Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью данного исследования является демонстрация возможности разделения на основе флотации для выделения, активации и расширения первичных Т-клеток человека.

Аннотация

Процесс выделения Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) для создания культур ex vivo имеет решающее значение для исследований, клинических испытаний и клеточной терапии. В этом исследовании представлен простой, новый протокол для изоляции, активации и расширения Т-клеток из PBMCs ex vivo . В этом исследовании используется функционализированная технология сортировки клеток с активацией плавучести (BACS) для выделения и активации Т-клеток. Вкратце, протокол включает в себя положительный отбор клеток CD3+ из ПБМК, полученных из лейкопака, с последующей 48-часовой стимуляцией с предварительно конъюгированными анти-CD28-связанными микропузырьками стрептавидина (SAMB) до трансдукции в 24-луночных пластинах. Функционализированные микропузырьки предлагают уникальную возможность плавучей активации клеток, что приводит к пролиферативным фенотипам, которые позволяют расширяться с минимальным истощением. Этот метод обеспечивает снижение истощения, поскольку костимулирующие микропузырьки остаются плавучими и возвращаются в верхнюю часть питательной среды, тем самым уменьшая количество времени, в течение которого расширяющиеся клетки находятся в контакте с костимулирующими факторами. Результаты показывают, что изолированные и культивируемые Т-клетки получают достаточную стимуляцию для активации и пролиферации, но не до такой степени, которая приводит к гиперактивации, что затем приводит к истощению, о чем свидетельствует наличие избыточного PD-1.

Введение

В настоящее время во всем мире проводится более 500 клинических испытаний терапии рецепторами химерного антигена (CAR)-Т-клетками, и четыре продукта car-T-клеточной терапии доступны на рынке1. Тем не менее, многочисленные потребности в исследованиях и производстве CAR-T-клеток все еще существуют, которые необходимо решить для повышения эффективности, масштабируемости и долгосрочного успеха этих потенциально лечебных методовлечения 2,3,4,5. Прикладные клинические исследования и производство CAR-T-клеток начинаются с вы....

протокол

1. Выделение Т-клеток с микропузырьками с помощью положительного отбора

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол детализирует мелкомасштабный подход к положительному выбору CD3+ с использованием SAMB.

  1. Инкубировать 3 х 108 коммерчески полученных ПБМК в 2,5 мл разделительного буфера с биотинилированным анти-CD3 (OKT3) антителом в концентрации 25 нг антитела на 1 млн клеток (25 нг/М). Аккуратно перемешать, пипеткой вверх и вниз, и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
  2. Добавьте микропузырьки стрептавидина (SAMB) в соотношении 0,5 (количество SAMB):1 (количество ячейки) в соответстви....

Результаты

Т-клетки были выделены из купленных NBMC и покрыты для активации, как описано в протоколе. Отрицательные контрольные образцы (приобретенные МПК) не активировались. Эти контрольные образцы были включены, чтобы продемонстрировать эффект, который процесс активации микропузырька оказал на ?.......

Обсуждение

Описанный протокол позволяет выделять Т-клетки из образцов PBMC и активировать взвешенные Т-клетки в культуральных средах с микропузырьками. Этот метод опирается на функционализированные микропузырьки, присущая им плавучесть, дает уникальную возможность вводить в клетки костимулирую?.......

Раскрытие информации

Все авторы, на момент подачи заявки, являются сотрудниками Akadeum Life Sciences, которая производит и продает продукты для разделения микропузырьков.

Благодарности

Никакой.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well platesVWR 76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) AntibodyBiolegend302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) AntibodyBiolegend317320
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-136
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061
Human Recombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCsBioIVTHUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue cultureVWR97063-708CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection ReagentMillipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat InactivatedInnovative ResearchISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPESGibco72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)Akadeum11110-000

Ссылки

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены