JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La présente étude décrit des méthodologies pour la culture, la congélation, la décongélation, le traitement, la coloration, l’étiquetage et l’examen de sphéroïdes et d’organoïdes entiers sous divers microscopes, alors qu’ils restent intacts dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent.

Résumé

Les organoïdes et les sphéroïdes, structures de croissance tridimensionnelles dans les laboratoires de culture cellulaire, sont de plus en plus reconnus comme des modèles supérieurs par rapport aux modèles de culture bidimensionnels, car ils imitent mieux le corps humain et présentent des avantages par rapport aux études animales. Cependant, ces études rencontrent souvent des problèmes de reproductibilité et de cohérence. Au cours des longs processus expérimentaux - avec les transferts d’organoïdes et de sphéroïdes entre différents vaisseaux de culture cellulaire, le pipetage et la centrifugation - ces structures de croissance 3D sensibles et fragiles sont souvent endommagées ou perdues. En fin de compte, les résultats sont considérablement affectés, car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et la même qualité. Les méthodes décrites ici minimisent ces étapes stressantes et assurent un environnement sûr et cohérent pour les organoïdes et les sphéroïdes tout au long de la séquence de traitement alors qu’ils sont encore dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent. Les chercheurs peuvent cultiver, congeler, décongeler, traiter, colorer, étiqueter, puis examiner la structure des organoïdes ou des sphéroïdes sous divers instruments de haute technologie, des microscopes confocaux aux microscopes électroniques, à l’aide d’un seul dispositif polyvalent. Cette technologie améliore la reproductibilité, la fiabilité et la validité des études, tout en maintenant un environnement stable et protecteur pour les structures de culture 3D pendant le traitement. De plus, l’élimination des étapes stressantes minimise les erreurs de manipulation, réduit le temps nécessaire et diminue le risque de contamination.

Introduction

L’avenir de la recherche et de la thérapie cellulaires réside dans les cultures cellulaires 3D 1,2,3. Les modèles organoïdes et sphéroïdes comblent l’écart entre les expériences in vitro et les modèles animaux en créant de meilleurs modèles qui imitent le développement du corps humain, la physiologie et les maladies 4,5,6,7,8,9. Cependant, la reproductibilité et la répétabilité de ces modèles restent difficiles. De plus, la manipulation, la récolte, le transfert et la centrifugation de ces structures avec les technologies actuelles entraînent la perte ou l’endommagement des organoïdes et des sphéroïdes dans de nombreuses conditions, ce qui affecte considérablement les résultats.

Malgré de nombreux protocoles de coloration histologique, de coloration immunohistochimique, de marquage par immunofluorescence et de cryoconservation, il n’existe pas d’approche universelle liée à la normalisation des conditions expérimentales, à la manipulation et au traitement de ces structures délicates sans les perdre ou les endommager. Les protocoles actuels sont également incroyablement longs, alternant de quelques jours à plusieurs semaines, et comprennent des procédures complexes avec divers réactifs 10,11,12,13,14. De plus, la récolte, le pipetage, la centrifugation et le transfert de structures de culture 3D entre les récipients de culture cellulaire et les cryoviales provoquent des changements dans le positionnement des structures et des forces mécaniques, et affectent finalement la différenciation et la maturation des organoïdes et des sphéroïdes. Il a été rapporté que la topologie des tissus, le positionnement des cellules et les forces mécaniques ont un impact significatif sur la différenciation et la maturation cellulaires 6,15,16,17.

Par conséquent, il est souhaitable d’améliorer les technologies conventionnelles actuelles pour générer des organoïdes et des sphéroïdes de qualité stable. Une méthode/un dispositif qui sautera la centrifugation et les autres étapes décrites ci-dessus et fournira le matériau dans un seul environnement sûr du début à la fin des multiples processus serait bénéfique pour obtenir les données les plus cohérentes et les plus fiables. De plus, cela réduira les contraintes de temps, de main-d’œuvre et de coûts.

Le dispositif polyvalent (DM) décrit ici fournit un environnement sûr unique pour de multiples processus d’organoïdes et de sphéroïdes (Figure supplémentaire 1). Ce dispositif et les protocoles complémentaires éliminent les étapes de récolte, de pipetage, de transfert et de centrifugation. Les organoïdes et les sphéroïdes restent dans leur environnement in vitro pendant les processus séquentiels. Cet environnement comprend principalement des composants naturels ou synthétiques de la matrice extracellulaire, comme les hydrogels disponibles dans le commerce. En d’autres termes, les méthodes décrites ici permettent de traiter, d’examiner et de congeler un échantillon entier d’organoïdes / sphéroïdes tout en restant dans une goutte d’hydrogel.

Le dispositif biocompatible résiste à des températures comprises entre 60 °C et -160 °C, ce qui permet de restaurer les organoïdes/stéroïdes dans un réservoir d’azote liquide à -160 °C ou de préparer des blocs de résine pour la microscopie électronique à 60 °C. La niche du dispositif a été conçue pour définir un espace limité pour les structures de croissance 3D et stimuler la formation de sphéroïdes ou d’organoïdes sur la base des études précédentes 18,19,20,21,22,23. Cette partie de l’appareil est transparente et contient un plastique spécifique qui offre une qualité optique élevée (indice de réfraction : 1,43 ; valeur abbe : 58 ; épaisseur : 7,8 mil [0,0078 in ou 198 μm]). La niche et la partie « latérale » environnante provoquent une autofluorescence. La niche transparente au centre a une surface de 80 mm 2, tandis que la partie latérale est de 600 mm2. La profondeur du conteneur est de 15 mm et l’épaisseur est de 1,5 mm. Ces caractéristiques, outre la taille et la conception de l’appareil, permettent de réaliser des observations sous différents types de microscopes de haute technologie et de préparer les échantillons pour des examens au microscope électronique (Figure 2). Le système de fermeture de l’appareil fournit deux positions, l’une scellée dans le congélateur et l’autre permettant l’écoulement du gaz dans l’incubateur. Les essais de prolifération et de cytotoxicité CCK8 démontrent des effets similaires sur les cellules par rapport aux boîtes de culture cellulaire traditionnelles (figure supplémentaire 2). Le test d’exclusion du bleu de trypan démontre une viabilité cellulaire élevée (94%) lors de la culture cellulaire dans la DM (Figure 3).

Les processus qui peuvent être effectués pour un échantillon dans le dispositif unique comprennent (1) la culture, (2) la coloration histologique, (3) l’immunomarquage, y compris le marquage immunohistochimique et immunofluorescence, (4) la congélation, (5) la décongélation, (6) l’examen au microscope optique, tel que les microscopes à fond clair, à fond noir, à fluorescence, confocaux et à superrésolution, (7) le revêtement et l’examen directement sous un microscope électronique à balayage, ou (8) la préparation à la microscopie électronique à transmission ( Graphique 2).

Différentes méthodologies existent pour la coloration histologique, le marquage immunohistochimique ou le marquage fluorescent des organoïdes et des sphéroïdes 10,11,12,13,14,24,25. Les récolter à partir de l’hydrogel est la première et principale étape de la technologie actuelle. Après cette étape, certaines méthodes permettent l’immuno-marquage à montage entier. Les organoïdes récoltés sont incorporés dans de la paraffine, sectionnés et étiquetés pour la coloration et l’immunomarquage chez les autres. Cependant, les sections peuvent ne pas présenter l’échantillon complet et ne fournir que des données limitées liées à l’architecture 3D de la structure. De plus, les dommages causés à ces structures 3D et la perte d’antigénicité sont des effets secondaires bien connus de ces technologies.

Les nouveaux protocoles complémentaires pour les examens microscopiques de cet article permettent une analyse d’échantillons entiers encore dans un hydrogel. Les protocoles décrits ici comprennent deux formulations nouvellement développées : solution pour immunohistochimie (S-IHC) et solution pour marquage par immunofluorescence (S-IF). Les méthodes avec ces solutions permettent aux chercheurs d’obtenir des données plus précises, car il n’y a pas d’effets néfastes des flux de travail traditionnels, tels que la centrifugation, le pipetage et le transfert des structures délicates. Le protocole décrit ici élimine également le besoin d’étapes de prélèvement, de blocage, de défrichage et de récupération de l’antigène, et raccourcit l’ensemble de la procédure à 6-8 heures. De plus, la méthodologie permet d’ajouter simultanément un à trois anticorps au même S-IF. Par conséquent, il est possible d’obtenir les résultats le même jour même après les multiples expériences d’étiquetage, ce qui est un autre avantage du protocole décrit ici; Les protocoles traditionnels d’étiquetage par immunofluorescence à montage entier prennent généralement entre 3 jours et plusieurs semaines 10,11,12,13,14.

L’incorporation de paraffine, une autre étape néfaste qui réduit l’antigénicité, est également omise. La structure 3D reste dans son environnement in vitro du début à la fin de l’examen microscopique. Étant donné que la structure 3D reste dans ses conditions de croissance, les données d’expression et de localisation des protéines imitent mieux les conditions in vivo . Des résultats plus précis sont attendus, car la méthodologie élimine les étapes affectant l’expression de l’antigène de l’échantillon. Les tableaux 1 et 2 montrent comment ces nouveaux protocoles éliminent les étapes, permettent d’économiser du temps et de la main-d’œuvre en laboratoire et de réduire les coûts et les déchets par rapport aux flux de travail traditionnels.

En plus des étapes cruciales décrites ci-dessus, un autre problème est de fournir un milieu de cryoconservation et une méthode pour préserver la structure 3D de l’échantillon avec des taux de viabilité cellulaire plus élevés 26,27,28,29,30,31. La cryoconservation est essentielle pour créer un système modèle stable et permettre la biobanque d’organoïdes et de sphéroïdes32,33. La biobanque de l’ensemble de la structure 3D originale permettra une récapitulation plus fidèle de l’état naturel de santé ou de maladie. Les considérations clés sont la commodité et la fiabilité de la cryoconservation et la décongélation des organoïdes / sphéroïdes. La récupération des organoïdes post-dégel est très faible dans la plupart des technologies actuelles, souvent inférieure à 50%. Cependant, des études récentes ont montré des résultats prometteurs avec des taux de survie améliorés26,27,28,29. Lee et al. ont démontré que 78% des cellules sphéroïdes ont survécu après la cryoconservation lorsqu’ils ont utilisé la solution de l’Université du Wisconsin contenant 15% de DMSO28. Le rapport de survie cellulaire a augmenté à 83% dans l’étude d’Arai et al.29. Cependant, les résultats après cryoconservation sont considérablement affectés car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et qualités. En outre, des réactifs sans sérum sont nécessaires pour les bonnes pratiques de fabrication dans les environnements pharmaceutiques et diagnostiques. Les flux de travail traditionnels utilisent un milieu contenant du sérum bovin fœtal (FBS) et du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la méthode de congélation lente, qui sont tous deux associés à des handicaps. FBS est un produit d’origine animale et peut avoir des variations de lot. Le DMSO est un cryoprotecteur très efficace, mais une exposition à long terme, en particulier lors de la décongélation, peut provoquer des effets cytotoxiques30,31.

Cet article décrit également la méthodologie de congélation / décongélation d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes encore dans un hydrogel. Deux formules pour congeler des organoïdes et des sphéroïdes sont utilisées dans l’étude : (1) 10% de DMSO contenant une solution de congélation traditionnelle (FS) et (2) un milieu de cryoconservation sans sérum et DMSO. Ce milieu de cryoconservation contient des composants de matrice extracellulaire, qui sont différents des formules actuelles. La matrice extracellulaire comprend deux classes principales de macromolécules, les protéoglycanes et les protéines fibreuses, qui sont essentielles pour l’échafaudage physique des constituants cellulaires, mais qui initient également les processus nécessaires à la morphogenèse, à la différenciation et à l’homéostasie tissulaires 34,35,36,37,38,39,40 . Les collagènes fournissent une résistance à la traction, régulent l’adhésion cellulaire, soutiennent la chimiotaxie et la migration, et dirigent le développement tissulaire37. De plus, les fibres d’élastine assurent le recul des tissus qui subissent des étirements répétés38. Une troisième protéine fibreuse, la fibronectine, dirige l’organisation de la matrice extracellulaire interstitielle et joue un rôle crucial dans la médiation de la fixation cellulaire et fonctionne comme un mécano-régulateur extracellulaire39. Du et al. ont démontré l’effet cryoprotecteur de l’hydrolysat de collagène de poulet sur le système modèle naturel d’actomyosine41. Leurs résultats suggèrent que l’hydrolysat de collagène peut inhiber la croissance des cristaux de glace, réduire la dénaturation et l’oxydation des protéines de la même manière que les cryoprotecteurs commerciaux et fournir une meilleure structure de gel après les cycles de gel-dégel. Par conséquent, l’ajout de composants de matrice extracellulaire au milieu de cryoconservation fournit un environnement plus sûr et protecteur pour l’échantillon et favorise la guérison des structures vivantes après congélation-décongélation.

De plus, la présente étude décrit un protocole simple pour marquer les membranes cytoplasmiques et les noyaux d’organoïdes et de sphéroïdes vivants alors qu’ils sont encore dans l’hydrogel.

Protocole

1. Culture d’organoïdes et de sphéroïdes

  1. Placez l’hydrogel sur de la glace pendant la nuit (dans un réfrigérateur ou une chambre froide) pour le décongeler.
  2. Placer l’appareil polyvalent disponible dans le commerce (DM; voir le tableau des matériaux) dans l’incubateur 1 jour avant l’expérience (37 °C, 5% CO2) pour le réchauffer.
  3. Placer les pointes de pipettes larges stériles au réfrigérateur à 4 °C.
    REMARQUE : Les étapes 1.1 à 1.3 doivent être effectuées le jour 0 et les étapes 1.4 à 1.11 doivent être effectuées le jour 1.
  4. Placez l’hydrogel sur de la glace dans une hotte à écoulement laminaire pendant 15 min.
    1. Facultatif : Diluer l’hydrogel dans un milieu de culture cellulaire froid conformément aux recommandations du fabricant.
  5. Placer le tube contenant une pastille de cellules HepG2 (lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire obtenue commercialement; voir le tableau des matériaux) sur de la glace.
  6. Plaque 30-35 μL d’hydrogel 100% dans la niche de l’appareil préchauffé pour créer une goutte de gel.
  7. Placer 10 000 cellules HepG2 au milieu du haut de chaque goutte d’hydrogel (Figure 2) et incuber pendant 15 min à 37 °C.
  8. Couvrir la goutte d’hydrogel avec 200 μL de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% de sérum bovin fœtal.
  9. Couvrez le couvercle du MD dans la bonne position pour permettre l’écoulement du gaz et placez l’appareil dans l’incubateur.
  10. Alimentez les cellules avec 200 μL de DMEM avec 10% FBS tous les deux jours.
  11. Vérifiez la croissance des sphéroïdes au microscope inversé (Figure 3). La formation sphéroïde commence après le3ème jour. La vidéo 1 montre l’emplacement des sphéroïdes à différents niveaux dans un dôme d’hydrogel.
    NOTES: Il est fortement recommandé d’aspirer doucement le liquide entourant l’hydrogel et d’ajouter lentement le nouveau liquide à l’environnement pour éviter d’endommager les gouttes d’hydrogel.

2. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

  1. Réchauffer le fixateur (4% de paraformaldéhyde; PFA), PBS et hématoxyline (voir le tableau des matières) jusqu’à 37 °C.
  2. Aspirer le milieu entourant la goutte d’hydrogel avec une pipette, ajouter 100-200 μL de PFA à 4% à fixer, et incuber pendant 15-20 min à 37 °C.
  3. Aspirer le PFA à 4 % et ajouter 200 μL de PBS pour laver 3x pendant 5 min chacun à 37 °C. Ensuite, aspirer le PBS et incuber avec 200 μL de solution d’hématoxyline pendant 15-20 min à 37 °C.
  4. Aspirer l’hématoxyline et ajouter 200 μL dedH2Opour laver 3x pendant 10 min chacun à 37 °C. Aspirer ledH2Oet incuber avec 200 μL d’éthanol pendant 5-10 min à 37 °C.
  5. Aspirer l’éthanol et incuber avec 200 μL d’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C. Aspirer l’éosine et ajouter 200 μL dedH2Opour laver pendant 5 min à température ambiante (RT).
  6. Aspirer ledH2Oet ajouter 100 μL de glycérol pour couvrir la goutte d’hydrogel comme support de montage.
  7. Facultatif : Montez la niche avec un couvercle. Cette étape peut être omise pour éviter de presser des organoïdes / sphéroïdes de taille considérable.
  8. Fermez fermement le couvercle de MD pour éviter le séchage jusqu’à l’examen. L’échantillon est stable pour examen pendant au moins 6 mois.

3. Immunohistochimie d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

  1. Réchauffer la solution commercialement obtenue pour l’immunohistochimie (S-IHC; voir le tableau des matériaux) à 37 °C.
  2. Incuber les organoïdes ou sphéroïdes dans l’hydrogel avec 3% de peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans 200 μL dedH2O pendant 5 min à 37 °C.
  3. Aspirer la solution de peroxyde d’hydrogène et laver endH2Opendant 5 min à 37 °C. Aspirer ledH2Oet incuber deux fois avec 100 μL de S-IHC à 37 °C pendant 10 min chacun.
  4. Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL d’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux) dilué dans du S-IHC pendant 1-2 h à 37 °C (en suivant les recommandations du fabricant concernant la dilution de travail).
  5. Aspirer la solution d’anticorps primaires et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C.
  6. Aspirer 100 μL de S-IHC et incuber avec un anticorps secondaire biotinylé (voir le tableau des matières) pendant 10 min à 37 °C.
  7. Aspirer la solution d’anticorps secondaires et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C. Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL de streptavidine marquée peroxydase de raifort (HRP) (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C.
  8. Aspirer la streptavidine marquée HRP et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C.
  9. Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL de mélange de solution chromogène DAB/AEC (voir le tableau des matières) pendant 5-10 min à 37 °C.
  10. Surveillez l’intensité de la coloration au microscope optique.
  11. Laver avecdH2O3x pendant 2 min chacun.
  12. Facultatif : Incuber avec 100 μL d’hématoxyline (voir le tableau des matières) pour la contre-coloration nucléaire pendant 5 min à 37 °C.
  13. Aspirer l’hématoxyline et laver endH2Opendant 5 min.
  14. Aspirer ledH2Oet couvrir la goutte d’hydrogel avec 100 μL de glycérol comme support de montage.
  15. Fermez fermement le couvercle du MD jusqu’à l’examen microscopique.
    NOTES: Les étapes de récupération d’antigènes et de blocage des protéines sont omises dans ce protocole puisque S-IHC élimine ces étapes.

4. Marquage par immunofluorescence d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

  1. Réchauffer les matières suivantes à 37 °C : PFA à 4 %, PBS, S-IF, solution d’anticorps primaires dans S-IF, solution d’anticorps secondaires dans S-IF, coloration nucléaire et glycérol (voir le tableau des matières).
  2. Aspirer le milieu de culture cellulaire et fixer avec 200 μL de PFA à 4% pendant 15-30 min à 37 °C. Aspirer le fixateur et laver en S-IF 3x pendant 10 min chacun à 37 °C.
  3. Ajouter dH2O sur le côté entourant la niche pour fournir de l’humidité pendant les étapes suivantes.
  4. Aspirer le S-IF entourant la goutte d’hydrogel et incuber la goutte d’hydrogel avec 100 μL de solution d’anticorps primaires (voir le tableau des matériaux) dans du S-IF pendant 30-60 minutes à 37 °C.
  5. Aspirer la solution d’anticorps primaire et laver en S-IF 3x pendant 10 min chacun à 37 °C.
  6. Aspirer le S-IF et incuber avec 100 μL de solution d’anticorps secondaires (voir Tableau des matériaux) dans S-IF pendant 30-60 min à 37 °C dans l’obscurité.
  7. Aspirer la solution d’anticorps secondaires et laver avec du PBS 3x pendant 10 min chacun à 37 °C dans l’obscurité.
  8. Aspirer le PBS et incuber avec 100 μL de coloration d’ADN nucléaire contenant un milieu de montage ou du glycérol à 37 °C dans l’obscurité.
  9. Remplissez la niche avec du glycérol pour éviter le dessèchement.
  10. Facultatif : Couvrez la niche avec un bordereau de couverture. Cette étape peut être omise pour éviter de presser les organoïdes/sphéroïdes.
  11. Fermez bien le MD. Les échantillons en DM peuvent être conservés à 4 °C dans l’obscurité pendant au moins 6 mois avec une perte minimale de fluorescence.
  12. Utilisez les paramètres suivants pour l’examen microscopique confocal : réglez la valeur du sténopé de tous les canaux sur 20,1, maintenez la constante du gain maître à 550 pour 488 nm, 485 pour 550 nm et 450 pour 594 nm, maintenez la puissance laser constante pour toutes les expériences et le pourcentage le plus bas à 2,0.
    NOTES: Anticorps primaires: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumine (1:50), Anti-Bêta-galactosidase (1:25), Anticorps antimitochondrial (1:100), Anti-Golgi Antibody (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 anticorps (1:100). Anticorps secondaires : IgG (H+L)-488 de chèvre, IgG (H+L)-550 de chèvre anti-lapin, IgG (H+L)-488 de chèvre anti-souris, IgG (H+L)-550 de chèvre, IgY(H+L)-647 de chèvre. La dilution pour tous les anticorps secondaires est de 1:100. De plus, la FITC-phalloïdine (1:100), un anticorps conjugué, est également utilisée (voir le tableau des matières).

