazione e l'omeostasi 34,35,36,37,38,39,40 . I collageni forniscono resistenza alla trazione, regolano l'adesione cellulare, supportano la chemiotassi e la migrazione e dirigono lo sviluppo dei tessuti37. Inoltre, le fibre di elastina forniscono rinculo ai tessuti che subiscono ripetuti allungamenti38. Una terza proteina fibrosa, la fibronectina, dirige l'organizzazione della matrice extracellulare interstiziale e ha un ruolo cruciale nel mediare l'attaccamento cellulare e funziona come meccano-regolatore extracellulare39. Du et al. hanno dimostrato l'effetto crioprotettivo dell'idrolizzato di collagene di pollo sul sistema modello naturale di actomiosina41. I loro risultati suggeriscono che l'idrolizzato di collagene può inibire la crescita dei cristalli di ghiaccio, ridurre la denaturazione e l'ossidazione delle proteine in modo simile ai crioprotettori commerciali e fornire una migliore struttura del gel dopo i cicli di congelamento-scongelamento. Pertanto, l'aggiunta di componenti della matrice extracellulare ai mezzi di crioconservazione fornisce un ambiente più sicuro e protettivo per il campione e supporta le strutture viventi per guarire dopo il congelamento-scongelamento.

Inoltre, il presente studio descrive un protocollo semplice per etichettare le membrane citoplasmatiche e i nuclei di organoidi e sferoidi vivi mentre sono ancora nell'idrogel.

Protocollo

1. Coltura di organoidi e sferoidi

  1. Mettere l'idrogel sul ghiaccio durante la notte (in frigorifero o in una cella frigorifera) per scongelare.
  2. Posizionare il dispositivo multiuso disponibile in commercio (MD; vedi Tabella dei materiali) nell'incubatore 1 giorno prima dell'esperimento (37 °C, 5% CO2) per riscaldare.
  3. Introdurre le punte sterili delle pipette a punta larga in frigorifero a 4 °C.
    NOTA: i passaggi 1.1-1.3 devono essere eseguiti il giorno 0 e i passaggi 1.4-1.11 devono essere eseguiti il giorno 1.
  4. Posizionare l'idrogel sul ghiaccio in una cappa a flusso laminare per 15 minuti.
    1. Facoltativo: Diluire l'idrogel in mezzo di coltura cellulare freddo secondo le raccomandazioni del produttore.
  5. Posizionare il tubo contenente un pellet di cellule HepG2 (linea cellulare di carcinoma epatocellulare ottenuta commercialmente; vedere Tabella dei materiali) su ghiaccio.
  6. Piastra 30-35 μL di idrogel al 100% all'interno della nicchia del dispositivo preriscaldato per creare una goccia di gel.
  7. Posizionare 10.000 cellule HepG2 al centro della parte superiore di ogni goccia di idrogel (Figura 2) e incubare per 15 minuti a 37 °C.
  8. Coprire la goccia di idrogel con 200 μL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con siero bovino fetale al 10%.
  9. Coprire il coperchio del MD nella posizione corretta per consentire il flusso di gas e posizionare il dispositivo nell'incubatore.
  10. Nutrire le cellule con 200 μL di DMEM con il 10% di FBS a giorni alterni.
  11. Controllare la crescita degli sferoidi al microscopio invertito (Figura 3). La formazione sferoidale inizia dopo il 3° giorno. Il video 1 mostra la posizione degli sferoidi a diversi livelli in una cupola di idrogel.
    NOTE: Si consiglia vivamente di aspirare delicatamente il liquido che circonda l'idrogel e aggiungere lentamente il nuovo liquido all'ambiente per evitare di danneggiare le gocce di idrogel.

2. Colorazione con ematossilina ed Eosina di organoidi/sferoidi a montaggio intero in un idrogel

  1. Riscaldare il fissativo (4% paraformaldeide; PFA), PBS ed Ematossilina (vedi Tabella dei materiali) a 37 °C.
  2. Aspirare il mezzo che circonda la goccia di idrogel con una pipetta, aggiungere 100-200 μL di PFA al 4% per fissare e incubare per 15-20 minuti a 37 °C.
  3. Aspirare il 4% di PFA e aggiungere 200 μL di PBS per lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno a 37 °C. Quindi, aspirare il PBS e incubare con 200 μL di soluzione di ematossilina per 15-20 minuti a 37 °C.
  4. Aspirare l'ematossilina e aggiungere 200 μL di dH2O per lavare 3 volte per 10 minuti ciascuno a 37 °C. Aspirare il dH2O e incubare con 200 μL di etanolo per 5-10 minuti a 37 °C.
  5. Aspirare l'etanolo e incubare con 200 μL di Eosina (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C. Aspirare l'Eosina e aggiungere 200 μL di dH2O per lavare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  6. Aspirare il dH2O e aggiungere 100 μL di glicerolo per coprire la goccia di idrogel come mezzo di montaggio.
  7. Opzionale: Montare la nicchia con una copertina. Questo passaggio può essere omesso per evitare di spremere organoidi/sferoidi di dimensioni considerevoli.
  8. Chiudere saldamente il coperchio di MD per evitare l'asciugatura fino all'esame. Il campione è stabile per l'esame per almeno 6 mesi.

