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Resumo

O presente estudo descreve metodologias para cultivo, congelamento, descongelamento, processamento, coloração, marcação e exame de esferoides e organoides inteiros sob vários microscópios, enquanto permanecem intactos em um hidrogel dentro de um dispositivo multiuso.

Resumo

Organoides e esferoides, estruturas de crescimento tridimensionais em laboratórios de cultura de células, estão se tornando cada vez mais reconhecidos como modelos superiores em comparação com modelos de cultura bidimensionais, uma vez que imitam melhor o corpo humano e têm vantagens sobre os estudos em animais. No entanto, esses estudos comumente enfrentam problemas com reprodutibilidade e consistência. Durante os longos processos experimentais - com transferências de organoides e esferoides entre diferentes vasos de cultura celular, pipetagem e centrifugação - essas estruturas de crescimento 3D suscetíveis e frágeis são frequentemente danificadas ou perdidas. Em última análise, os resultados são significativamente afetados, uma vez que as estruturas 3D não podem manter as mesmas características e qualidade. Os métodos descritos aqui minimizam essas etapas estressantes e garantem um ambiente seguro e consistente para organoides e esferoides durante toda a sequência de processamento, enquanto eles ainda estão em um hidrogel em um dispositivo multiuso. Os pesquisadores podem crescer, congelar, descongelar, processar, manchar, rotular e, em seguida, examinar a estrutura de organoides ou esferoides sob vários instrumentos de alta tecnologia, de microscópios confocais a eletrônicos, usando um único dispositivo multiuso. Essa tecnologia melhora a reprodutibilidade, a confiabilidade e a validade dos estudos, mantendo um ambiente estável e protetor para as estruturas de crescimento 3D durante o processamento. Além disso, a eliminação de etapas estressantes minimiza os erros de manuseio, reduz o tempo gasto e diminui o risco de contaminação.

Introdução

O futuro da pesquisa e terapia celular está nas culturas de células 3D 1,2,3. Os modelos organoides e esferoides fecham a lacuna entre os experimentos in vitro e os modelos animais, criando melhores modelos que imitam o desenvolvimento, a fisiologia e as doenças do corpo humano 4,5,6,7,8,9. No entanto, a reprodutibilidade e repetibilidade desses modelos permanecem desafiadoras. Além disso, o manuseio, a colheita, a transferência e a centrifugação dessas estruturas com as tecnologias atuais resultam em perda ou dano dos organoides e esferoides em muitas condições, afetando significativamente os resultados.

Apesar de muitos protocolos de coloração histológica, coloração imuno-histoquímica, marcação por imunofluorescência e criopreservação, não existe uma abordagem universal relacionada à padronização de condições experimentais, manuseio e processamento dessas estruturas delicadas sem perdê-las ou danificá-las. Os protocolos atuais também são incrivelmente longos, alternando de alguns dias a várias semanas, e incluem procedimentos complexos com vários reagentes 10,11,12,13,14. Além disso, a colheita, pipetagem, centrifugação e transferência de estruturas de crescimento 3D entre vasos de cultura celular e criovianos causam mudanças no posicionamento das estruturas e forças mecânicas e, finalmente, afetam a diferenciação e maturação dos organoides e esferoides. Tem sido relatado que a topologia tecidual, o posicionamento das células e as forças mecânicas impactam significativamente a diferenciação e maturação celular 6,15,16,17.

Portanto, é desejável melhorar as tecnologias convencionais atuais para gerar organoides e esferoides com qualidade estável. Um método/dispositivo que pule a centrifugação e outras etapas descritas acima e forneça o material em um único ambiente seguro do início ao fim dos múltiplos processos seria benéfico para alcançar os dados mais consistentes e confiáveis. Além disso, isso reduzirá as restrições de tempo, mão de obra e custo.

O dispositivo multiuso (MD) descrito aqui fornece um único ambiente seguro para múltiplos processos de organoides e esferoides (Figura 1 Suplementar). Este dispositivo e protocolos complementares eliminam as etapas de colheita, pipetagem, transferência e centrifugação. Os organoides e esferoides permanecem em seu ambiente in vitro durante os processos sequenciais. Este ambiente compreende principalmente componentes de matriz extracelular naturais ou sintéticas, como hidrogéis comercialmente disponíveis. Em outras palavras, os métodos descritos aqui permitem que uma amostra inteira de organoides / esferoides seja processada, examinada e congelada enquanto ainda está em uma gota de hidrogel.

O dispositivo biocompatível é resistente a temperaturas entre 60 °C e -160 °C, o que torna viável restaurar os organoides/esteroides em um tanque de nitrogênio líquido a -160 °C ou preparar blocos de resina para microscopia eletrônica a 60 °C. O nicho no dispositivo foi projetado para definir um espaço limitado para estruturas de crescimento 3D e estimular a formação de esferoides ou organoides com base nos estudos anteriores 18,19,20,21,22,23. Essa parte do dispositivo é transparente e contém um plástico específico que fornece alta qualidade óptica (índice de refração: 1,43; valor de abbe: 58; espessura: 7,8 mil [0,0078 in ou 198 μm]). Tanto o nicho quanto a parte "lateral" circundante causam autofluorescência. O nicho transparente no centro tem uma área de 80 mm 2, enquanto a parte lateral é de 600 mm2. A profundidade do recipiente é de 15 mm e a espessura é de 1,5 mm. Essas características, além do tamanho e do design do dispositivo, possibilitam a realização de observações sob diferentes tipos de microscópio de alta tecnologia e o preparo das amostras para exames microscópicos eletrônicos (Figura 2). O sistema de fechamento do dispositivo fornece duas posições, uma selada no freezer e outra permitindo o fluxo de gás na incubadora. Os ensaios de proliferação e citotoxicidade da CCK8 demonstram efeitos semelhantes nas células em comparação com os pratos tradicionais de cultura celular (Figura 2 Suplementar). O teste de exclusão do azul de tripano demonstra alta viabilidade celular (94%) durante a cultura celular no DM (Figura 3).

Os processos que podem ser realizados para uma amostra no único dispositivo compreendem (1) cultura, (2) coloração histológica, (3) imunocoloração, incluindo marcação imuno-histoquímica e de imunofluorescência, (4) congelamento, (5) descongelamento, (6) exame sob microscópios ópticos, como microscópios ópticos, como microscópios de campo claro, campo escuro, fluorescência, confocal e super-resolução, (7) revestimento e exame diretamente sob um microscópio eletrônico de varredura, ou (8) preparação para microscopia eletrônica de transmissão ( Figura 2).

Existem diferentes metodologias para coloração histológica, marcação imuno-histoquímica ou marcação fluorescente de organoides e esferoides 10,11,12,13,14,24,25. Colhê-los do hidrogel é o primeiro e principal passo da tecnologia atual. Após esta etapa, alguns métodos permitem a imunomarcação de montagem completa. Os organoides colhidos são incorporados em parafina, seccionados e rotulados para coloração e imunocoloração em outros. No entanto, as seções podem não apresentar toda a amostra e fornecer apenas dados limitados relacionados à arquitetura 3D da estrutura. Além disso, danos a essas estruturas 3D e perda de antigenicidade são efeitos colaterais bem conhecidos dessas tecnologias.

Os novos protocolos complementares para exames microscópicos neste artigo permitem uma análise de amostras inteiras ainda em hidrogel. Os protocolos aqui descritos incluem duas formulações recém-desenvolvidas: solução para imuno-histoquímica (S-IHC) e solução para marcação por imunofluorescência (S-IF). Os métodos com essas soluções permitem que os pesquisadores obtenham dados mais precisos, uma vez que não há efeitos nocivos dos fluxos de trabalho tradicionais, como centrifugação, pipetagem e transferência das estruturas delicadas. O protocolo descrito aqui também elimina a necessidade de etapas de colheita, bloqueio, limpeza e recuperação de antígenos, e encurta todo o procedimento para 6-8 h. Além disso, a metodologia permite adicionar simultaneamente de um a três anticorpos ao mesmo S-IF. Portanto, é possível obter os resultados no mesmo dia mesmo após os múltiplos experimentos de rotulagem, o que é outra vantagem do protocolo descrito aqui; Os protocolos tradicionais de marcação por imunofluorescência de montagem completa geralmente levam entre 3 dias e várias semanas 10,11,12,13,14.