5. Marquage de la membrane plasmique et du noyau d’organoïdes vivants et de sphéroïdes dans un hydrogel

  1. Préparer une solution d’étiquetage contenant de l’agglutinine de germe de blé fluor Alexa (5,0 μg/mL) et Hoechst (2 μM) dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), conformément aux recommandations du fabricant (voir le tableau des matériaux), et chauffer à 37 °C.
  2. Aspirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 μL de solution de marquage pour couvrir la goutte d’hydrogel. Incuber pendant 15-30 min à 37 °C.
  3. Retirer la solution d’étiquetage et laver deux fois dans du PBS 2x pendant 10 min chacun à 37 °C. Facultatif : Fixer avec 200 μL de formaldéhyde à 4 % pendant 15 min à 37 °C.
  4. Couvrir la goutte d’hydrogel avec du glycérol comme support de montage. Facultatif : Montez la niche avec un verre de couverture.
  5. Fermez hermétiquement le couvercle du MD et conservez-le au réfrigérateur dans l’obscurité jusqu’à l’examen microscopique confocale/fluorescent. Il est stable pendant au moins 6 mois.

6. Congélation et décongélation d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

  1. Congelez les organoïdes en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Réchauffer la solution de congélation obtenue commercialement (FS; voir tableau des matières) à 37 °C.
    2. Aspirez doucement le milieu de culture cellulaire entourant le dôme d’hydrogel.
    3. Ajouter délicatement 200 μL de FS. Incuber l’échantillon avec FS à 37 °C pendant 1 h.
    4. Fermez hermétiquement le couvercle de l’appareil et placez-le dans une boîte en mousse. Placez cette boîte en mousse dans une autre boîte en mousse, comme illustré à la figure supplémentaire 3. Fermez hermétiquement les deux boîtes en mousse. Deux boîtes en mousse l’une à l’intérieur de l’autre fournissent une plage de gradient de refroidissement de température de 1 à 2 ° C / min de l’échantillon dans un congélateur de -20 ° C.
    5. Placez la boîte à -20 °C pendant 2 h. Transférer la boîte dans un congélateur à -80 °C et la laisser toute la nuit.
    6. Sortez l’échantillon des boîtes. L’échantillon dans le MD peut être conservé dans le congélateur à -80 °C pendant 6 mois.
    7. Transférer le DM qui contient l’échantillon dans le réservoir d’azote liquide pour un stockage à plus long terme.
  2. Décongeler les organoïdes en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Sortez le MD contenant l’échantillon du congélateur/réservoir d’azote et placez-le directement dans un incubateur à 37 °C. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
    2. Ajouter 200 μL de milieu de culture chaud à la niche (le rapport FS/milieu de culture cellulaire est de 1:1) et incuber pendant 30 min à 37 °C.
    3. Ajouter plus de milieu de culture chaud à la niche (le rapport FS/milieu de culture cellulaire est de 1:2) et incuber pendant 30 min à 37 °C.
    4. Aspirer doucement le milieu et le mélange FS. Procéder à l’imagerie par microscopie électronique à balayage (étape 7) et par microscopie électronique à transmission (étape 8) des organoïdes/sphéroïdes montés sur l’ensemble dans l’hydrogel.