3. Immunoistochimica di organoidi/sferoidi a montaggio intero in un idrogel

  1. Riscaldare a 37 °C la soluzione per immunoistochimica ottenuta commercialmente (S-IHC; vedere Tabella dei materiali).
  2. Incubare gli organoidi o sferoidi nell'idrogel con perossido di idrogeno al 3% (H 2 O 2) in 200 μL di dH2Oper 5 minuti a 37 °C.
  3. Aspirare la soluzione di perossido di idrogeno e lavare in dH2O per 5 minuti a 37 °C. Aspirare il dH2O e incubare due volte con 100 μL di S-IHC a 37 °C per 10 minuti ciascuno.
  4. Aspirare l'S-IHC e incubare con 100 μL di anticorpo primario (vedere Tabella dei materiali) diluito in S-IHC per 1-2 ore a 37 °C (seguendo le raccomandazioni del produttore relative alla diluizione di lavoro).
  5. Aspirare la soluzione anticorpale primaria e incubare con 100 μL di S-IHC 3x per 5 minuti ciascuno a 37 °C.
  6. Aspirare 100 μL di S-IHC e incubare con un anticorpo secondario biotinilato (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C.
  7. Aspirare la soluzione anticorpale secondaria e incubare con 100 μL di S-IHC 3x per 5 minuti ciascuno a 37 °C. Aspirare l'S-IHC e incubare con 100 μL di streptavidina marcata con perossidasi di rafano (HRP) (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C.
  8. Aspirare la streptavidina marcata HRP e incubare con 100 μL di S-IHC 3x per 5 minuti ciascuno a 37 °C.
  9. Aspirare l'S-IHC e incubare con 100 μL di miscela di soluzione cromogeno DAB/AEC (vedere Tabella dei materiali) per 5-10 minuti a 37 °C.
  10. Monitorare l'intensità della colorazione al microscopio ottico.
  11. Lavare con dH 2 O 3x per2minuti ciascuno.
  12. Facoltativo: Incubare con 100 μL di ematossilina (vedere Tabella dei materiali) per controcolorazione nucleare per 5 minuti a 37 °C.
  13. Aspirare l'ematossilina e lavare in dH2O per 5 min.
  14. Aspirare il dH2O e coprire la goccia di idrogel con 100 μL di glicerolo come mezzo di montaggio.
  15. Chiudere saldamente il coperchio del MD fino all'esame microscopico.
    NOTE: Il recupero dell'antigene e le fasi di blocco delle proteine sono omesse in questo protocollo poiché S-IHC elimina queste fasi.

4. Marcatura a immunofluorescenza di organoidi/sferoidi a montaggio intero in un idrogel

  1. Riscaldare i seguenti materiali a 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, soluzione anticorpale primaria in S-IF, soluzione anticorpale secondaria in S-IF, colorante nucleare e glicerolo (vedere Tabella dei materiali).
  2. Aspirare il terreno di coltura cellulare e fissare con 200 μL di PFA al 4% per 15-30 minuti a 37 °C. Aspirare il fissativo e lavare in S-IF 3x per 10 minuti ciascuno a 37 °C.
  3. Aggiungi dH2O sul lato che circonda la nicchia per fornire umidità durante i passaggi successivi.
  4. Aspirare l'S-IF che circonda la goccia di idrogel e incubare la goccia di idrogel con 100 μL di soluzione anticorpale primaria (vedere Tabella dei materiali) in S-IF per 30-60 minuti a 37 °C.
  5. Aspirare la soluzione anticorpale primaria e lavare in S-IF 3 volte per 10 minuti ciascuno a 37 °C.
  6. Aspirare l'S-IF e incubare con 100 μL di soluzione anticorpale secondaria (vedere Tabella dei materiali) in S-IF per 30-60 minuti a 37 °C al buio.
  7. Aspirare la soluzione anticorpale secondaria e lavare con PBS 3x per 10 minuti ciascuno a 37 °C al buio.
  8. Aspirare il PBS e incubare con 100 μL di colorazione di DNA nucleare contenente mezzo di montaggio o glicerolo a 37 °C al buio.
  9. Riempire la nicchia con glicerolo per evitare l'essiccazione.
  10. Opzionale: coprire la nicchia con un coprivetrino. Questo passaggio può essere omesso per evitare di spremere gli organoidi / sferoidi.
  11. Chiudere ermeticamente il MD. I campioni in MD possono essere conservati a 4 °C al buio per almeno 6 mesi con una minima perdita di fluorescenza.
  12. Utilizzare le seguenti impostazioni per l'esame microscopico confocale: impostare il valore stenopeico di tutti i canali su 20,1, mantenere la costante master di guadagno a 550 per 488 nm, 485 per 550 nm e 450 per 594 nm, mantenere costante la potenza del laser per tutti gli esperimenti e la percentuale più bassa a 2,0.
    NOTE: Anticorpi primari: Anti-Na-K ATPasi (1:100), Anti-Arginasi (1:50), Anti-Albumina (1:50), Anti-Beta-galattosidasi (1:25), Anticorpo Antimitocondriale (1:100), Anticorpo Anti-Golgi (1:50), Anti-Citocheratina 5 (1:100), Anticorpo Ov6 (1:100). Anticorpi secondari: Goat anti-Rabbit IgG (H+L)- 488, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-550, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-488, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-550, Goat anti-Chicken IgY(H+L)-647. La diluizione per tutti gli anticorpi secondari è 1:100. Inoltre, viene utilizzato anche FITC-Phalloidin (1:100), un anticorpo coniugato (vedi Tabella dei materiali).

5. Marcatura della membrana plasmatica e del nucleo di organoidi e sferoidi viventi in un idrogel

  1. Preparare la soluzione di etichettatura contenente agglutinina di germe di grano fluorurato Alexa (5,0 μg/ml) e Hoechst (2 μM) nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), secondo le raccomandazioni del produttore (vedere la tabella dei materiali), e riscaldare fino a 37 °C.
  2. Aspirare il terreno di coltura cellulare e aggiungere 100 μL di soluzione di etichettatura per coprire la goccia di idrogel. Incubare per 15-30 minuti a 37 °C.
  3. Rimuovere la soluzione di etichettatura e lavare due volte in PBS 2x per 10 minuti ciascuno a 37 °C. Opzionale: Fissare con 200 μL di formaldeide al 4% per 15 minuti a 37 °C.
  4. Coprire la goccia di idrogel con glicerolo come mezzo di montaggio. Opzionale: Montare la nicchia con un vetro di copertura.
  5. Chiudere saldamente il coperchio del MD e tenerlo in frigorifero al buio fino all'esame microscopico confocale/a fluorescenza. È stabile per almeno 6 mesi.

6. Congelamento e scongelamento di organoidi/sferoidi interi in idrogel

  1. Congelare gli organoidi seguendo i passaggi seguenti.
    1. Riscaldare la soluzione di congelamento ottenuta commercialmente (FS; vedi tabella dei materiali) a 37 °C.
    2. Aspirare delicatamente il terreno di coltura cellulare che circonda la cupola di idrogel.
    3. Aggiungere delicatamente 200 μL di FS. Incubare il campione con FS a 37 °C per 1 ora.
    4. Chiudere saldamente il coperchio del dispositivo e inserirlo in una scatola di schiuma. Collocare questa scatola di schiuma in un'altra scatola di schiuma, come mostrato nella Figura supplementare 3. Chiudere ermeticamente entrambe le scatole di schiuma. Due scatole di schiuma l'una all'interno dell'altra forniscono un intervallo di gradiente di raffreddamento della temperatura da 1 a 2 ° C / min del campione in un congelatore a -20 ° C.
    5. Posizionare la scatola a -20 °C per 2 ore. Trasferire la scatola in un congelatore a -80 °C e lasciarla per una notte.
    6. Estrarre il campione dalle scatole. Il campione nel MD può essere conservato nel congelatore a -80 °C per 6 mesi.
    7. Trasferire il MD che contiene il campione nel serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  2. Scongelare gli organoidi seguendo i passaggi seguenti.
    1. Estrarre il DM contenente il campione dal congelatore/serbatoio di azoto e porlo direttamente in un incubatore a 37 °C. Incubare per 1 h a 37 °C.
    2. Aggiungere 200 μL di terreno di coltura caldo alla nicchia (il rapporto tra FS e terreno di coltura cellulare è 1:1) e incubare per 30 minuti a 37 °C.
    3. Aggiungere altro terreno di coltura caldo alla nicchia (il rapporto tra FS e terreno di coltura cellulare è 1:2) e incubare per 30 minuti a 37 °C.
    4. Aspirare delicatamente la miscela media e FS. Procedere alla microscopia elettronica a scansione (fase 7) e alla microscopia elettronica a trasmissione (fase 8) dell'imaging degli organoidi/sferoidi a montaggio intero nell'idrogel.

