Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

Özet

Bu çalışmanın amacı, primer insan T hücrelerini izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için yüzdürme bazlı ayırmanın fizibilitesini göstermektir.

Özet

T hücrelerini ex vivo kültürler oluşturmak için periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole etme süreci, araştırma, klinik testler ve hücre bazlı tedaviler için çok önemlidir. Bu çalışmada, PBMC'lerden T hücrelerini ex vivo olarak izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için basit, yeni bir protokol sunulmuştur. Bu çalışma, T hücrelerini izole etmek ve aktive etmek için işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) teknolojisini kullanmaktadır. Kısaca, protokol, lökopak türevi PBMC'lerden CD3 ⁺ hücrelerinin pozitif seçimini içerir, ardından 24 delikli plakalarda transdüksiyondan önce önceden konjuge anti-CD28'e bağlı streptavidin mikrokabarcıkları (SAMB'ler) ile 48 saatlik bir birlikte stimülasyon yapılır. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar, hücreleri yüzdürücü bir şekilde aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, minimum tükenme ile genişlemeye izin veren proliferatif fenotiplere yol açar. Bu teknik, yardımcı uyarıcı mikro kabarcıklar yüzer kalır ve kültür ortamının tepesine geri döner, böylece genişleyen hücrelerin birlikte uyarıcı faktörlerle temas halinde olduğu süreyi azaltır. Sonuçlar, izole edilmiş ve kültürlenmiş T hücrelerinin aktive etmek ve çoğalmak için yeterli stimülasyon aldığını, ancak aşırı PD-1'in varlığının gösterdiği gibi aşırı aktivasyona yol açacak ölçüde değil, daha sonra tükenmeye yol açtığını göstermektedir.

Giriş

Şu anda dünya çapında 500'den fazla kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi klinik çalışması yürütülmektedir ve piyasada dört CAR-T hücre tedavisi ürünü bulunmaktadır¹. Bununla birlikte, bu potansiyel olarak iyileştirici tedavilerin etkinliğini, ölçeklenebilirliğini ve uzun vadeli başarısını artırmak için ele alınması gereken çok sayıda CAR-T hücre araştırması ve üretim ihtiyacı hala mevcuttur 2,3,4,5. Evlat edinilmiş CAR-T hücresi klinik araştırması ve üretimi, periferik bir kan örneğinden T hücresi izolasyonu ve ardından izole hücrelerin uyarılması, transdüksiyonu ve genişlemesi ile başlar. T hücresi geri kazanımı, saflık ve aktivasyon / tükenme sinyalleri gibi parametreler, CAR-T hücre araştırması ve üretimi için hücre izolasyonu ve stimülasyon tekniklerini seçerken dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır ^3,4,6. Önemli olarak, terapötik etkinliği arttırmak için T hücresi tükenmesi gibi mevcut üretim süreçlerinden kaynaklanan biyolojik engelleri en aza indirgeyerek CAR-T hücre tedavilerinin terapötik kalıcılığında iyileşme gereklidir ^6,7.

Floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik aktive hücre sıralama (MACS) gibi geleneksel hücre izolasyon yöntemlerine alternatif olarak, burada, T hücresi izolasyonu için mikro kabarcıklarla yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) gösterilmektedir. Mikrokabarcık ayırma, hedefleri bağlamak ve bunları sıvı numunelerinin yüzeyine yüzdürmek için yüzdürücü, içi boş mikrosferler (mikro kabarcıklar) kullanır ^8,9. Mikrokabarcıkları antikorlarla (yani anti-CD3) işlevselleştirerek, istenen T hücresi popülasyonları periferik kan örneklerinden pozitif olarak seçilebilir. Daha sonra, süspansiyonda pozitif seçilmiş T hücrelerini birlikte uyarmak ve aktive etmek için farklı bir antikor işlevselleştirilmiş mikrokabarcık popülasyonunun (yani, anti-CD28) kullanımı bu çalışmada gösterilmiştir. Mikrokabarcıklar, askıya alınmış hücre kültürü ve genetik modifikasyon ve genişleme gibi aşağı akış uygulamaları için hazır T hücreleri üreten basit ve oldukça ayarlanabilir bir izolasyon ve aktivasyon iş akışı sunar. Kritik olarak, mikro kabarcıklarla yüzdürücü hücre aktivasyonu, aşırı T hücresi tükenmesini önlemek için kısıtlanmış hücre stimülasyonunu teşvik eder⁷.

Bu çalışma için, akış sitometrisi, işlevselleştirilmiş mikrokabarcıkların izolasyon, aktivasyon ve transdüksiyon başarısını analiz etmek ve transdüksiyon sonrası büyüme ve genişleme aşamalarında mevcut olan spesifik alt popülasyonlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak için kullanılan birincil araçtır. Akım sitometrisine ek olarak, hücre sağlığını, morfolojisini ve transdüksiyon başarısını doğrulamak için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanıldı. Bu sonuçlara dayanarak, mikrokabarcık teknolojisi ve protokolü, günümüzde kullanılmakta olan geleneksel izolasyon ve aktivasyon yöntemlerine daha ayarlanabilir ve daha yumuşak bir alternatif sunmaktadır; Özellikle, mikrokabarcıkla aktive olmuş hücreler, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunu, endüstri standardı aletler ve kitlerle tipik olarak gözlemlenenden önemli ölçüde daha düşük gösterir.

Protokol

1. Pozitif seleksiyon kullanılarak T hücrelerinin mikrokabarcıklarla izolasyonu

NOT: Bu protokol, SAMB'leri kullanan küçük ölçekli CD3⁺ pozitif seçim yaklaşımını ayrıntılarıyla açıklar.

1. Ticari olarak elde edilen 3 x 10⁸ PBMC'leri, 1 milyon hücre (25 ng / M) başına 25 ng antikor konsantrasyonunda biyotinile anti-CD3 (OKT3) antikoru ile 2.5 mL ayırma tamponunda inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
2. Streptavidin mikrokabarcıklarını (SAMB'lar) üreticinin rapor ettiği SAMB konsantrasyonuna göre 0.5 (SAMB miktarı):1 (hücre miktarı) oranında ekleyin.
3. Oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 20 rpm'de ticari bir uçtan uca (EOE) rotatör kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüj.
4. Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler SAMB'lerle süspansiyonun en üstünde olacaktır. Kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır. 9 inç cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücresi tabakasının altına tüpün altına yerleştirin, hücre peletini ve subnatantını elektronik bir pipetle aspire edin ve yeni bir tüpe aktarın.

2. Pozitif seçilmiş T hücrelerinin birlikte uyarılması (aktivasyonu)

1. Orijinal tüpte kalan kabarcık hücresi katmanını 1 mL'lik tam T hücre ortamında (veya istenen başka bir ortamda) yeniden askıya alın.
2. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak brightfield mikroskobu ile subnatanttaki hücreleri sayın ve kabarcık hücresi katmanında yakalanan hücre sayısını belirlemek için bu değeri başlangıç hücre numarasından çıkarın.
3. Bu adımdan önce, konjuge anti-CD28 SAMB'leri oluşturmak için biyotinile anti-CD28 antikoru ticari SAMB'lerle en az 2 saat karıştırın. Konjugasyon için gereken anti-CD28 antikoru miktarını belirlemek için SAMBs üreticisine başvurun. Anti-CD28 konjuge SAMB'leri, 1.5 (anti-CD28 SAMB'ler):1 (hücreler) oranını kullanarak adım 2.1'den kaynaklanan kabarcık hücresi süspansiyonuna ekleyin.
4. EOE rotasyonunu kullanarak 15 dakika boyunca karıştırın ve ardından toplam hacmi, adım 2.2'de elde edilen hücre sayısına göre tam T hücre ortamı veya istenen başka bir ortam ile mL başına 2 milyon hücreye ayarlayın.

3. Hücre kültürü ortamında birlikte uyarılan hücrelerin genişlemesi

1. Adım 2.4'ten 1 mL aktive edilmiş hücreyi, 24 delikli bir plakada kuyucuk başına 2 M / mL konsantrasyonda dağıtın. 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
2. 24 saat sonra, 0. günde kaplanan ilk hücre sayısı kullanılarak hesaplandığı gibi, genişlemeyi daha da teşvik etmek için 50 U / mL IL-2 ve 25 ng / M çözünür anti-CD3 (OKT3) ekleyin. Hücre plakasını nemlendirilmiş CO₂ inkübatörüne geri yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe etmesine izin verin.

4. İsteğe bağlı: Aktive olmuş T hücrelerinin lentivirüs ile transdüksiyonu

NOT: Burada kullanılan yaklaşım Prommersberger ve ark.'dan uyarlanmıştır. ¹⁰.

1. Lentivirüsü oda sıcaklığında çözün ve pipetleyerek, kısaca karıştırın.
2. Orta natant, 600 μL'yi, şu anda kuyunun dibinde bulunan yavru hücrelere veya çözeltinin yüzeyinde kalan kabarcık tabakasına dokunmadan her bir kuyucuktan yavaşça çıkarın.
3. Viral transdüksiyonu arttırmak için kuyu başına 5 μg / mL hekzadimetrin bromür ekleyin. Lentiviral parçacıkları 3'lük bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) ekleyin (hücre başına lentiviral parçacıklar).
4. Yavaş hızlanma ve yavaşlama için ara vermeden plakayı 800 x g ve 32 °C'de 45 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin.
5. 4 saat sonra, her bir kuyucuğa 600 μL ticari olarak temin edilebilen, taze tam T hücresi ortamı ve 50 U / mL IL-2 ekleyin ve hücre plakasını T hücresi genişlemesi için 37 ° C'de nemlendirilmiş CO₂ inkübatörüne geri yerleştirin.

5. T hücrelerinin genişlemesi (önceden transdüksiyon olsun veya olmasın)

1. Her 2 günde bir, ortamın yarısını orta natanttan çıkarın, taze, tam T hücresi ortamı ile değiştirin ve 50 U / mL'lik bir konsantrasyonda IL-2 ekleyin.
2. Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için T hücrelerini haftada iki kez sayın. Hücre yoğunluğu 2 x 10 6-2.5 x 10⁶ hücre / mL'yi aştığında, hücreleri daha büyük bir kaba aktarın ve 5 x 10⁵ hücre / mL'ye seyreltin.

6. T hücrelerinin toplanması ve akış sitometrisi

1. Her bir kuyucuğun içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Mikro kabarcıklar da dahil olmak üzere kuyunun tüm içeriğini çıkarın ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
2. Her bir oluğu 400 μL kalsiyum içermeyen ve magnezyum içermeyen DPBS (-/-) ile yıkayın ve çözeltiyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj.
3. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 50 μL ayırma tamponunda yeniden askıya alın.
4. Aktivasyon ve tükenme antikoru / boyama kokteyli ile lekeleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Boyama kokteyllerini aşağıdaki gibi hazırlayın - aktivasyon kokteyli: AF700-CD3, PE / Göz Kamaştırma-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; Tükenme kokteyli: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
5. 1 mL ayırma tamponu ekleyin ve yavaşça karıştırın. Fazla antikorları yıkamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen aspire edin.
6. Hücre peletini 1 mL ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometri analizi için uygun bir kaba (örneğin, bir FACS tüpü, 96 delikli bir plaka, vb.) aktarın. Önerilen akış sitometri analizi geçit şeması Şekil 1'de detaylandırılmıştır.

Sonuçlar

T hücreleri satın alınan PBMC'lerden izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi aktivasyon için kaplandı. Negatif kontrol örnekleri (satın alınan PBMC'ler) etkinleştirilmedi. Bu kontrol örnekleri, mikrokabarcık aktivasyon sürecinin, el değmemiş ve uyarılmamış T hücresi kontrollerine kıyasla deneysel numuneler üzerindeki etkisini göstermek için dahil edildi ve gözlemlenen aktivasyon belirteçlerinin eklenen aktivasyon faktörlerinin sonucu olmasını ve T hücrelerinin kendilerine özgü olmam...

Tartışmalar

Tanımlanan protokol, PBMC örneklerinden T hücrelerinin izolasyonuna ve mikrokabarcıklarla kültür ortamındaki askıya alınmış T hücrelerinin aktivasyonuna izin verir. Bu yöntem, doğal kaldırma kuvveti hücrelere eş-uyarıcı sinyaller vermek ve bir kültür ortamında askıya alınırken bunları aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunan işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara dayanır, böylece genişleyen hücrelerin uzun süreli stimülasyona maruz kalmasını azaltır; Bu tür aşırı uyarım, T h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000