7. Microscopie électronique à balayage d’organoïdes/sphéroïdes entiers

  1. Réchauffez la solution fixatrice et post-fixative de Karnovsky (voir le tableau des matériaux) à température ambiante (RT).
  2. Aspirer le milieu de culture cellulaire entourant l’hydrogel dans le MD. Placer l’échantillon dans le MD sur de la glace dans la hotte à flux laminaire pendant 15 min.
  3. Aspirez très doucement l’hydrogel liquéfié entourant les organoïdes/sphéroïdes. Une quantité limitée de matrigel peut rester dans la niche pour éviter d’endommager et de perdre l’échantillon.
  4. Fixer avec le fixateur de Karnovsky (PFA à 2 %, 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,15 M et 2 mM de CaCl2; voir le tableau des matériaux) à TA pendant 1 h.
  5. Aspirer doucement le fixateur et laver à l’eau distillée (dH2O) 3x pendant 15 min chacun.
  6. Aspirer doucement ledH2Oet fixer avec une solution post-fixatrice (tétroxyde d’osmium aqueux à 1 % [OsO4]; voir tableau des matériaux) à TA pendant 1 h.
  7. Aspirer doucement le post-fixateur et laver à l’eau distillée (dH2O) 3x pendant 15 min chacun.
  8. Déshydrater dans une série graduée d’éthanol (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %), mélange d’éthanol/acétone (1:1; 1:2) et d’acétone absolue à TA pendant 15 minutes chacun.
  9. Sécher avec un séchoir à point critique.
  10. Enduire l’échantillon de l’appareil avec de l’or/palladium de 6 nm à l’aide d’une pulvérisation (voir le tableau des matériaux) pendant 90 s.
  11. Observer au microscope électronique à balayage avec un détecteur d’électrons secondaire intégré à la lentille à 2-3 kV en mode vide (5 x 10-6 mA). Prenez des images avec une distance de travail de 8,1 à 8,2 mm et à des grossissements de 675x, 1050x et 1570x.
    NOTES: Toutes les étapes sont effectuées dans le MD. Utilisez 200-250 μL de solution pour chaque étape.

8. Microscopie électronique à transmission d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

  1. Réchauffer le fixateur de Karnovsky à 37 °C. Aspirer le milieu de culture cellulaire entourant l’hydrogel dans le MD.
  2. Fixez l’échantillon avec le fixateur de Karnovsky à RT pendant 1 h. Laver avec dH2O 3x pendant 15 min chacun.
  3. Post-fixation avec 2% d’OsO4 aqueux et 2,5% de ferrocyanure de potassium à TA pendant 45 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.
  4. Incuber dans 0,5 % de thiocarbohydrazide (TCH; voir tableau des matières) à TA pendant 30 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.
  5. Incuber dans 2% d’OsO4 aqueux à TA pendant 30 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.
  6. Incuber dans une solution d’acétate d’uranyle à 2 % (voir tableau des matières) à TA pendant 1 h.
    REMARQUE: Dans cette étape, les sphéroïdes peuvent être maintenus à 4 ° C pendant la nuit.
  7. Incuber dans une solution d’aspartate de plomb (voir tableau des matières) à 60 °C pendant 45 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.
  8. Déshydrater dans une série graduée d’éthanol (50 %, 70 %, 90 %, 100 % [x2]) et d’acétone absolue à TA pendant 15 min chacun.
  9. Traiter avec un mélange de (1:1; 1:2) d’acétone/résine Epon et de résine Epon pure (voir tableau des matériaux) à TA pendant 2 h chacun.
  10. Polymériser la résine à 60 °C pendant une nuit (minimum 16 h). Après la polymérisation, retirer le bloc de résine du MD, comme indiqué à la figure supplémentaire 4.
  11. Fixez le bloc de résine à un plus grand avec une colle à résine. Coupez le bloc et atteignez l’emplacement des organoïdes ou des sphéroïdes.
  12. Obtenez des sections semi-minces (1 000 nm) et ultra-minces (60 nm) à l’aide d’un ultramicrotome (voir le tableau des matériaux).
  13. Placez les sections ultra-minces sur des grilles de cuivre à 100 mailles et observez-les au microscope électronique à balayage avec un détecteur STEM à une tension d’accélération de 30 kV. Capturez des images avec une distance de travail de 44 mm et des grossissements de 2580x, 5020x et 6060x.
    NOTES: Utilisez 200-250 μL de solution pour chaque étape. Les étapes 8.1 à 8.10 sont effectuées dans le DM.

Résultats

Le présent article représente un dispositif polyvalent (DM) et des méthodologies complémentaires pour la culture, la congélation, la décongélation, la coloration histologique, la coloration immunohistochimique, le marquage par immunofluorescence, l’enrobage et le traitement d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes tout en restant dans un hydrogel dans un seul environnement conçu de manière unique. La présente étude a été conçue pour préparer des sphéroïdes du cancer du foie HepG2 dans 35 gouttes d’...

Discussion

Le MD, complétant les formulations et les protocoles décrits ici, facilite la croissance 3D rapide et spontanée des organoïdes et des sphéroïdes dans un environnement plus contrôlé et poursuit l’expérience dans les mêmes conditions. Le spécimen reste dans le même environnement pendant tout le processus, et près de 100% des architectures de culture 3D restent intactes dans le conteneur. Cela améliore l’homogénéité pendant les expériences séquentielles et permet une période de culture prolongée. En...

Déclarations de divulgation

Ranan Gulhan Aktas est propriétaire de demandes de brevets MD, S-IHC, S-IF et FS. Olgu Enis Tok a participé au développement de ces produits. Olgu Enis Tok et Gamze Demirel sont membres de l’équipe de R&D de la société Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut et Ozgecan Kayalar n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions Dale Mertes de l’Université de Chicago pour la préparation des diagrammes, le Dr Mehmet Serif Aydin pour son soutien technique à l’Institut de recherche en sciences et technologies de la santé de l’Université Medipol d’Istanbul, et le Dr Rana Kazemi de l’Université Maltepe pour l’édition du manuscrit.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute Ethanol (EtOH)Merck8187602500Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
AcetoneMerck8222512500Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal AntibodyBiocare MedicalCP 028 AStore at +4 °C
Anti-albumin antibodyAbcamEPR20195Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonalAbcam134435Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5Abcam53121Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal AntibodyBiocare MedicalACI 3058 A, BStore at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC1016-500GDissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Centrifuge tubes, 15 mL Nest601051
Centrifuge tubes, 50 mL Nest602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 IncubatorPanasonicKM-CC17RU2
Copper GridsElectron Microscopy SciencesG100-CuUltra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point DryerLeicaEM CPD300For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture  Sigma AldrichAEC101Store at +4 °C
Diamond knifeDiatomeUltra 45°, 40-USUse for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biologyBiofroxx67-68-5
Disposable Plastic Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Store at +4 °C
Eosin Y Solution AlcoholicBright Slide2.BS01-105-1000
Epon resin Sigma45359-1EA-FEpoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)CelloramaCellO-FStore at +4 °C
Glass knife makerLeicaEM KMR3For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% Electron Microscopy Sciences16210Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solutionSigma Aldrich56-81-5Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647InvitrogenA32933Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35502Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84540Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35552Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84541Store at +4 °C
Hematoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 cellsATCCHB-8065Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6R&D SystemsMAB2020Store at -20 °C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R&D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acidSigma11189-100GStore at RT
Lead aspartate solutionDissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrateElectron Microscopy Sciences17900Store at RT
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal MicroscopeZeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
Nuclear-DNA stainInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stainThermoFischer Scientific62248DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%Electron Microscopy Sciences19190Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibodyR&D systemsMAB2020Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% Sigma1.04005.1000Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tabletsMP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISSZeissItem no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mLNest620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachmentZeissGeminiSEM 500We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2Electron Microscopy Sciences11655Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 °C
Specimen trimming deviceLeicaEM TRIM2For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coaterLeicaEM ACE200Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GDilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2CFor glue polymerized epon block with sample to holder epon block
UltramicrotomeLeicaEM UC7For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µLNest171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µLIsolabL-002
Universal Pipette Tips, 200 µL Nest110919HA01
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

Références

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Biologienum ro 190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.