7. Microscopia elettronica a scansione di organoidi/sferoidi a montaggio intero

  1. Riscaldare la soluzione fissativa e post-fissativa di Karnovsky (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente (RT).
  2. Aspirare il mezzo di coltura cellulare che circonda l'idrogel nel MD. Posizionare il campione nel MD su ghiaccio nella cappa a flusso laminare per 15 minuti.
  3. Aspirare l'idrogel liquefatto che circonda gli organoidi/sferoidi molto delicatamente. Una quantità limitata di matrigel può rimanere nella nicchia per evitare di danneggiare e perdere il campione.
  4. Fissare con il fissativo di Karnovsky (2% PFA, 2,5% glutaraldeide in 0,15 M Cacodylate buffer e 2 mM CaCl2; vedi Tabella dei materiali) a RT per 1 ora.
  5. Aspirare delicatamente il fissativo e lavare con acqua distillata (dH2O) 3 volte per 15 minuti ciascuno.
  6. Aspirare delicatamente il dH2O e fissare con soluzione post-fissativa (tetrossido di osmio acquoso all'1% [OsO4]; vedi Tabella dei materiali) a RT per 1 ora.
  7. Aspirare delicatamente il post-fissativo e lavare con acqua distillata (dH2O) 3 volte per 15 minuti ciascuno.
  8. Disidratare in una serie graduata di etanolo (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), miscela di etanolo / acetone (1: 1; 1: 2) e acetone assoluto a RT per 15 minuti ciascuno.
  9. Asciugare con un essiccatore a punti critici.
  10. Rivestire il campione nel dispositivo con oro/palladio a 6 nm utilizzando un rivestimento sputter (vedi Tabella dei materiali) per 90 s.
  11. Osservare al microscopio elettronico a scansione con un rilevatore elettronico secondario a 2-3 kV in modalità vuoto (5 x 10-6 mA). Scatta immagini con una distanza di lavoro di 8,1-8,2 mm e con ingrandimenti 675x, 1050x e 1570x.
    NOTE: Tutti i passaggi vengono eseguiti nel MD. Utilizzare 200-250 μL di soluzione per ogni passaggio.

8. Microscopia elettronica a trasmissione di organoidi/sferoidi a montaggio intero in idrogel

  1. Riscaldare il fissativo di Karnovsky a 37 °C. Aspirare il mezzo di coltura cellulare che circonda l'idrogel nel MD.
  2. Fissare il campione con il fissativo di Karnovsky a RT per 1 ora. Lavare con dH2O 3x per 15 minuti ciascuno.
  3. Post-fix con OsO4 acquoso al 2% e ferrocianuro di potassio al 2,5% a RT per 45 min. Lavare con dH2O 3x per 10 minuti ciascuno.
  4. Incubare in tiocarboidrazide allo 0,5% (TCH; vedi tabella dei materiali) a RT per 30 minuti. Lavare con dH2O 3x per 10 minuti ciascuno.
  5. Incubare inOsO 4 acquoso al 2% a RT per 30 min. Lavare con dH2O 3x per 10 minuti ciascuno.
  6. Incubare in soluzione di acetato di uranile al 2% (vedi tabella dei materiali) a RT per 1 ora.
    NOTA: In questa fase, gli sferoidi possono essere mantenuti a 4 °C durante la notte.
  7. Incubare in soluzione di aspartato di piombo (vedi tabella dei materiali) a 60 °C per 45 min. Lavare con dH2O 3x per 10 minuti ciascuno.
  8. Disidratare in una serie graduata di etanolo (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) e acetone assoluto a RT per 15 minuti ciascuno.
  9. Trattare con una miscela di (1:1; 1:2) acetone/resina Epon e resina Epon pura (vedi Tabella dei materiali) a RT per 2 ore ciascuno.
  10. Polimerizzare la resina a 60 °C durante la notte (minimo 16 h). Dopo la polimerizzazione, rimuovere il blocco di resina dal MD, come mostrato nella Figura supplementare 4.
  11. Attaccare il blocco di resina a uno più grande con una colla di resina. Tagliare il blocco e raggiungere la posizione di organoidi o sferoidi.
  12. Ottieni sezioni semisottili (1.000 nm) e ultrasottili (60 nm) usando un ultramicrotomo (vedi Tabella dei materiali).
  13. Posizionare le sezioni ultrasottili su griglie di rame a 100 maglie e osservare al microscopio elettronico a scansione con un rivelatore STEM ad una tensione accelerata di 30 kV. Cattura immagini con una distanza di lavoro di 44 mm e con ingrandimenti 2580x, 5020x e 6060x.
    NOTE: Utilizzare 200-250 μL di soluzione per ogni passaggio. I passaggi 8.1-8.10 vengono eseguiti nel MD.

Risultati

Il presente articolo rappresenta un dispositivo multiuso (MD) e integra le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la colorazione istologica, la colorazione immunoistochimica, l'etichettatura con immunofluorescenza, il rivestimento e la lavorazione di interi organoidi o sferoidi mentre sono ancora in un idrogel in un unico ambiente dal design univoco. L'attuale studio è stato progettato per preparare sferoidi per il cancro del fegato HepG2 in 35 gocce di idrogel in 35 MD. Gli esperimenti sono...

Discussione

L'MD, integrando le formulazioni e i protocolli qui descritti, facilita la crescita 3D rapida e spontanea di organoidi e sferoidi in un ambiente più controllato e continua l'esperimento nelle stesse condizioni. Il campione rimane nello stesso ambiente durante l'intero processo e quasi il 100% delle architetture di crescita 3D rimangono intatte nel contenitore. Ciò migliora l'omogeneità durante gli esperimenti sequenziali e consente un periodo di coltura prolungato. Inoltre, il numero di passaggi durante la lavorazione...

Divulgazioni

Ranan Gulhan Aktas possiede domande di brevetto MD, S-IHC, S-IF e FS. Olgu Enis Tok è stata coinvolta nello sviluppo di questi prodotti. Olgu Enis Tok e Gamze Demirel sono membri del team di ricerca e sviluppo della società denominata Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut e Ozgecan Kayalar non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Riconoscimenti

Siamo grati a Dale Mertes dell'Università di Chicago per la preparazione dei diagrammi, al Dr. Mehmet Serif Aydin per il suo supporto tecnico presso l'Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, e al Dr. Rana Kazemi della Maltepe University per la redazione del manoscritto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute Ethanol (EtOH)Merck8187602500Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
AcetoneMerck8222512500Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal AntibodyBiocare MedicalCP 028 AStore at +4 °C
Anti-albumin antibodyAbcamEPR20195Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonalAbcam134435Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5Abcam53121Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal AntibodyBiocare MedicalACI 3058 A, BStore at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC1016-500GDissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Centrifuge tubes, 15 mL Nest601051
Centrifuge tubes, 50 mL Nest602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 IncubatorPanasonicKM-CC17RU2
Copper GridsElectron Microscopy SciencesG100-CuUltra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point DryerLeicaEM CPD300For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture  Sigma AldrichAEC101Store at +4 °C
Diamond knifeDiatomeUltra 45°, 40-USUse for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biologyBiofroxx67-68-5
Disposable Plastic Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Store at +4 °C
Eosin Y Solution AlcoholicBright Slide2.BS01-105-1000
Epon resin Sigma45359-1EA-FEpoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)CelloramaCellO-FStore at +4 °C
Glass knife makerLeicaEM KMR3For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% Electron Microscopy Sciences16210Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solutionSigma Aldrich56-81-5Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647InvitrogenA32933Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35502Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84540Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35552Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84541Store at +4 °C
Hematoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 cellsATCCHB-8065Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6R&D SystemsMAB2020Store at -20 °C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R&D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acidSigma11189-100GStore at RT
Lead aspartate solutionDissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrateElectron Microscopy Sciences17900Store at RT
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal MicroscopeZeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
Nuclear-DNA stainInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stainThermoFischer Scientific62248DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%Electron Microscopy Sciences19190Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibodyR&D systemsMAB2020Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% Sigma1.04005.1000Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tabletsMP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISSZeissItem no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mLNest620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachmentZeissGeminiSEM 500We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2Electron Microscopy Sciences11655Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 °C
Specimen trimming deviceLeicaEM TRIM2For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coaterLeicaEM ACE200Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GDilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2CFor glue polymerized epon block with sample to holder epon block
UltramicrotomeLeicaEM UC7For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µLNest171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µLIsolabL-002
Universal Pipette Tips, 200 µL Nest110919HA01
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

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