A incorporação de parafina, outra etapa prejudicial que reduz a antigenicidade, também é omitida. A estrutura 3D permanece em seu ambiente in vitro do início ao fim do exame microscópico. Como a estrutura 3D permanece em suas condições de crescimento, os dados de expressão e localização de proteínas imitam melhor as condições in vivo. Resultados mais precisos são esperados, uma vez que a metodologia elimina as etapas que afetam a expressão do antígeno da amostra. A Tabela 1 e a Tabela 2 demonstram como esses novos protocolos eliminam etapas, economizam tempo e mão de obra no laboratório e reduzem custos e desperdício de produtos em comparação com os fluxos de trabalho tradicionais.

Além das etapas cruciais descritas acima, outro problema é fornecer um meio e método de criopreservação para preservar a estrutura 3D da amostra com maiores taxas de viabilidade celular 26,27,28,29,30,31. A criopreservação é essencial para a criação de um sistema modelo estável e para viabilizar o biobanco de organoides e esferoides32,33. O biobanco de toda a estrutura 3D original permitirá uma recapitulação mais fiel do estado natural de saúde ou doença. As principais considerações são a conveniência e a confiabilidade da criopreservação e o descongelamento de organoides/esferoides. A recuperação de organoides pós-descongelamento é muito baixa na maioria das tecnologias atuais, muitas vezes inferior a 50%. No entanto, estudos recentes têm mostrado resultados promissores com melhora das taxas de sobrevida26,27,28,29. Lee et al. demonstraram que 78% das células esferoides sobreviveram após a criopreservação quando utilizaram a solução da Universidade de Wisconsin contendo 15% de DMSO28. A razão de sobrevida celular aumentou para 83% no estudo de Arai et al.29. No entanto, os resultados após a criopreservação são significativamente afetados, uma vez que as estruturas 3D não podem manter as mesmas características e qualidade. Além disso, os reagentes sem soro são necessários para as boas práticas de fabricação em ambientes farmacêuticos e de diagnóstico. Os fluxos de trabalho tradicionais usam um meio contendo soro fetal bovino (FBS) e dimetilsulfóxido (DMSO) para o método de congelamento lento, ambos associados a desvantagens. FBS é um produto derivado de animais e pode ter variações de lote. O DMSO é um crioprotetor muito bem-sucedido, mas a exposição a longo prazo, especialmente durante o descongelamento, pode causar efeitos citotóxicos30,31.

Este artigo também descreve a metodologia de congelamento/descongelamento de organoides inteiros ou esferoides ainda em um hidrogel. Duas fórmulas para congelamento de organoides e esferoides são utilizadas no estudo: (1) DMSO a 10% contendo solução de congelamento tradicional (FS) e (2) um meio de criopreservação sem soro e DMSO. Este meio de criopreservação contém componentes da matriz extracelular, que são diferentes das fórmulas atuais. A matriz extracelular compreende duas classes principais de macromoléculas, proteoglicanos e proteínas fibrosas, que são essenciais para o andaime físico para os constituintes celulares, mas também iniciam processos necessários para a morfogênese, diferenciação e homeostase tecidual 34,35,36,37,38,39,40 . Os colágenos proporcionam resistência à tração, regulam a adesão celular, suportam a quimiotaxia e a migração e o desenvolvimento direto dos tecidos37. Além disso, as fibras de elastina fornecem recuo aos tecidos que sofrem alongamento repetido38. Uma terceira proteína fibrosa, a fibronectina, direciona a organização da matriz extracelular intersticial e tem papel crucial na mediação da fixação celular e funciona como um mecano-regulador extracelular39. Du et al. demonstraram o efeito crioprotetor do hidrolisado de colágeno de frango sobre o sistema modelo de actomiosina natural41. Seus resultados sugerem que o hidrolisado de colágeno pode inibir o crescimento de cristais de gelo, reduzir a desnaturação e oxidação por congelamento de proteínas de forma semelhante aos crioprotetores comerciais e fornecer uma melhor estrutura de gel após os ciclos de congelamento-descongelamento. Portanto, a adição de componentes da matriz extracelular ao meio de criopreservação fornece um ambiente mais seguro e protetor para a amostra e suporta as estruturas vivas para curar após o congelamento-descongelamento.

Além disso, o presente estudo descreve um protocolo simples para marcar membranas citoplasmáticas e núcleos de organoides e esferoides vivos enquanto ainda estão no hidrogel.

Protocolo

1. Cultivo de organoides e esferoides

  1. Coloque o hidrogel no gelo durante a noite (em uma geladeira ou em uma câmara fria) para descongelar.
  2. Coloque o dispositivo multiuso comercialmente disponível (MD; ver Tabela de Materiais) na incubadora 1 dia antes do experimento (37 °C, 5% de CO2) para aquecer.
  3. Coloque as pontas estéreis da pipeta de extremidade larga no frigorífico a 4 °C.
    NOTA: As etapas 1.1-1.3 devem ser executadas no Dia 0 e as etapas 1.4-1.11 devem ser executadas no Dia 1.
  4. Coloque o hidrogel no gelo em um exaustor de fluxo laminar por 15 min.
    1. Opcional: Diluir o hidrogel em meio de cultura de células frias de acordo com a recomendação do fabricante.
  5. Coloque o tubo contendo um pellet de células HepG2 (linhagem celular de carcinoma hepatocelular obtida comercialmente; ver Tabela de Materiais) no gelo.
  6. Placa 30-35 μL de hidrogel 100% dentro do nicho do dispositivo pré-aquecido para criar uma gota de gel.
  7. Colocar 10.000 células HepG2 no meio do topo de cada gota de hidrogel (Figura 2) e incubar por 15 min a 37 °C.
  8. Cubra a gota de hidrogel com 200 μL de Meio Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco com 10% de Soro Fetal Bovino.
  9. Cubra a tampa do MD na posição correta para permitir o fluxo de gás e coloque o dispositivo na incubadora.
  10. Alimente as células com 200 μL de DMEM com 10% de FBS a cada dois dias.
  11. Verifique o crescimento dos esferoides sob microscópio invertido (Figura 3). A formação de esferoides começa após o3º dia. O vídeo 1 mostra a localização de esferoides em diferentes níveis em uma cúpula de hidrogel.
    NOTAS: É altamente recomendável aspirar suavemente o líquido ao redor do hidrogel e adicionar lentamente o novo líquido ao ambiente para evitar danificar as gotas de hidrogel.

2. Coloração de hematoxilina e eosina de organoides/esferoides de montagem inteira em um hidrogel

  1. Aqueça o fixador (4% paraformaldeído; PFA), PBS e hematoxilina (ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
  2. Aspirar o meio que envolve a gota de hidrogel com uma pipeta, adicionar 100-200 μL de PFA a 4% para fixar e incubar durante 15-20 min a 37 °C.
  3. Aspirar o PFA a 4% e adicionar 200 μL de PBS para lavar 3x durante 5 min cada a 37 °C. Em seguida, aspirar o PBS e incubar com 200 μL de solução de hematoxilina por 15-20 min a 37 °C.
  4. Aspirar a hematoxilina e adicionar 200 μL de dH2O para lavar 3x durante 10 min cada a 37 °C. Aspirar o dH2O e incubar com 200 μL de etanol durante 5-10 min a 37 °C.
  5. Aspirar o etanol e incubar com 200 μL de eosina (ver Tabela de Materiais) durante 10 min a 37 °C. Aspirar a eosina e adicionar 200 μL de dH2O para lavar durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
  6. Aspirar o dH2O e adicionar 100 μL de glicerol para cobrir a gota de hidrogel como meio de montagem.
  7. Opcional: Monte o nicho com uma tampa. Esta etapa pode ser omitida para evitar a compressão de organoides/esferoides de tamanho considerável.
  8. Feche a tampa do MD com firmeza para evitar a secagem até o exame. A amostra é estável para exame por pelo menos 6 meses.

3. Imuno-histoquímica de organoides/esferoides de montagem inteira em um hidrogel

  1. Aquecer a solução para imuno-histoquímica obtida comercialmente (S-IHC; ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
  2. Incubar os organoides ou esferoides no hidrogel com peróxido de hidrogénio a 3% (H 2 O 2) em 200 μL de dH2O durante 5min a 37 °C.
  3. Aspirar a solução de peróxido de hidrogénio e lavar em dH2O durante 5 min a 37 °C. Aspirar o dH2O e incubar duas vezes com 100 μL de S-IHC a 37 °C durante 10 min cada.
  4. Aspirar o S-IHC e incubar com 100 μL de anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) diluído em S-IHC durante 1-2 h a 37 °C (seguindo as recomendações do fabricante em matéria de diluição de trabalho).
  5. Aspirar a solução de anticorpos primários e incubar com 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada a 37 °C.
  6. Aspirar 100 μL de S-IHC e incubar com um anticorpo secundário biotinilado (ver Tabela de Materiais) durante 10 minutos a 37 °C.
  7. Aspirar a solução de anticorpos secundários e incubar com 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada a 37 °C. Aspirar o S-IHC e incubar com 100 μL de peroxidase de rábano (HRP) marcada com estreptavidina (ver Tabela de Materiais) durante 10 minutos a 37 °C.
  8. Aspirar a PCR marcada com estreptavidina e incubar com 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada a 37 °C.
  9. Aspirar o S-IHC e incubar com 100 μL de mistura de solução cromogénica DAB/AEC (ver Tabela de Materiais) durante 5-10 min a 37 °C.
  10. Monitore a intensidade da coloração sob um microscópio de luz.
  11. Lave com dH 2 O 3x por2min cada.
  12. Opcional: Incubar com 100 μL de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) para contracoloração nuclear durante 5 min a 37 °C.
  13. Aspirar a hematoxilina e lavar em dH2O durante 5 min.
  14. Aspirar o dH2O e cobrir a gota de hidrogel com 100 μL de glicerol como meio de montagem.
  15. Feche a tampa do MD firmemente até o exame microscópico.
    NOTAS: As etapas de recuperação de antígenos e bloqueio de proteínas são omitidas neste protocolo, uma vez que o S-IHC elimina essas etapas.

4. Marcação por imunofluorescência de organoides/esferoides de montagem inteira em um hidrogel

  1. Aqueça os seguintes materiais a 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, solução de anticorpos primários em S-IF, solução de anticorpos secundários em S-IF, coloração nuclear e glicerol (ver Tabela de Materiais).
  2. Aspirar o meio de cultura celular e fixar com 200 μL de PFA a 4% durante 15-30 min a 37 °C. Aspirar o fixador e lavar em S-IF 3x durante 10 min cada a 37 °C.
  3. Adicione dH2O ao lado ao redor do nicho para fornecer umidade durante as etapas seguintes.
  4. Aspirar o S-IF em torno da gota de hidrogel e incubar a gota de hidrogel com 100 μL de solução de anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) em S-IF durante 30-60 min a 37 °C.
  5. Aspirar a solução de anticorpos primários e lavar em S-IF 3x durante 10 min cada a 37 °C.
  6. Aspirar o S-IF e incubar com 100 μL de solução de anticorpos secundários (ver Tabela de Materiais) em S-IF durante 30-60 min a 37 °C no escuro.
  7. Aspirar a solução de anticorpos secundários e lavar com PBS 3x durante 10 minutos cada um a 37 °C no escuro.
  8. Aspirar o PBS e incubar com 100 μL de coloração de ADN nuclear contendo meio de montagem ou glicerol a 37 °C no escuro.
  9. Preencha o nicho com glicerol para evitar a secagem.
  10. Opcional: Cubra o nicho com uma folha de cobertura. Este passo pode ser omitido para evitar espremer os organoides/esferoides.
  11. Feche bem o MD. As amostras em MDs podem ser armazenadas a 4 °C no escuro por pelo menos 6 meses com perda mínima de fluorescência.
  12. Use as seguintes configurações para exame microscópico confocal: defina o valor do orifício de todos os canais como 20,1, mantenha a constante mestre de ganho em 550 para 488 nm, 485 para 550 nm e 450 para 594 nm, mantenha a potência do laser constante para todos os experimentos e a menor porcentagem em 2,0.
    NOTAS: Anticorpos primários: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumina (1:50), Anti-Beta-Galactosidase (1:25), Anticorpo Antimitocondrial (1:100), Anticorpo Anti-Golgi (1:50), Anti-Citoqueratina 5 (1:100), Anticorpo Ov6 (1:100). Anticorpos secundários: IgG anti-Coelho de Cabra (H+L)- 488, IgG de Cabra anti-Coelho (H+L)-550, IgG de Cabra anti-Rato (H+L)-488, IgG de Cabra anti-Rato (H+L)-550, IgY anti-Galinha de Cabra (H+L)-647. A diluição para todos os anticorpos secundários é de 1:100. Além disso, FITC-Faloidina (1:100), um anticorpo conjugado, também é usado (ver Tabela de Materiais).

5. Marcação da membrana plasmática e do núcleo de organoides e esferoides vivos em um hidrogel

  1. Preparar a solução de rotulagem contendo aglutinina de gérmen de trigo Alexa fluor (5,0 μg/ml) e Hoechst (2 μM) na solução salina equilibrada de Hank (HBSS), de acordo com as recomendações do fabricante (ver Tabela de Materiais), e aquecer até 37 °C.
  2. Aspirar o meio de cultura celular e adicionar 100 μL de solução de marcação para cobrir a gota de hidrogel. Incubar durante 15-30 min a 37 °C.
  3. Retirar a solução de rotulagem e lavar duas vezes em PBS 2x durante 10 min cada a 37 °C. Opcional: Fixar com 200 μL de formaldeído a 4% durante 15 min a 37 °C.
  4. Cubra a gota de hidrogel com glicerol como meio de montagem. Opcional: Monte o nicho com um vidro de cobertura.
  5. Feche bem a tampa do MD e mantenha-o refrigerado no escuro até o exame microscópico de fluorescência/confocal. É estável por pelo menos 6 meses.

6. Congelamento e descongelamento de organoides/esferoides inteiros num hidrogel

  1. Congele os organoides seguindo os passos abaixo.
    1. Aquecer a solução de congelação obtida comercialmente (FS; ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
    2. Aspirar o meio de cultura celular em torno da cúpula de hidrogel suavemente.
    3. Adicione 200 μL de FS suavemente. Incubar a amostra com FS a 37 °C durante 1 h.
    4. Feche bem a tampa do dispositivo e coloque-a em uma caixa de espuma. Coloque esta caixa de espuma noutra caixa de espuma, como mostra a Figura 3 suplementar. Feche ambas as caixas de espuma com força. Duas caixas de espuma dentro uma da outra fornecem uma faixa de gradiente de resfriamento de temperatura de 1 a 2 ° C / min da amostra em um freezer de -20 ° C.
    5. Colocar a caixa a -20 °C durante 2 h. Transfira a caixa para um congelador a -80 °C e deixe-a durante a noite.
    6. Retire a amostra das caixas. A amostra no MD pode ser mantida no congelador a -80 °C durante 6 meses.
    7. Transfira o MD que contém a amostra para o tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
  2. Descongele os organoides seguindo os passos abaixo.
    1. Retire o MD que contém a amostra do congelador/reservatório de azoto e coloque-o directamente numa incubadora a 37 °C. Incubar durante 1 h a 37 °C.
    2. Adicionar 200 μL de meio de cultura quente ao nicho (a proporção de FS para meio de cultura celular é de 1:1) e incubar por 30 min a 37 °C.
    3. Adicionar mais meio de cultura quente ao nicho (a proporção de FS para o meio de cultura celular é de 1:2) e incubar por 30 min a 37 °C.
    4. Aspirar suavemente a mistura média e FS. Prossiga para a microscopia eletrônica de varredura (etapa 7) e microscopia eletrônica de transmissão (etapa 8) imagens dos organoides/esferoides de montagem inteira no hidrogel.

7. Microscopia eletrônica de varredura de organoides/esferoides de montagem inteira

  1. Aqueça a solução fixadora e pós-fixadora de Karnovsky (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente (RT).
  2. Aspirar o meio de cultura celular em torno do hidrogel no MD. Colocar a amostra no MD sobre gelo no exaustor de fluxo laminar por 15 min.
  3. Aspirar o hidrogel liquefeito em torno dos organoides/esferoides muito suavemente. Uma quantidade limitada de matrigel pode permanecer no nicho para evitar danificar e perder a amostra.
  4. Fixe com o fixador de Karnovsky (2% PFA, 2,5% glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,15 M e 2 mM CaCl2; ver Tabela de Materiais) em RT por 1 h.
  5. Aspirar o fixador suavemente e lavar com água destilada (dH2O) 3x durante 15 min cada.
  6. Aspirar o dH2O suavemente e fixar com solução pós-fixadora (tetróxido de ósmio aquoso a 1% [OsO4]; ver Tabela de Materiais) em RT durante 1 h.
  7. Aspirar o pós-fixador suavemente e lavar com água destilada (dH2O) 3x durante 15 min cada.
  8. Desidratar em uma série graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mistura de etanol/acetona (1:1; 1:2) e acetona absoluta no RT por 15 min cada.
  9. Seque com um secador de ponto crítico.
  10. Revestir o provete no dispositivo com 6 nm de ouro/paládio utilizando um revestidor de esguicho (ver Tabela de Materiais) durante 90 s.
  11. Observe sob um microscópio eletrônico de varredura com um detector de elétrons secundário na lente a 2-3 kV no modo de vácuo (5 x 10-6 mA). Tire imagens com uma distância de trabalho de 8,1-8,2 mm e em ampliações de 675x, 1050x e 1570x.
    Observações: Todas as etapas são executadas no MD. Use 200-250 μL de solução para cada etapa.

8. Microscopia eletrônica de transmissão de organoides/esferoides inteiros em um hidrogel

  1. Aqueça o fixador de Karnovsky a 37 °C. Aspirar o meio de cultura celular em torno do hidrogel no MD.
  2. Fixe a amostra com o fixador de Karnovsky em RT por 1 h. Lave com dH2O 3x por 15 min cada.
  3. Pós-fixação com OsO4 aquoso a 2% e ferrocianeto de potássio a 2,5% no RT por 45 min. Lave com dH2O 3x por 10 min cada.
  4. Incubar em tiocarbohidrazida a 0,5% (TCH; ver Tabela de Materiais) a RT durante 30 min. Lave com dH2O 3x por 10 min cada.
  5. Incubar em OsO4 aquoso a 2% no RT por 30 min. Lave com dH2O 3x por 10 min cada.
  6. Incubar em solução de acetato de uranilo a 2% (ver Tabela de Materiais) a RT durante 1 h.
    NOTA: Nesta etapa, os esferoides podem ser mantidos a 4 °C durante a noite.
  7. Incubar em solução de aspartato de chumbo (ver Tabela de Materiais) a 60 °C durante 45 min. Lave com dH2O 3x por 10 min cada.
  8. Desidratar em uma série graduada de etanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) e acetona absoluta em RT por 15 min cada.
  9. Trate com uma mistura de (1:1; 1:2) resina de acetona/Epon e resina Epon pura (ver Tabela de Materiais) em RT por 2 h cada.
  10. Polimerizar a resina a 60 °C durante a noite (mínimo de 16 h). Após a polimerização, retire o bloco de resina do MD, como mostra a Figura 4 Suplementar.
  11. Prenda o bloco de resina a um maior com uma cola de resina. Apare o bloco e alcance a localização de organoides ou esferoides.
  12. Obtenha seções semifinas (1.000 nm) e ultrafinas (60 nm) usando um ultramicrótomo (consulte Tabela de materiais).
  13. Coloque as seções ultrafinas em grades de cobre de malha 100 e observe sob um microscópio eletrônico de varredura com um detector STEM a uma tensão de aceleração de 30 kV. Capture imagens com uma distância de trabalho de 44 mm e em ampliações de 2580x, 5020x e 6060x.
    NOTAS: Use 200-250 μL de solução para cada etapa. As etapas 8.1-8.10 são executadas no MD.

Resultados

O presente artigo representa um dispositivo multiuso (MD) e metodologias complementares para cultura, congelamento, descongelamento, coloração histológica, coloração imuno-histoquímica, marcação por imunofluorescência, revestimento e processamento de organoides ou esferoides inteiros ainda em um hidrogel em um único ambiente de design exclusivo. O estudo atual foi projetado para preparar esferoides de câncer de fígado HepG2 em 35 gotas de hidrogel em 35 MDs. Experimentos foram conduzidos em triplicado para ga...

Discussão

O MD, complementando as formulações e protocolos aqui descritos, facilita o crescimento 3D rápido e espontâneo de organoides e esferoides em um ambiente mais controlado e continua o experimento nas mesmas condições. O espécime permanece no mesmo ambiente durante todo o processo, e quase 100% das arquiteturas de cultivo 3D permanecem intactas no recipiente. Isso melhora a homogeneidade durante os experimentos sequenciais e permite um período de cultura prolongado. Além disso, o número de etapas durante o process...

Divulgações

Ranan Gulhan Aktas possui pedidos de patentes MD, S-IHC, S-IF e FS. Olgu Enis Tok esteve envolvido no desenvolvimento destes produtos. Olgu Enis Tok e Gamze Demirel são membros da equipe de P&D da empresa chamada Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut e Ozgecan Kayalar não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Somos gratos a Dale Mertes, da Universidade de Chicago, pela preparação de diagramas, ao Dr. Mehmet Serif Aydin por seu apoio técnico no Instituto de Pesquisa em Ciências e Tecnologias da Saúde da Universidade Medipol de Istambul e à Dra. Rana Kazemi, da Universidade de Maltepe, pela edição do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute Ethanol (EtOH)Merck8187602500Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
AcetoneMerck8222512500Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal AntibodyBiocare MedicalCP 028 AStore at +4 °C
Anti-albumin antibodyAbcamEPR20195Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonalAbcam134435Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5Abcam53121Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal AntibodyBiocare MedicalACI 3058 A, BStore at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC1016-500GDissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Centrifuge tubes, 15 mL Nest601051
Centrifuge tubes, 50 mL Nest602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 IncubatorPanasonicKM-CC17RU2
Copper GridsElectron Microscopy SciencesG100-CuUltra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point DryerLeicaEM CPD300For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture  Sigma AldrichAEC101Store at +4 °C
Diamond knifeDiatomeUltra 45°, 40-USUse for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biologyBiofroxx67-68-5
Disposable Plastic Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Store at +4 °C
Eosin Y Solution AlcoholicBright Slide2.BS01-105-1000
Epon resin Sigma45359-1EA-FEpoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)CelloramaCellO-FStore at +4 °C
Glass knife makerLeicaEM KMR3For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% Electron Microscopy Sciences16210Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solutionSigma Aldrich56-81-5Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647InvitrogenA32933Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35502Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84540Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35552Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84541Store at +4 °C
Hematoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 cellsATCCHB-8065Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6R&D SystemsMAB2020Store at -20 °C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R&D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acidSigma11189-100GStore at RT
Lead aspartate solutionDissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrateElectron Microscopy Sciences17900Store at RT
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal MicroscopeZeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
Nuclear-DNA stainInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stainThermoFischer Scientific62248DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%Electron Microscopy Sciences19190Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibodyR&D systemsMAB2020Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% Sigma1.04005.1000Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tabletsMP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISSZeissItem no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mLNest620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachmentZeissGeminiSEM 500We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2Electron Microscopy Sciences11655Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 °C
Specimen trimming deviceLeicaEM TRIM2For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coaterLeicaEM ACE200Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GDilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2CFor glue polymerized epon block with sample to holder epon block
UltramicrotomeLeicaEM UC7For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µLNest171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µLIsolabL-002
Universal Pipette Tips, 200 µL Nest110919HA01
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

Referências

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