Flotationsbasierte T-Zell-Isolierung, -Aktivierung und -Expansion aus mononukleären Blutproben des menschlichen peripheren Blutes unter Verwendung von Mikrobläschen

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie ist es, die Machbarkeit einer flotationsbasierten Trennung zur Isolierung, Aktivierung und Erweiterung primärer humaner T-Zellen zu demonstrieren.

Zusammenfassung

Der Prozess der Isolierung von T-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zur Etablierung von Ex-vivo-Kulturen ist für Forschung, klinische Tests und zellbasierte Therapien von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie wird ein einfaches, neuartiges Protokoll zur Isolierung, Aktivierung und Expansion von T-Zellen aus PBMCs ex vivo vorgestellt. Diese Studie verwendet die funktionalisierte Auftriebs-aktivierte Zellsortierung (BACS) -Technologie, um T-Zellen zu isolieren und zu aktivieren. Kurz gesagt, beinhaltet das Protokoll die positive Selektion von CD3 ⁺ -Zellen aus Leukopak-abgeleiteten PBMCs, gefolgt von einer 48-stündigen Kostimulation mit präkonjugierten Anti-CD28-gebundenen Streptavidin-Mikrobläschen (SAMBs) vor der Transduktion in 24-Well-Platten. Funktionalisierte Mikrobläschen bieten eine einzigartige Möglichkeit, Zellen schwimmfähig zu aktivieren, was zu proliferativen Phänotypen führt, die eine Expansion mit minimaler Erschöpfung ermöglichen. Diese Technik bietet eine reduzierte Erschöpfung, da die co-stimulatorischen Mikrobläschen schwimmfähig bleiben und an die Spitze des Kulturmediums zurückkehren, wodurch die Zeit, in der die expandierenden Zellen mit den kostimulierenden Faktoren in Kontakt sind, verkürzt wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die isolierten und kultivierten T-Zellen genügend Stimulation erhalten, um sich zu aktivieren und zu vermehren, aber nicht in einem Ausmaß, das zu einer Überaktivierung führt, die dann zu Erschöpfung führt, wie das Vorhandensein von übermäßigem PD-1 zeigt.

Einleitung

Weltweit werden derzeit mehr als 500 klinische Studien zur chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zelltherapie durchgeführt, und vier CAR-T-Zelltherapieprodukte sind auf dem Markt erhältlich¹. Es bestehen jedoch noch zahlreiche Forschungs- und Herstellungsbedürfnisse für CAR-T-Zellen, die angegangen werden müssen, um die Wirksamkeit, Skalierbarkeit und den langfristigen Erfolg dieser potenziell kurativen Therapien zu verbessern 2,3,4,5. Die klinische Forschung und Herstellung von adoptiven CAR-T-Zellen beginnt mit der Isolierung von T-Zellen aus einer peripheren Blutprobe und der anschließenden Stimulation, Transduktion und Expansion der isolierten Zellen. Parameter wie T-Zell-Regeneration, Reinheit und Aktivierungs-/Erschöpfungssignale erfordern eine sorgfältige Berücksichtigung bei der Auswahl der Zellisolierungs- und Stimulationstechniken für die CAR-T-Zellforschung und -herstellung ^3,4,6. Wichtig ist, dass die Verbesserung der therapeutischen Persistenz von CAR-T-Zelltherapien durch Minimierung der biologischen Hindernisse, die sich aus den aktuellen Herstellungsprozessen ergeben, wie z.B. die T-Zell-Erschöpfung, erforderlich ist, um die therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen ^6,7.

Als Alternative zu herkömmlichen Zellisolierungsmethoden wie Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MACS) wird hier die Auftriebs-aktivierte Zellsortierung (BACS) mit Mikrobläschen zur T-Zell-Isolierung demonstriert. Die Mikroblasentrennung verwendet schwimmfähige, hohle Mikrokugeln (Mikrobläschen), um die Ziele zu binden und sie an die Oberfläche von Flüssigkeitsproben zu treiben ^8,9. Durch die Funktionalisierung von Mikrobläschen mit Antikörpern (d.h. Anti-CD3) können die gewünschten T-Zellpopulationen positiv aus peripheren Blutproben selektiert werden. Anschließend wird in dieser Arbeit die Verwendung einer anderen Population von Antikörper-funktionalisierten Mikrobläschen (d.h. Anti-CD28) zur Co-Stimulation und Aktivierung positiv ausgewählter T-Zellen in Suspension demonstriert. Mikrobläschen bieten einen einfachen und hochgradig abstimmbaren Isolations- und Aktivierungs-Workflow, der T-Zellen erzeugt, die für suspendierte Zellkulturen und nachgelagerte Anwendungen wie genetische Modifikation und Expansion bereit sind. Entscheidend ist, dass die Aktivierung von Auftriebszellen mit Mikrobläschen eine gehemmte Zellstimulation fördert, um eine übermäßige Erschöpfung der T-Zellen zu verhindern⁷.

