Изоляция, активация и расширение Т-клеток на основе флотации из образцов мононуклеарных клеток периферической крови человека с использованием микропузырьков

Резюме

Целью данного исследования является демонстрация возможности разделения на основе флотации для выделения, активации и расширения первичных Т-клеток человека.

Аннотация

Процесс выделения Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) для создания культур ex vivo имеет решающее значение для исследований, клинических испытаний и клеточной терапии. В этом исследовании представлен простой, новый протокол для изоляции, активации и расширения Т-клеток из PBMCs ex vivo . В этом исследовании используется функционализированная технология сортировки клеток с активацией плавучести (BACS) для выделения и активации Т-клеток. Вкратце, протокол включает в себя положительный отбор клеток CD3⁺ из ПБМК, полученных из лейкопака, с последующей 48-часовой стимуляцией с предварительно конъюгированными анти-CD28-связанными микропузырьками стрептавидина (SAMB) до трансдукции в 24-луночных пластинах. Функционализированные микропузырьки предлагают уникальную возможность плавучей активации клеток, что приводит к пролиферативным фенотипам, которые позволяют расширяться с минимальным истощением. Этот метод обеспечивает снижение истощения, поскольку костимулирующие микропузырьки остаются плавучими и возвращаются в верхнюю часть питательной среды, тем самым уменьшая количество времени, в течение которого расширяющиеся клетки находятся в контакте с костимулирующими факторами. Результаты показывают, что изолированные и культивируемые Т-клетки получают достаточную стимуляцию для активации и пролиферации, но не до такой степени, которая приводит к гиперактивации, что затем приводит к истощению, о чем свидетельствует наличие избыточного PD-1.

Введение

В настоящее время во всем мире проводится более 500 клинических испытаний терапии рецепторами химерного антигена (CAR)-Т-клетками, и четыре продукта car-T-клеточной терапии доступны на рынке¹. Тем не менее, многочисленные потребности в исследованиях и производстве CAR-T-клеток все еще существуют, которые необходимо решить для повышения эффективности, масштабируемости и долгосрочного успеха этих потенциально лечебных методов^{лечения 2,3,4,5}. Прикладные клинические исследования и производство CAR-T-клеток начинаются с выделения Т-клеток из образца периферической крови и последующей стимуляции, трансдукции и расширения изолированных клеток. Такие параметры, как восстановление Т-клеток, чистота и сигналы активации/истощения, требуют тщательного рассмотрения при выборе методов изоляции и стимуляции клеток для исследования и производства CAR-T-клеток ^3,4,6. Важно отметить, что улучшение терапевтической стойкости CAR-T-клеточной терапии путем минимизации биологических препятствий, возникающих в результате текущих производственных процессов, таких как истощение Т-клеток, необходимо для повышения терапевтической эффективности ^6,7.

В качестве альтернативы традиционным методам изоляции клеток, таким как флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитно-активированная сортировка клеток (MACS), здесь демонстрируется сортировка клеток с активацией плавучести (BACS) с микропузырьками для изоляции Т-клеток. Разделение микропузырьков использует плавучие, полые микросферы (микропузырьки) для связывания мишеней и вывоза их на поверхность образцов жидкости ^8,9. Функционализируя микропузырьки антителами (т.е. анти-CD3), желаемые популяции Т-клеток могут быть положительно отобраны из образцов периферической крови. Впоследствии в данной работе продемонстрировано использование другой популяции микропузырьков, функционализированных антителами (т.е. анти-CD28) для совместной стимуляции и активации положительно отобранных Т-клеток в суспензии. Микропузырьки предлагают простой и настраиваемый рабочий процесс изоляции и активации, который генерирует Т-клетки, готовые к взвешенной клеточной культуре и последующим приложениям, таким как генетическая модификация и расширение. Критически важно, что активация плавучих клеток микропузырьками способствует сдержанной стимуляции клеток для предотвращения чрезмерного истощения Т-клеток⁷.

Для этого исследования проточная цитометрия была основным инструментом, используемым для анализа успеха выделения, активации и трансдукции функционализированных микропузырьков, а также для предоставления подробной информации о конкретных субпопуляциях, присутствующих во время фаз роста и расширения после трансдукции. В дополнение к проточной цитометрии, для подтверждения здоровья клеток, морфологии и успеха трансдукции использовалась ярко-полевая и флуоресцентная микроскопия. Основываясь на этих результатах, технология и протокол microbubble обеспечивают более настраиваемую и более мягкую альтернативу традиционным методам изоляции и активации, используемым в настоящее время; в частности, клетки, активированные микропузырем, демонстрируют заметно более низкую экспрессию маркеров истощения Т-клеток, чем та, которая обычно наблюдается с помощью стандартных инструментов и наборов.

протокол

1. Выделение Т-клеток с микропузырьками с помощью положительного отбора

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол детализирует мелкомасштабный подход к положительному выбору CD3⁺ с использованием SAMB.

1. Инкубировать 3 х 10⁸ коммерчески полученных ПБМК в 2,5 мл разделительного буфера с биотинилированным анти-CD3 (OKT3) антителом в концентрации 25 нг антитела на 1 млн клеток (25 нг/М). Аккуратно перемешать, пипеткой вверх и вниз, и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
2. Добавьте микропузырьки стрептавидина (SAMB) в соотношении 0,5 (количество SAMB):1 (количество ячейки) в соответствии с заявленной производителем концентрацией SAMB.
3. Смешайте с помощью коммерческого торцевого ротатора (EOE) при 20 об/мин в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре.
4. После центрифугирования положительно выбранные ячейки будут находиться в верхней части суспензии с SAMB. Остальные невыбранные ячейки будут находиться в ячейке гранулы в нижней части трубки. Используя стеклянную пипетку 9 дюймов, вставьте наконечник под слой пузырьковой ячейки на дно трубки, аспирируйте гранулу ячейки и субнатант электронной пипеткой и перенесите их в новую трубку.

2. Стимуляция (активация) положительно выбранных Т-клеток

1. Повторно суспендировать слой пузырьковых клеток, оставшийся в исходной трубке, в 1 мл полной Т-клеточной среды (или другой желаемой среды).
2. Подсчитайте ячейки в субнатанте с помощью микроскопии яркого поля с помощью автоматизированного счетчика клеток и вычтите это значение из начального номера ячейки, чтобы определить количество клеток, захваченных в слое пузырьковых клеток.
3. До этого этапа смешайте биотинилированное антитело против CD28 с коммерческими SAMB в течение как минимум 2 ч для создания конъюгированных анти-CD28 SAMB. Свяжитесь с производителем SAMBs для определения количества антител против CD28, необходимых для конъюгации. Добавьте конъюгированные SAMB против CD28 в суспензию пузырьковых клеток, полученную в результате шага 2.1, используя соотношение 1,5 (анти-CD28 SAMBs):1 (клетки).
4. Смешайте с использованием вращения EOE в течение 15 мин, а затем отрегулируйте общий объем до 2 миллионов клеток на мл с полной Т-клеточной средой или другой желаемой средой в соответствии с номером ячейки, полученным на стадии 2.2.

3. Расширение костимулированных клеток в клеточной культуральной среде

1. Распределите 1 мл активированных клеток со стадии 2,4 в концентрации 2 М/мл на скважину в 24-луночной пластине. Инкубировать в увлажненном 5% CO₂ инкубаторе при 37 °C.
2. Через 24 ч добавляют 50 ЕД/мл IL-2 и 25 нг/М растворимого анти-CD3 (OKT3) для дальнейшего стимулирования расширения, рассчитанного с использованием начального числа клеток, покрытых на 0-й день. Поместите клеточную пластину обратно в увлажненный инкубатор CO₂ и дайте ей инкубироваться в течение ночи при 37 °C.

4. Необязательно: Трансдукция активированных Т-клеток лентивирусом

ПРИМЕЧАНИЕ: Подход, используемый здесь, адаптирован из Prommersberger et al. ^{10 см}.

1. Оттаивают лентивирус при комнатной температуре и кратковременно перемешивают путем пипетки.
2. Осторожно извлеките средний натант, по 600 мкл из каждой лунки, не касаясь дочерних клеток, которые сейчас находятся на дне лунки, или пузырькового слоя, который остался на поверхности раствора.
3. Добавьте 5 мкг/мл гексадиметрина бромида на лунку для усиления вирусной трансдукции. Добавьте лентивирусные частицы при множественности инфекции (MOI) 3 (лентивирусные частицы на клетку).
4. Центрифугируйте пластину в течение 45 мин при 800 x g и 32 °C, используя медленное ускорение и без перерыва для замедления. Инкубируют клетки в течение 4 ч в увлажненном инкубаторе_CO2 при 37 °C.
5. Через 4 ч добавляют 600 мкл коммерчески доступной, свежей полной Т-клеточной среды и 50 ЕД/мл IL-2 в каждую лунку и помещают клеточную пластину обратно в увлажненный инкубатор_CO2 при 37 °C для расширения Т-клеток.

5. Расширение Т-клеток (с предварительной трансдукцией или без нее)

1. Каждые 2 дня удаляют половину среды из среднего натана, заменяют ее свежей, полной Т-клеточной средой и добавляют IL-2 в концентрации 50 Ед/мл.
2. Подсчитывайте Т-клетки два раза в неделю, чтобы оценить плотность клеток. Когда плотность клеток превысит 2 х 10 6-2,5 х 10⁶ клеток/мл, переместите клетки в более крупный сосуд, разбавив их до 5 х 10⁵ клеток/мл.

6. Сбор Т-клеток и проточная цитометрия

1. Аккуратно перемешайте содержимое каждой лунки, пипетируя вверх и вниз. Удалите все содержимое лунки, включая микропузырьки, и переложите их в пробирку объемом 1,5 мл.
2. Промыть каждую лунку 400 мкл DPBS без кальция и магния (−/−) и переложить раствор в пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 50 мкл разделительного буфера.
4. Окрашивание с активацией и истощением антителом/окрашивающим коктейлем и инкубация в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. Приготовьте окрашивающие коктейли следующим образом: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; коктейль истощения: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
5. Добавьте 1 мл разделительного буфера и аккуратно перемешайте. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для вымывания избытка антител. Аспирировать супернатанта полностью.
6. Повторно суспендировать ячейку гранулы в 1 мл разделительного буфера и перенести в соответствующий сосуд (например, трубку FACS, пластину с 96 лунками и т.д.) для анализа проточной цитометрии. Рекомендуемая схема анализа проточной цитометрии приведена на рисунке 1.

Результаты

Т-клетки были выделены из купленных NBMC и покрыты для активации, как описано в протоколе. Отрицательные контрольные образцы (приобретенные МПК) не активировались. Эти контрольные образцы были включены, чтобы продемонстрировать эффект, который процесс активации микропузырька оказал на ?...

Обсуждение

Описанный протокол позволяет выделять Т-клетки из образцов PBMC и активировать взвешенные Т-клетки в культуральных средах с микропузырьками. Этот метод опирается на функционализированные микропузырьки, присущая им плавучесть, дает уникальную возможность вводить в клетки костимулирую?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000