Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذه الدراسة هو إثبات جدوى الفصل القائم على التعويم لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية البشرية الأولية.

Abstract

تعد عملية عزل الخلايا التائية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لإنشاء مزارع خارج الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية للبحث والاختبارات السريرية والعلاجات القائمة على الخلايا. في هذه الدراسة ، يتم تقديم بروتوكول بسيط وجديد لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية من PBMCs خارج الجسم الحي . تستخدم هذه الدراسة تقنية فرز الخلايا المنشطة بالطفو الوظيفي (BACS) لعزل الخلايا التائية وتنشيطها. باختصار ، يتضمن البروتوكول الاختيار الإيجابي لخلايا CD3 + من PBMCs المشتقة من leukopak ، يليها تحفيز مشترك لمدة 48 ساعة مع فقاعات streptavidin الدقيقة (SAMBs) المترافقة مسبقا المضادة ل CD28 قبل النقل في 24 لوحة بئر. توفر الفقاعات الدقيقة الوظيفية فرصة فريدة لتنشيط الخلايا بشكل مزدهر ، مما يؤدي إلى أنماط ظاهرية تكاثرية تسمح بالتوسع بأقل قدر من الإرهاق. توفر هذه التقنية استنفادا أقل لأن الفقاعات الدقيقة المحفزة المشتركة تظل طافية وتعود إلى الجزء العلوي من وسط الاستزراع ، مما يقلل من مقدار الوقت الذي تتلامس فيه الخلايا المتوسعة مع عوامل التحفيز المشترك. تشير النتائج إلى أن الخلايا التائية المعزولة والمستزرعة تتلقى تحفيزا كافيا للتنشيط والتكاثر ولكن ليس إلى الحد الذي يؤدي إلى فرط النشاط ، مما يؤدي بعد ذلك إلى الإرهاق ، كما يتضح من وجود PD-1 المفرط.

Introduction

يتم حاليا إجراء أكثر من 500 تجربة سريرية للعلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) في جميع أنحاء العالم ، وتتوفر أربعة منتجات للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR-T) في السوق1. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من احتياجات البحث والتصنيع في الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية والتي يجب معالجتها لتحسين الفعالية وقابلية التوسع والنجاح طويل الأجل لهذه العلاجات العلاجية المحتملة2،3،4،5. يبدأ البحث السريري والتصنيع بالتبني للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية بعزل الخلايا التائية من عينة دم محيطية والتحفيز اللاحق ونقل وتوسيع الخلايا المعزولة. تتطلب المعلمات مثل استعادة الخلايا التائية والنقاء وإشارات التنشيط / الاستنفاد دراسة متأنية عند اختيار تقنيات عزل الخلايا وتحفيزها لأبحاث الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهميةوتصنيعها 3،4،6. الأهم من ذلك ، هناك حاجة إلى تحسين الثبات العلاجي لعلاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عن طريق تقليل العوائق البيولوجية الناتجة عن عمليات التصنيع الحالية ، مثل استنفاد الخلايا التائية ، لتعزيز الفعالية العلاجية 6,7.

كبديل لطرق عزل الخلايا التقليدية مثل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) ، هنا ، يتم عرض فرز الخلايا المنشط بالطفو (BACS) باستخدام الفقاعات الدقيقة لعزل الخلايا التائية. يستخدم فصل الفقاعات الدقيقة كريات مجهرية مجوفة (فقاعات دقيقة) لربط الأهداف وتعويمها على سطح عينات السوائل 8,9. من خلال تشغيل الفقاعات الدقيقة مع الأجسام المضادة (أي مضادات CD3) ، يمكن اختيار مجموعات الخلايا التائية المرغوبة بشكل إيجابي من عينات الدم المحيطية. بعد ذلك ، تم توضيح استخدام مجموعة مختلفة من الفقاعات الدقيقة التي تعمل بالأجسام المضادة (أي anti-CD28) للمشاركة في تحفيز وتنشيط الخلايا التائية المختارة إيجابيا في هذا العمل. توفر الفقاعات الدقيقة سير عمل عزل وتنشيط بسيط وقابل للضبط للغاية يولد خلايا تائية جاهزة لزراعة الخلايا العالقة والتطبيقات النهائية مثل التعديل الوراثي والتوسع. بشكل حاسم ، يعزز تنشيط الخلايا الطافية مع الفقاعات الدقيقة تحفيز الخلايا المقيدة لمنع استنفاد الخلايا التائية المفرط7.