Für diese Studie war die Durchflusszytometrie das primäre Werkzeug, um den Isolierungs-, Aktivierungs- und Transduktionserfolg der funktionalisierten Mikrobläschen zu analysieren und detaillierte Informationen über die spezifischen Subpopulationen zu liefern, die während der Wachstums- und Expansionsphasen nach der Transduktion vorhanden waren. Neben der Durchflusszytometrie wurden Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um die Zellgesundheit, Morphologie und den Transduktionserfolg zu bestätigen. Basierend auf diesen Ergebnissen bieten die Mikroblasentechnologie und das Mikroblasenprotokoll eine abstimmbarere und schonendere Alternative zu den derzeit verwendeten traditionellen Isolations- und Aktivierungsmethoden. Insbesondere zeigen mikroblasenaktivierte Zellen eine deutlich geringere Expression von T-Zell-Erschöpfungsmarkern als die, die typischerweise mit branchenüblichen Werkzeugen und Kits beobachtet wird.

Protokoll

1. Isolierung von T-Zellen mit Mikrobläschen mittels positiver Selektion

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt einen kleinen CD3⁺ -positiven Selektionsansatz unter Verwendung von SAMBs.

1. Inkubieren Sie 3 x 10⁸ kommerziell erhältliche PBMCs in 2,5 ml Trennpuffer mit biotinyliertem Anti-CD3 (OKT3) Antikörper in einer Konzentration von 25 ng Antikörper pro 1 Million Zellen (25 ng / M). Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
2. Fügen Sie Streptavidin-Mikrobläschen (SAMBs) in einem Verhältnis von 0,5 (SAMB-Menge): 1 (Zellmenge) entsprechend der vom Hersteller angegebenen SAMB-Konzentration hinzu.
3. Mischen Sie mit einem handelsüblichen End-over-End-Rotator (EOE) bei 20 U/min für 10-15 min bei Raumtemperatur. Zentrifuge für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur.
4. Nach der Zentrifugation befinden sich die positiv selektierten Zellen an der Spitze der Suspension mit den SAMBs. Die verbleibenden nicht selektierten Zellen befinden sich im Zellpellet am Boden des Röhrchens. Führen Sie mit einer 9-Zoll-Glaspipette die Spitze unterhalb der Blasenzellschicht auf den Boden des Röhrchens ein, saugen Sie das Zellpellet und den Unterstand mit einer elektronischen Pipette ab und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.

2. Co-Stimulation (Aktivierung) der positiv selektierten T-Zellen

1. Resuspendieren Sie die im ursprünglichen Röhrchen verbleibende Blasenzellschicht in 1 ml vollständigem T-Zell-Medium (oder einem anderen gewünschten Medium).
2. Zählen Sie die Zellen im Subnatanten mit Hellfeldmikroskopie unter Verwendung eines automatisierten Zellzählers und subtrahieren Sie diesen Wert von der Startzellnummer, um die Anzahl der in der Blasenzellschicht erfassten Zellen zu bestimmen.
3. Mischen Sie vor diesem Schritt den biotinylierten Anti-CD28-Antikörper mindestens 2 h lang mit handelsüblichen SAMBs, um die konjugierten Anti-CD28-SAMBs zu erzeugen. Wenden Sie sich an den SAMBs-Hersteller, um die Menge an Anti-CD28-Antikörpern zu bestimmen, die für die Konjugation benötigt werden. Fügen Sie die anti-CD28-konjugierten SAMBs zu der Blasenzellensuspension hinzu, die sich aus Schritt 2.1 ergibt, wobei ein Verhältnis von 1,5 (Anti-CD28-SAMBs):1 (Zellen) verwendet wird.
4. Mischen Sie mit EOE-Rotation für 15 min und stellen Sie dann das Gesamtvolumen auf 2 Millionen Zellen pro ml mit vollständigem T-Zellmedium oder einem anderen gewünschten Medium entsprechend der in Schritt 2.2 erhaltenen Zellzahl ein.

3. Expansion der co-stimulierten Zellen im Zellkulturmedium

1. Verteilen Sie 1 ml aktivierter Zellen aus Schritt 2.4 mit einer Konzentration von 2 M/ml pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie in einem befeuchteten 5% CO₂ -Inkubator bei 37 °C.
2. Nach 24 h werden 50 E/ml IL-2 und 25 ng/M lösliches Anti-CD3 (OKT3) hinzugefügt, um die Expansion weiter zu fördern, wie anhand der anfänglichen Anzahl der am Tag 0 plattierten Zellen berechnet. Die Zellplatte wieder in den befeuchteten_{CO2-Inkubator} geben und über Nacht bei 37 °C inkubieren lassen.

4. Optional: Transduktion aktivierter T-Zellen mit Lentivirus

HINWEIS: Der hier verwendete Ansatz wurde von Prommersberger et al. übernommen. ¹⁰.

1. Das Lentivirus bei Raumtemperatur auftauen und durch Pipettieren kurz mischen.
2. Entfernen Sie vorsichtig den mittleren Natanten, 600 μL, aus jeder Vertiefung, ohne die Tochterzellen zu berühren, die sich jetzt am Boden der Vertiefung befinden, oder die Blasenschicht, die an der Oberfläche der Lösung verblieben ist.
3. Fügen Sie 5 μg / ml Hexadimethrinbromid pro Vertiefung hinzu, um die Virustransduktion zu verbessern. Fügen Sie die lentiviralen Partikel bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 3 (lentivirale Partikel pro Zelle) hinzu.
4. Die Platte wird 45 Minuten lang bei 800 x g und 32 °C mit langsamer Beschleunigung und ohne Verzögerungspause zentrifugiert. Die Zellen 4 h lang in einem befeuchteten_{CO2-Inkubator} bei 37 °C inkubieren.
5. Nach 4 h werden 600 μL handelsübliches, frisches komplettes T-Zellmedium und 50 U/mL IL-2 in jede Vertiefung gegeben und die Zellplatte bei 37 °C zur T-Zellexpansion wieder in den befeuchteten CO2-Inkubator gegeben.

5. Expansion der T-Zellen (mit oder ohne vorherige Transduktion)

1. Entfernen Sie alle 2 Tage die Hälfte des Mediums aus der mittleren Natante, ersetzen Sie es durch frisches, vollständiges T-Zellmedium und fügen Sie IL-2 in einer Konzentration von 50 U / ml hinzu.
2. Zählen Sie die T-Zellen zweimal pro Woche, um die Zelldichte zu beurteilen. Wenn die Zelldichte 2 x 10 6-2,5 x 10⁶ Zellen / ml überschreitet, geben Sie die Zellen in ein größeres Gefäß und verdünnen Sie sie auf 5 x 10⁵ Zellen / ml.

6. Entnahme der T-Zellen und Durchflusszytometrie

1. Mischen Sie vorsichtig den Inhalt jeder Vertiefung, indem Sie auf und ab pipettieren. Entfernen Sie den gesamten Inhalt der Vertiefung, einschließlich der Mikrobläschen, und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
2. Jede Welle wird mit 400 μl kalziumfreiem und magnesiumfreiem DPBS (−/−) gewaschen und die Lösung in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 μL Trennpuffer.
4. Färben Sie mit einem Aktivierungs- und Erschöpfungsantikörper/Färbecocktail ein und inkubieren Sie ihn 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Bereiten Sie die Färbecocktails wie folgt vor: Aktivierungscocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; Erschöpfungscocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
5. Fügen Sie 1 ml Trennpuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um überschüssige Antikörper auszuwaschen. Saugen Sie den Überstand vollständig ab.
6. Das Zellpellet wird in 1 ml Trennpuffer resuspendiert und in ein geeignetes Gefäß (z. B. ein FACS-Röhrchen, eine 96-Well-Platte usw.) für die Durchflusszytometrie-Analyse überführt. Das empfohlene Schema für die Durchflusszytometrie-Analyse ist in Abbildung 1 dargestellt.

Ergebnisse

T-Zellen wurden aus gekauften PBMCs isoliert und zur Aktivierung plattiert, wie im Protokoll beschrieben. Die Negativkontrollproben (gekaufte PBMCs) wurden nicht aktiviert. Diese Kontrollproben wurden eingeschlossen, um die Wirkung zu demonstrieren, die der Mikroblasenaktivierungsprozess auf die experimentellen Proben im Vergleich zu den unberührten und nicht stimulierten T-Zell-Kontrollen hatte, um sicherzustellen, dass die beobachteten Aktivierungsmarker das Ergebnis der hinzugefügten Aktivierungsfaktoren waren und n...

Diskussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung von T-Zellen aus PBMC-Proben und die Aktivierung suspendierter T-Zellen in Kulturmedien mit Mikrobläschen. Diese Methode beruht auf funktionalisierten Mikrobläschen, deren inhärenter Auftrieb eine einzigartige Gelegenheit bietet, ko-stimulatorische Signale in Zellen einzuführen und sie zu aktivieren, während sie in einem Kulturmedium suspendiert sind, wodurch die Exposition der expandierenden Zellen gegenüber längerer Stimulation reduziert wird. Eine solche Üb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000