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要約

本研究では、スフェロイドおよびオルガノイド全体を多目的デバイス内のヒドロゲルにそのまま残したまま、さまざまな顕微鏡で培養、凍結、解凍、処理、染色、標識、および検査するための方法論について説明します。

要約

細胞培養ラボで3次元成長構造であるオルガノイドとスフェロイドは、人体をよりよく模倣し、動物実験よりも優れているため、2次元培養モデルと比較して優れたモデルとしてますます認識されるようになっています。ただし、これらの研究は一般的に再現性と一貫性の問題に直面しています。異なる細胞培養容器間でのオルガノイドとスフェロイドの移動、ピペッティング、遠心分離など、長い実験プロセスでは、これらの影響を受けやすく壊れやすい3D成長構造が損傷または失われることがよくあります。最終的には、3D構造が同じ特性と品質を維持できないため、結果に大きな影響があります。ここで説明する方法は、これらのストレスの多いステップを最小限に抑え、オルガノイドとスフェロイドが多目的デバイスのヒドロゲル中に残っている間、処理シーケンス全体を通して安全で一貫した環境を保証します。研究者は、単一の多目的デバイスを使用して、共焦点顕微鏡から電子顕微鏡まで、さまざまなハイテク機器の下でオルガノイドまたはスフェロイドの構造を成長、凍結、解凍、処理、染色、ラベル付け、および検査することができます。この技術は、処理中に3D成長構造のための安定した保護環境を維持しながら、研究の再現性、信頼性、および妥当性を向上させます。さらに、ストレスの多いステップを排除することで、取り扱いエラーを最小限に抑え、所要時間を短縮し、汚染のリスクを低減します。

概要

細胞研究と治療の未来は、3D細胞培養にあります1,2,3。オルガノイドモデルとスフェロイドモデルは、人体の発達、生理学、および疾患を模倣するより良いモデルを作成することにより、in vitro実験と動物モデルの間のギャップを埋めます4,5,6,7,8,9。ただし、これらのモデルの再現性と再現性は依然として困難です。さらに、現在の技術でこれらの構造を取り扱い、収穫、移送、および遠心分離すると、多くの条件でオルガノイドとスフェロイドが失われたり損傷したりし、結果に大きな影響を与えます。

組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、および凍結保存のための多くのプロトコルにもかかわらず、実験条件の標準化、取り扱い、およびこれらの繊細な構造を紛失または損傷することなく処理することに関連する普遍的なアプローチはありません。現在のプロトコルはまた、信じられないほど長く、数日から数週間に交互に、様々な試薬10、11、12、13、14を用いた複雑な手順を含む。さらに、細胞培養容器とクライオバイアルの間で3D成長構造を採取、ピペッティング、遠心分離、および移すと、構造の位置と機械的な力が変化し、最終的にはオルガノイドとスフェロイドの分化と成熟に影響を与えます。組織トポロジー、細胞の位置、および機械的な力が細胞の分化と成熟に大きな影響を与えることが報告されています6、15、16、17。

そのため、現在の従来技術を改良して、安定した品質のオルガノイドやスフェロイドを作製することが望ましい。遠心分離および上記の他のステップをスキップし、複数のプロセスの最初から最後まで単一の安全な環境で材料を提供する方法/デバイスは、最も一貫性のある信頼性の高いデータに到達するために有益です。さらに、これにより、時間、労力、およびコストの制約が軽減されます。

ここで説明する多目的デバイス(MD)は、オルガノイドとスフェロイドの複数のプロセスに対して単一の安全な環境を提供します(補足図 1)。このデバイスと補完プロトコルにより、収穫、ピペッティング、移送、遠心分離のステップが不要になります。オルガノイドとスフェロイドは、連続プロセスの間、 in vitro 環境にとどまります。この環境は、主に、市販のヒドロゲルのような天然または合成の細胞外マトリックス成分を含む。言い換えれば、ここで説明する方法では、オルガノイド/スフェロイドのホールマウントサンプルを、ヒドロゲルドロップ中に処理、検査、および凍結することができます。

この生体適合性デバイスは、60°Cから-160°Cの温度に耐性があるため、-160°Cの液体窒素タンクでオルガノイド/ステロイドを復元したり、60°Cで電子顕微鏡用の樹脂ブロックを調製したりすることができます。 デバイスのニッチは、以前の研究に基づいて、3D成長構造のための限られたスペースを定義し、スフェロイドまたはオルガノイドの形成を刺激するように設計されています18、19、20、21、22、23。デバイスのその部分は透明で、高い光学品質を提供する特定のプラスチックが含まれています(屈折率:1.43、アッベ値:58、厚さ:7.8ミル[0.0078インチまたは198μm])。ニッチと周囲の「側面」部分の両方が自家蛍光を引き起こします。中央の透明なニッチは80 mm 2の面積を持ち、側面部分は600 mm2です。容器の深さは15 mm、厚さは1.5 mmです。これらの特長に加え、装置の大きさやデザイン性などにより、各種ハイテク顕微鏡での観察や電子顕微鏡検査用の試料作製が可能です(図2)。装置の閉鎖システムは2つの位置を提供し、1つは冷凍庫に密封され、もう1つはインキュベーター内のガスの流れを可能にする。CCK8増殖および細胞毒性アッセイは、従来の細胞培養皿と比較して細胞に対して同様の効果を示します(補足図2)。トリパンブルー排除試験は、MDでの細胞培養中に高い細胞生存率(94%)を示します(図3)。

単一の装置で1つのサンプルに対して行うことができるプロセスは、(1)培養、(2)組織学的染色、(3)免疫組織化学的および免疫蛍光標識を含む免疫染色、(4)凍結、(5)融解、(6)明視野、暗視野、蛍光、共焦点、および超解像顕微鏡などの光学顕微鏡下での検査、(7)コーティングおよび走査型電子顕微鏡下での直接検査、または(8)透過型電子顕微鏡の準備(図2)。

組織学的染色、免疫組織化学的標識、または蛍光標識オルガノイドおよびスフェロイドには異なる方法論が存在する10、11、12、13、14、24、25。ヒドロゲルからそれらを収穫することは、現在の技術の最初のそして主要なステップです。このステップの後、いくつかの方法では、ホールマウント免疫標識が可能になります。採取されたオルガノイドはパラフィンに包埋され、切片化され、他のオルガノイドの染色および免疫染色のために標識されます。ただし、セクションはサンプル全体を提示せず、構造の3Dアーキテクチャに関連する限られたデータのみを提供する場合があります。さらに、これらの3D構造の損傷と抗原性の喪失は、これらの技術のよく知られた副作用です。

この記事の顕微鏡検査のための補完的な新しいプロトコルにより、まだヒドロゲル中のマウントサンプル全体の分析が可能になります。ここで説明するプロトコルには、免疫組織化学用溶液(S-IHC)と免疫蛍光標識用溶液(S-IF)の2つの新しく開発された製剤が含まれています。これらのソリューションを使用した方法により、遠心分離、ピペッティング、繊細な構造の移送などの従来のワークフローの有害な影響がないため、研究者はより正確なデータを得ることができます。ここで説明するプロトコルはまた、採取、ブロッキング、クリアリング、および抗原賦活化のステップの必要性を排除し、手順全体を6〜8時間に短縮します。さらに、この方法論では、同じS-IFに1〜3個の抗体を同時に追加することができます。したがって、複数の標識実験の後でも同じ日に結果を得ることが可能であり、これはここで説明するプロトコルの別の利点です。従来のホールマウント免疫蛍光標識プロトコルは、通常、3日から数週間かかります10、11、12、13、14。

抗原性を低下させる別の有害なステップであるパラフィン包埋も省略されています。3D構造は、顕微鏡検査の最初から最後までin vitro環境にとどまります。3D構造は成長条件のままであるため、タンパク質の発現および局在データはin vivo条件をよりよく模倣します。この方法論は、サンプルの抗原発現に影響を与えるステップを排除するため、より正確な結果が期待されます。表1と表2は、これらの新しいプロトコルが、従来のワークフローと比較して、ステップを排除し、ラボでの時間と労力を節約し、コストと廃棄物を削減する方法を示しています。

上記の重要なステップに加えて、別の問題は、より高い細胞生存率でサンプルの3D構造を保存するための凍結保存培地および方法を提供することである26、27、28、29、30、31。凍結保存は、安定したモデルシステムを作成し、オルガノイドとスフェロイドのバイオバンキングを可能にするために不可欠です32,33。元の3D構造全体をバイオバンキングすることで、健康状態や病気の自然な状態をより忠実に再現できます。重要な考慮事項は、凍結保存とオルガノイド/スフェロイドの解凍の利便性と信頼性です。 融解後のオルガノイド回収率は、現在のほとんどの技術では非常に低く、多くの場合50%未満です。しかし、最近の研究では、生存率が改善された有望な結果が示されています26,27,28,29。Leeらは、15%DMSO 28を含むウィスコンシン大学の溶液を使用した場合、スフェロイド細胞の78%が凍結保存後に生存することを実証した。細胞生存率は、新井らの研究で83%に増加した29。ただし、3D構造は同じ特性と品質を維持できないため、凍結保存後の結果は大きく影響を受けます。さらに、無血清試薬は、製薬および診断現場での適正製造基準に必要です。 従来のワークフローでは、ウシ胎児血清(FBS)とジメチルスルホキシド(DMSO)を含む培地を緩慢凍結法に使用していましたが、どちらもハンディキャップに関連しています。FBSは動物由来の製品であり、バッチバリエーションがあります。DMSOは非常に成功した凍結保護剤ですが、特に解凍中の長期暴露は細胞毒性作用を引き起こす可能性があります30,31。

この記事では、ヒドロゲル中のオルガノイド全体またはスフェロイド全体の凍結/解凍方法についても説明します。この研究では、オルガノイドとスフェロイドを凍結するための2つの処方が使用されます:(1)従来の凍結溶液(FS)を含む10%DMSOと、(2)血清およびDMSOを含まない凍結保存培地。この凍結保存培地には、現在の処方とは異なる細胞外マトリックス成分が含まれています。細胞外マトリックスは、プロテオグリカンと繊維状タンパク質の2つの主要なクラスの高分子で構成されており、これらは細胞構成成分の物理的な足場に不可欠ですが、組織の形態形成、分化、および恒常性に必要なプロセスも開始します34,35,36,37,38,39,40.コラーゲンは引張強度を提供し、細胞接着を調節し、走化性と遊走性をサポートし、組織発達を直接します37。さらに、エラスチン繊維は、繰り返し伸張を受ける組織に反跳を与える38。第3の繊維状タンパク質であるフィブロネクチンは、間質性細胞外マトリックスの組織化を指示し、細胞接着を媒介する上で重要な役割を果たし、細胞外メカノレギュレーター39として機能する。Duらは、天然アクトミオシンモデル系41に対するニワトリコラーゲン加水分解物の凍結保護効果を実証した。彼らの結果は、コラーゲン加水分解物が氷結晶成長を阻害し、市販の凍結保護剤と同様にタンパク質の凍結変性と酸化を減らし、凍結融解サイクル後により良いゲル構造を提供できることを示唆しています。 したがって、凍結保存培地に細胞外マトリックス成分を添加すると、サンプルにとってより安全で保護的な環境が提供され、凍結融解後に生体構造が治癒するのをサポートします。

さらに、本研究では、生きたオルガノイドとスフェロイドの細胞質膜と核を、それらがまだヒドロゲル内にある間に標識するための簡単なプロトコルについて説明します。

プロトコル

1. オルガノイドとスフェロイドの培養

  1. ヒドロゲルを氷の上に一晩(冷蔵庫または冷蔵室で)置き、解凍します。
  2. 市販の多目的装置(MD; 材料表参照)を実験の1日前のインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れて加温する。
  3. 滅菌済みのワイドエンドピペットチップを4°Cの冷蔵庫に入れます。
    注意: 手順1.1〜1.3は0日目に実行され、手順1.4〜1.11は1日目に実行されます。
  4. ヒドロゲルを層流フード内の氷上に15分間置きます。
    1. オプション:メーカーの推奨に従って、ヒドロゲルを冷たい細胞培養培地で希釈します。
  5. HepG2細胞(市販の肝細胞癌細胞株; 材料の表を参照)のペレットを含むチューブを氷上に置きます。
  6. 予熱した装置のニッチ内に30〜35μLの100%ヒドロゲルをプレートして、ゲルドロップを作成します。
  7. 各ヒドロゲルドロップの上部の中央に10,000個のHepG2細胞を置き(図2)、37°Cで15分間インキュベートします。
  8. ヒドロゲルドロップを200 μLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清で覆います。
  9. MDの蓋を正しい位置に覆い、ガスの流れを可能にし、デバイスをインキュベーターに入れます。
  10. 1日おきに10%FBSを含む200 μLのDMEMを細胞に供給します。
  11. 倒立顕微鏡でスフェロイドの成長を確認します(図3)。回転楕円体形成は3日目以降 に始まります。 ビデオ1 は、ヒドロゲルドーム内のさまざまなレベルでのスフェロイドの位置を示しています。
    注:ヒドロゲルの滴の損傷を防ぐために、ヒドロゲルの周囲の液体を穏やかに吸引し、新しい液体をゆっくりと環境に加えることを強くお勧めします。

2. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドのヘマトキシリンおよびエオシン染色

  1. 固定剤(4%パラホルムアルデヒド;PFA)、PBS、およびヘマトキシリン( 材料の表を参照)を37°Cにする。
  2. ヒドロゲルドロップを囲む培地をピペットで吸引し、固定するために4%PFAを100〜200 μL加え、37°Cで15〜20分間インキュベートします。
  3. 4%PFAを吸引し、200 μLのPBSを加えて、37°Cでそれぞれ5分間3回洗浄します。 次に、PBSを吸引し、200 μLのヘマトキシリン溶液と37°Cで15〜20分間インキュベートします。
  4. ヘマトキシリンを吸引し、200 μLのdH2Oを加えて、37°Cでそれぞれ10分間3回洗浄します。 dH2Oを吸引し、200 μLのエタノールと37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  5. エタノールを吸引し、200 μLのエオシン( 材料表を参照)とともに37°Cで10分間インキュベートします。 エオシンを吸引し、200μLのdH2Oを加えて室温(RT)で5分間洗浄します。
  6. dH2Oを吸引し、100 μLのグリセロールを加えて、封入媒体としてヒドロゲルドロップを覆います。
  7. オプション:カバーガラスでニッチを取り付けます。このステップは、かなりの大きさのオルガノイド/スフェロイドを圧搾することを避けるために省略することができます。
  8. MDの蓋をしっかり閉めて、検査まで乾燥しないようにしてください。サンプルは少なくとも6ヶ月間検査のために安定しています。

3. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの免疫組織化学

  1. 市販の免疫組織化学用溶液(S-IHC; 材料の表を参照)を37°Cに温めます。
  2. ヒドロゲル中のオルガノイドまたはスフェロイドを、3%過酸化水素(H 2 O 2)中の200 μLのdH2Oと共に37°Cで5分間インキュベートします。
  3. 過酸化水素水を吸引し、dH2O中で37°Cで5分間洗浄する。 dH2Oを吸引し、100 μLのS-IHCと37°Cでそれぞれ10分間インキュベートします。
  4. S-IHCを吸引し、S-IHCで希釈した100 μLの一次抗体( 材料の表を参照)とともに37°Cで1〜2時間インキュベートします(作業希釈に関するメーカーの推奨事項に従います)。
  5. 一次抗体溶液を吸引し、100 μLのS-IHC 3xと共に37°Cでそれぞれ5分間インキュベートします。
  6. 100 μLのS-IHCを吸引し、ビオチン化二次抗体( 材料の表を参照)とともに37°Cで10分間インキュベートします。
  7. 二次抗体溶液を吸引し、100 μLのS-IHC 3xと共に37°Cでそれぞれ5分間インキュベートします。 S-IHCを吸引し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン( 材料表を参照)100 μLとともに37°Cで10分間インキュベートします。
  8. HRP標識ストレプトアビジンを吸引し、100 μLのS-IHC 3xとともに37°Cでそれぞれ5分間インキュベートします。
  9. S-IHCを吸引し、100 μLのDAB / AEC色原体溶液混合物( 材料の表を参照)で37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  10. 光学顕微鏡で染色の強度を監視します。
  11. dH 2 O 3xでそれぞれ2分間洗浄します。
  12. オプション:核対比染色のために100 μLのヘマトキシリン( 材料の表を参照)で37°Cで5分間インキュベートします。
  13. ヘマトキシリンを吸引し、dH2Oで5分間洗浄する。
  14. dH2Oを吸引し、ヒドロゲルドロップを封入剤として100μLのグリセロールで覆います。
  15. 顕微鏡検査までMDの蓋をしっかりと閉めます。
    注:S-IHCはこれらのステップを排除するため、このプロトコルでは抗原賦活化およびタンパク質ブロッキングステップは省略されています。

4. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの免疫蛍光標識

  1. 次の材料を37°Cに温めます:4%PFA、PBS、S-IF、S-IF中の一次抗体溶液、S-IF中の二次抗体溶液、核染色、およびグリセロール( 材料の表を参照)。
  2. 細胞培養培地を吸引し、200 μLの4%PFAで37°Cで15〜30分間固定します。 固定液を吸引し、S-IF 3xで37°Cでそれぞれ10分間洗浄します。
  3. ニッチを囲む側にdH2Oを追加して、次の手順で湿度を提供します。
  4. ヒドロゲルドロップの周囲のS-IFを吸引し、ヒドロゲルドロップをS-IF中の100 μLの一次抗体溶液( 材料の表を参照)とともに37°Cで30〜60分間インキュベートします。
  5. 一次抗体溶液を吸引し、S-IF3xで37°Cでそれぞれ10分間洗浄します。
  6. S-IFを吸引し、S-IF中の100 μLの二次抗体溶液( 材料の表を参照)とともに、暗所で37°Cで30〜60分間インキュベートします。
  7. 二次抗体溶液を吸引し、暗所にて37°CでPBS 3xでそれぞれ10分間洗浄する。
  8. PBSを吸引し、封入培地またはグリセロールを含む100 μLの核DNA染色剤とともに、暗所で37°Cでインキュベートします。
  9. 乾燥を避けるためにニッチをグリセロールで満たします。
  10. オプション:カバーガラスでニッチを覆います。このステップは、オルガノイド/スフェロイドの圧迫を避けるために省略することができます。
  11. MDをしっかりと閉じます。MDのサンプルは、蛍光の損失を最小限に抑えながら、暗所で4°Cで少なくとも6か月間保存できます。
  12. 共焦点顕微鏡検査には、全チャンネルのピンホール値を20.1に設定し、ゲインマスター定数を488nmで550、550nmで485、594nmで450に保ち、すべての実験でレーザー出力を一定に保ち、最低パーセンテージを2.0に設定します。
    注:一次抗体:抗Na-K ATPアーゼ(1:100)、抗アルギナーゼ(1:50)、抗アルブミン(1:50)、抗ベータガラクトシダーゼ(1:25)、抗ミトコンドリア抗体(1:100)、抗ゴルジ抗体(1:50)、抗サイトケラチン5(1:100)、Ov6抗体(1:100)。二次抗体:ヤギ抗ウサギIgG(H + L)-488、ヤギ抗ウサギIgG(H + L)-550、ヤギ抗マウスIgG(H + L)-488、ヤギ抗マウスIgG(H + L)-550、ヤギ抗ニワトリIgY(H + L)-647。すべての二次抗体の希釈率は1:100です。さらに、コンジュゲート抗体であるFITC-ファロイジン(1:100)も使用されます( 材料表を参照)。

5. ヒドロゲル中の生体オルガノイドおよびスフェロイドの原形質膜および核標識

  1. メーカーの推奨( 材料表を参照)に従って、ハンクの平衡塩溶液(HBSS)にAlexa蛍光小麦胚芽凝集素(5.0 μg/mL)とヘキスト(2 μM)を含む標識溶液を調製し、37°Cまで温めます。
  2. 細胞培養培地を吸引し、ヒドロゲルドロップを覆うために100 μLの標識溶液を加えます。37°Cで15〜30分間インキュベートします。
  3. 標識溶液を除去し、PBS 2xで37°Cでそれぞれ10分間2回洗浄します。 オプション:200 μLの4%ホルムアルデヒドで37°Cで15分間固定します。
  4. ヒドロゲルドロップを封入媒体としてグリセロールで覆います。オプション:カバーガラスでニッチを取り付けます。
  5. MDの蓋をしっかりと閉め、蛍光/共焦点顕微鏡検査まで暗所で冷蔵保管してください。少なくとも6ヶ月間安定しています。

6. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの凍結融解

  1. 以下の手順に従ってオルガノイドを凍結します。
    1. 市販の凍結液(FS; 材料表参照)を37°Cに温めます。
    2. ヒドロゲルドームを囲む細胞培養培地を穏やかに吸引する。
    3. 200 μLのFSを穏やかに加えます。サンプルをFSとともに37°Cで1時間インキュベートします。
    4. デバイスの蓋をしっかりと閉め、フォームボックスに入れます。 補足図3に示すように、このフォームボックスを別のフォームボックスに入れます。両方のフォームボックスをしっかりと閉じます。互いの内側にある2つのフォームボックスは、-20°Cの冷凍庫でサンプルの1〜2°C / minの温度冷却勾配範囲を提供します。
    5. ボックスを-20°Cで2時間置きます。箱を-80°Cの冷凍庫に移し、一晩放置します。
    6. 箱からサンプルを取り出します。MDのサンプルは、-80°Cの冷凍庫で6ヶ月間保管できます。
    7. サンプルを含むMDを液体窒素タンクに移し、長期保存します。
  2. 以下の手順に従ってオルガノイドを解凍します。
    1. サンプルを含むMDを冷凍庫/窒素タンクから取り出し、37°Cのインキュベーターに直接入れます。 37°Cで1時間インキュベートします。
    2. 200 μLの温かい培養培地をニッチ(FSと細胞培養培地の比率は1:1)に加え、37°Cで30分間インキュベートします。
    3. さらに温かい培養培地をニッチに追加し(FSと細胞培養培地の比率は1:2)、37°Cで30分間インキュベートします。
    4. 培地とFSの混合物を穏やかに吸引します。ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの走査型電子顕微鏡(ステップ7)および透過型電子顕微鏡(ステップ8)イメージングに進みます。

7. ホールマウントオルガノイド/スフェロイドの走査型電子顕微鏡

  1. カルノフスキーの固定液および固定後溶液( 材料の表を参照)を室温(RT)に温めます。
  2. ヒドロゲルを周囲の細胞培養培地をMDで吸引する。サンプルを層流フード内の氷上のMDに15分間置きます。
  3. オルガノイド/スフェロイドを囲む液化ハイドロゲルを非常に穏やかに吸引します。限られた量のマトリゲルは、サンプルの損傷や損失を避けるためにニッチにとどまることができます。
  4. カルノフスキーの固定液(2%PFA、0.15 Mカコジル酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド、および2 mM CaCl2; 材料表を参照)でRTで1時間固定します。
  5. 固定液を穏やかに吸引し、蒸留水(dH2O)でそれぞれ15分間3回洗浄します。
  6. dH2Oを穏やかに吸引し、固定後溶液(1%四酸化オスミウム水溶液[OsO4]; 材料の表を参照)でRTで1時間固定します。
  7. 固定後液を穏やかに吸引し、蒸留水(dH2O)でそれぞれ15分間3回洗浄します。
  8. エタノール(30%、50%、70%、80%、90%、96%、100%)、エタノール/アセトンの混合物(1:1、1:2)、および絶対アセトンをそれぞれRTで15分間、段階的な一連の脱水します。
  9. 臨界点乾燥機で乾かします。
  10. スパッタコーター( 材料表を参照)を使用して、デバイス内の試料を6 nmの金/パラジウムで90秒間コーティングします。
  11. 真空モード(5 x 10-6 mA)で2-3 kVのレンズ内二次電子検出器を備えた走査型電子顕微鏡下で観察します。作動距離8.1〜8.2 mm、675倍、1050倍、および1570倍の倍率で画像を撮影します。
    注:すべての手順はMDで実行されます。各ステップに200〜250μLの溶液を使用します。

8. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの透過型電子顕微鏡

  1. カルノフスキー固定液を37°Cに温めます。 ヒドロゲルを周囲の細胞培養培地をMDで吸引する。
  2. サンプルをカルノフスキーの固定剤でRTで1時間固定します。dH2O 3xでそれぞれ15分間洗浄します。
  3. 2%OsO4水溶液と2.5%フェロシアン化カリウムをRTで45分間ポストフィックスします。dH2O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
  4. 0.5%チオカルボヒドラジド(TCH; 材料の表を参照)中でRTで30分間インキュベートします。dH2O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
  5. 2%OsO4水溶液中でRTで30分間インキュベートします。dH2O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
  6. 2%酢酸ウラニル溶液( 材料の表を参照)中でRTで1時間インキュベートします。
    注:このステップでは、スフェロイドを一晩4°Cに保つことができます。
  7. アスパラギン酸鉛溶液( 材料の表を参照)中で60°Cで45分間インキュベートします。dH2O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
  8. 段階的な一連のエタノール(50%、70%、90%、100%[x2])と無水アセトンをRTでそれぞれ15分間脱水します。
  9. (1:1; 1:2)アセトン/エポン樹脂と純粋なエポン樹脂の混合物( 材料の表を参照)でそれぞれ2時間RTで処理します。.
  10. 樹脂を60°Cで一晩(最低16時間)重合します。重合後、 補足図4に示すようにMDから樹脂ブロックを取り外す。
  11. レジンブロックをレジン接着剤で大きなブロックに取り付けます。ブロックをトリミングし、オルガノイドまたはスフェロイドの位置に到達します。
  12. ウルトラミクロトームを使用して、半薄切片(1,000 nm)と極薄切片(60 nm)を取得します(材料表を参照)。
  13. 100メッシュの銅グリッド上に極薄切片を置き、加速電圧30kVでSTEM検出器を備えた走査型電子顕微鏡下で観察します。作動距離44mm、倍率2580倍、5020倍、6060倍の画像をキャプチャします。
    注:各ステップに200〜250μLの溶液を使用します。ステップ 8.1 〜 8.10 は MD で実行されます。

結果

本稿は、単一の独自に設計された環境でヒドロゲル中にオルガノイドまたはスフェロイド全体を培養、凍結、解凍、組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、コーティング、および処理するための多目的デバイス(MD)および補完的な方法論を表しています。現在の研究は、35 MDの35ヒドロゲルドロップでHepG2肝がんスフェロイドを調製するように設計されました。さらに、MDの肺オルガ?...

ディスカッション

MDは、ここで説明する製剤とプロトコルを補完し、より制御された環境でオルガノイドとスフェロイドの迅速かつ自発的な3D成長を促進し、同じ条件で実験を継続します。試験片はプロセス全体を通して同じ環境にとどまり、3D成長アーキテクチャのほぼ100%がコンテナ内にそのまま残ります。これにより、連続実験中の均質性が向上し、培養期間を延長することができます。さらに、オルガノ...

開示事項

Ranan Gulhan Aktasは、MD、S-IHC、S-IF、およびFSの特許出願を所有しています。オルグ・エニス・トックはこれらの製品の開発に携わっていました。Olgu Enis TokとGamze Demirelは、Celloramaという名前の会社のR&Dチームメンバーです。ユスフ・ムスタファ・サーチ、ゼイネップ・アクブルト、オズゲカン・カヤラルには、宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

図の作成にはシカゴ大学のデール・メルテス氏、イスタンブール・メディポール大学健康科学技術研究所での技術支援にはメフメット・セリフ・アイディン博士、原稿の編集にはマルテペ大学のラナ・カゼミ博士に感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute Ethanol (EtOH)Merck8187602500Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
AcetoneMerck8222512500Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal AntibodyBiocare MedicalCP 028 AStore at +4 °C
Anti-albumin antibodyAbcamEPR20195Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonalAbcam134435Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5Abcam53121Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal AntibodyBiocare MedicalACI 3058 A, BStore at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC1016-500GDissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Centrifuge tubes, 15 mL Nest601051
Centrifuge tubes, 50 mL Nest602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 IncubatorPanasonicKM-CC17RU2
Copper GridsElectron Microscopy SciencesG100-CuUltra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point DryerLeicaEM CPD300For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture  Sigma AldrichAEC101Store at +4 °C
Diamond knifeDiatomeUltra 45°, 40-USUse for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biologyBiofroxx67-68-5
Disposable Plastic Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Store at +4 °C
Eosin Y Solution AlcoholicBright Slide2.BS01-105-1000
Epon resin Sigma45359-1EA-FEpoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)CelloramaCellO-FStore at +4 °C
Glass knife makerLeicaEM KMR3For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% Electron Microscopy Sciences16210Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solutionSigma Aldrich56-81-5Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647InvitrogenA32933Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35502Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84540Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35552Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84541Store at +4 °C
Hematoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 cellsATCCHB-8065Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6R&D SystemsMAB2020Store at -20 °C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R&D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acidSigma11189-100GStore at RT
Lead aspartate solutionDissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrateElectron Microscopy Sciences17900Store at RT
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal MicroscopeZeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
Nuclear-DNA stainInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stainThermoFischer Scientific62248DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%Electron Microscopy Sciences19190Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibodyR&D systemsMAB2020Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% Sigma1.04005.1000Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tabletsMP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISSZeissItem no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mLNest620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachmentZeissGeminiSEM 500We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2Electron Microscopy Sciences11655Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 °C
Specimen trimming deviceLeicaEM TRIM2For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coaterLeicaEM ACE200Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GDilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2CFor glue polymerized epon block with sample to holder epon block
UltramicrotomeLeicaEM UC7For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µLNest171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µLIsolabL-002
Universal Pipette Tips, 200 µL Nest110919HA01
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

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