بالنسبة لهذه الدراسة ، كان قياس التدفق الخلوي هو الأداة الأساسية المستخدمة لتحليل العزلة والتنشيط ونجاح النقل للفقاعات الدقيقة الوظيفية ، بالإضافة إلى توفير معلومات مفصلة حول المجموعات السكانية الفرعية المحددة الموجودة خلال مراحل النمو والتوسع بعد النقل. بالإضافة إلى قياس التدفق الخلوي ، تم استخدام المجهر الساطع والفلوري لتأكيد صحة الخلية ، والتشكل ، ونجاح النقل. بناء على هذه النتائج ، توفر تقنية وبروتوكول الفقاعات الدقيقة بديلا أكثر قابلية للضبط والألطف لطرق العزل والتنشيط التقليدية المستخدمة حاليا اليوم. على وجه الخصوص ، تظهر الخلايا التي يتم تنشيطها بالفقاعات الدقيقة تعبيرا أقل بشكل ملحوظ عن علامات استنفاد الخلايا التائية مقارنة بتلك التي يتم ملاحظتها عادة باستخدام الأدوات والمجموعات المتوافقة مع معايير الصناعة.

Protocol

1. عزل الخلايا التائية مع microbubbles باستخدام الاختيار الإيجابي

ملاحظة: يفصل هذا البروتوكول نهج الاختيار الإيجابي CD3 + على نطاق صغير باستخدام SAMBs.

  1. احتضان 3 × 108 PBMCs تم الحصول عليها تجاريا في 2.5 مل من عازلة الفصل مع الجسم المضاد المضاد ل CD3 (OKT3) بتركيز 25 نانوغرام من الجسم المضاد لكل 1 مليون خلية (25 نانوغرام / م). امزج بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. أضف فقاعات الستربتافيدين الدقيقة (SAMBs) بنسبة 0.5 (كمية SAMB):1 (كمية الخلية) وفقا لتركيز SAMB المبلغ عنه من قبل الشركة المصنعة.
  3. امزج باستخدام دوار تجاري من طرف إلى طرف (EOE) عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا المختارة إيجابيا في الجزء العلوي من التعليق مع SAMBs. ستكون الخلايا المتبقية غير المحددة في حبيبات الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. باستخدام ماصة زجاجية 9 ، أدخل الطرف أسفل طبقة خلية الفقاعة إلى أسفل الأنبوب ، واستنشاق حبيبات الخلية و subnatant باستخدام ماصة إلكترونية ونقلها إلى أنبوب جديد.

2. التحفيز المشترك (التنشيط) للخلايا التائية المختارة إيجابيا

  1. أعد تعليق طبقة الخلية الفقاعية المتبقية في الأنبوب الأصلي في 1 مل من وسط الخلية التائية الكامل (أو أي وسط آخر مرغوب).
  2. عد الخلايا في subnatant باستخدام الفحص المجهري brightfield باستخدام عداد الخلايا الآلي ، واطرح هذه القيمة من رقم خلية البداية لتحديد عدد الخلايا التي تم التقاطها في طبقة خلية الفقاعة.
  3. قبل هذه الخطوة ، امزج الجسم المضاد المضاد ل CD28 البيوتينيل مع SAMBs التجارية لمدة لا تقل عن 2 ساعة لإنشاء SAMBs المترافقة المضادة ل CD28. اتصل بالشركة المصنعة ل SAMBs لتحديد كمية الأجسام المضادة المضادة ل CD28 اللازمة للاقتران. أضف SAMBs المترافقة المضادة ل CD28 إلى تعليق خلية الفقاعة الناتج عن الخطوة 2.1 باستخدام نسبة 1.5 (SAMBs المضادة ل CD28):1 (الخلايا).
  4. امزج باستخدام دوران EOE لمدة 15 دقيقة ، ثم اضبط الحجم الإجمالي على 2 مليون خلية لكل مل مع وسيط خلية T كامل أو وسيط آخر مرغوب فيه وفقا لرقم الخلية الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2.2.

3. توسيع الخلايا المحفزة بشكل مشترك في وسط زراعة الخلايا

  1. قم بتوزيع 1 مل من الخلايا المنشطة من الخطوة 2.4 بتركيز 2 م / مل لكل بئر في لوحة من 24 بئرا. احتضان في حاضنة مرطبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
  2. بعد 24 ساعة، أضف 50 وحدة / مل من IL-2 و 25 نانوغرام / م من مضاد CD3 القابل للذوبان (OKT3) لتشجيع التمدد بشكل أكبر، كما تم حسابه باستخدام العدد الأولي للخلايا المطلية في اليوم 0. ضع لوحة الخلية مرة أخرى في حاضنة CO2 المرطبة ، واتركها تحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

4. اختياري: نقل الخلايا التائية المنشطة مع lentivirus

ملاحظة: النهج المستخدم هنا مقتبس من Prommersberger et al. 10.

  1. قم بإذابة الفيروس العدسي في درجة حرارة الغرفة ، واخلطه لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات.
  2. قم بإزالة منتصف ناتانت برفق ، 600 ميكرولتر من كل بئر ، دون لمس الخلايا الابنة الموجودة الآن في قاع البئر أو طبقة الفقاعة التي بقيت على سطح المحلول.
  3. أضف 5 ميكروغرام / مل من بروميد سداسي ديميثرين لكل بئر لتعزيز النقل الفيروسي. أضف جزيئات lentiviral عند تعدد العدوى (MOI) من 3 (جزيئات lentiviral لكل خلية).
  4. قم بالطرد المركزي للوحة لمدة 45 دقيقة عند 800 × جم و 32 درجة مئوية باستخدام تسارع بطيء وعدم انقطاع للتباطؤ. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في حاضنة CO2 مرطبة عند 37 درجة مئوية.
  5. بعد 4 ساعات ، أضف 600 ميكرولتر من وسط الخلايا التائية الكاملة الطازجة المتاحة تجاريا و 50 وحدة / مل من IL-2 إلى كل بئر ، وضع لوحة الخلية مرة أخرى في حاضنة CO2 المرطبة عند 37 درجة مئوية لتوسيع الخلايا التائية.

5. توسيع الخلايا التائية (مع أو بدون نقل مسبق)

  1. كل يومين ، قم بإزالة نصف الوسط من منتصف ناتانت ، واستبدله بوسط خلية تائية جديد وكامل ، وأضف IL-2 بتركيز 50 وحدة / مل.
  2. عد الخلايا التائية مرتين في الأسبوع لتقييم كثافة الخلية. عندما تتجاوز كثافة الخلية 2 × 10 6-2.5 × 106 خلايا / مل ، انقل الخلايا إلى وعاء أكبر ، وقم بتخفيفها إلى 5 × 105 خلايا / مل.

6. حصاد الخلايا التائية وقياس التدفق الخلوي

  1. امزج محتويات كل بئر برفق عن طريق سحب لأعلى ولأسفل. قم بإزالة محتويات البئر بالكامل ، بما في ذلك الفقاعات الدقيقة ، وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  2. اغسل كل بئر ب 400 ميكرولتر من DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (-/-) ، وانقل المحلول إلى أنبوب سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. نضح الطاف, وإعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من عازلة الفصل.
  4. تلطيخ بكوكتيل تنشيط واستنفاد الأجسام المضادة / تلطيخ ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تحضير كوكتيلات تلطيخ على النحو التالي- كوكتيل التنشيط: AF700-CD3 ، PE / Dazzle-CD4 ، PE / Cy7-CD8 ، BV510-CD25 ، PE-CD69 ؛ كوكتيل الإرهاق: AF700-CD3 ، PE / Dazzle-CD4 ، PE / Cy7-CD8 ، PE-PD-1.
  5. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للفصل ، واخلطه برفق. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لغسل الأجسام المضادة الزائدة. نضح الطافية تماما.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للفصل ، وانقلها إلى وعاء مناسب (على سبيل المثال ، أنبوب FACS ، لوحة 96 بئر ، إلخ) لتحليل قياس التدفق الخلوي. تم تفصيل مخطط بوابة تحليل التدفق الخلوي الموصى به في الشكل 1.

النتائج

تم عزل الخلايا التائية من PBMCs المشتراة ومطلية للتنشيط كما هو موضح في البروتوكول. لم يتم تنشيط عينات التحكم السلبية (PBMCs المشتراة). تم تضمين عينات التحكم هذه لإثبات تأثير عملية تنشيط الفقاعات الدقيقة على العينات التجريبية مقارنة بضوابط الخلايا التائية التي لم تمسها ولم يتم تحفيزها ، مما يضم...

Discussion

يسمح البروتوكول الموصوف بعزل الخلايا التائية من عينات PBMC وتنشيط الخلايا التائية العالقة في وسائط المزرعة ذات الفقاعات الدقيقة. تعتمد هذه الطريقة على الفقاعات الدقيقة الوظيفية التي يوفر طفوها المتأصل فرصة فريدة لإدخال إشارات التحفيز المشترك إلى الخلايا وتنشيطها أثناء تعليقها في وسط است...

Disclosures

جميع المؤلفين ، في وقت التقديم ، هم موظفون في Akadeum Life Sciences ، التي تصنع وتبيع منتجات فصل الفقاعات الدقيقة.

Acknowledgements

اي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well platesVWR 76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) AntibodyBiolegend302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) AntibodyBiolegend317320
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-136
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061
Human Recombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCsBioIVTHUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue cultureVWR97063-708CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection ReagentMillipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat InactivatedInnovative ResearchISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPESGibco72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)Akadeum11110-000

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved