Method Article
يوفر البروتوكول الحالي إجراء خطوة بخطوة لتوليد وصيانة وتشيخ الكائنات العضوية الدماغية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs). تتيح هذه الطريقة زراعة ونضج العضويات الدماغية لفترات طويلة ، مما يسهل نمذجة العمليات التي تنطوي عليها شيخوخة الدماغ والتسبب في الأمراض المرتبطة بالعمر.
لا تلخص النماذج الحيوانية والخلوية المتاحة حاليا بشكل كامل تعقيد التغييرات التي تحدث في الدماغ البشري المسن. إن التطور الأخير للإجراءات التي تصف توليد العضويات الدماغية البشرية ، المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) ، لديه القدرة على تحويل القدرة بشكل أساسي على نمذجة وفهم شيخوخة الدماغ البشري والعمليات المسببة للأمراض ذات الصلة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول محسن لتوليد وصيانة وتشيخ وتوصيف الكائنات العضوية الدماغية البشرية المشتقة من iPSC. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول لتوليد عضويات الدماغ بطريقة قابلة للتكرار ويعمل كدليل خطوة بخطوة ، ويتضمن أحدث التقنيات التي تؤدي إلى تحسين النضج العضوي والشيخوخة في الثقافة. تتم معالجة القضايا المحددة المتعلقة بالنضج العضوي ، والنخر ، والتباين ، وتأثيرات الدفعات. مجتمعة ، ستسمح هذه التطورات التكنولوجية بنمذجة شيخوخة الدماغ في المواد العضوية المستمدة من مجموعة متنوعة من المتبرعين البشريين الشباب والمسنين ، وكذلك الأفراد المصابين باضطرابات الدماغ المرتبطة بالعمر ، مما يسمح بتحديد الآليات الفسيولوجية والمسببة للأمراض لشيخوخة الدماغ البشري.
أصبحت نماذج أمراض الشيخوخة ذات أهمية متزايدة مع استمرار ارتفاع متوسط العمر المتوقع للإنسان. كشفت الدراسات الجينومية واسعة النطاق عن السكان المسنين الذين يعانون من عدم تنظيم العمليات الجزيئية والتغيرات الجينية التي تؤثر على نوعية الحياة1. تتميز عملية الشيخوخة بفقدان عام لوظائف الكائن الحي ، بما في ذلك فقدان الوظيفة الإدراكية ، وزيادة خطر الإصابة بالاضطرابات التنكسية العصبية ، ومجموعة من الأمراض المزمنة2.
لا تمثل تقنيات زراعة الخلايا الحالية بشكل مناسب الطبيعة متعددة العوامل للشيخوخة ، حيث لا يمكن تكرار هذه الاختلالات بشكل صحيح باستخدام الطفرات أو السموم أو العدوى3. غالبا ما ترتبط النماذج الحيوانية التي تستكشف عملية الشيخوخة بأوقات تجريبية طويلة وتكاليف عالية ، ولكنها تجلب أيضا اعتبارات أخلاقية معها. يمكن أن يؤدي استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من المرضى إلى توضيح الآليات الجزيئية التي تكمن وراء تطور المرض حيث تسمح iPSCs بالتطور الطبيعي للخلايا إلى أنسجة ناضجة3. أصبحت iPSCs الحصان العامل للعديد من المختبرات التي تحقق في الاضطرابات التنكسية العصبية ، حيث لا يبدو أن إعادة البرمجة الخلوية للخلايا المحصودة تمحو المرض أو بصمات الشيخوخة للمتبرعين4. تلخص هذه البصمات الأنماط الظاهرية الخلوية التي تم إثباتها في النماذج البشرية والحيوانية ، مما يجعل iPSCs مناسبة لفحص التدهور الخلوي الفردي لأنسجة المخ عالية الكثافة 5,6. أصبحت المواد العضوية المشتقة من IPSC النموذج البارز لزراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، مما يتيح تفاعلات أكثر تعقيدا من خلية إلى أخرى وتحسين التلخيص التنموي. على الرغم من استخدامها في المقام الأول للبيانات التنموية ، فقد تم تطبيق المواد العضوية بشكل متزايد نحو نمذجة الأمراض ، وتحديدا نماذج الالتهاب والتنكس العصبي والشيخوخة7. بناء على دراسات iPSC السابقة ، تحتفظ الكائنات العضوية بالأنماط الظاهرية للمرض والأنماط الظاهرية الخلوية في السياق الفسيولوجي لاتصالات الشبكة الشبيهة بالأنسجة 8,9. ومع ذلك ، فإن زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد ذات الأبعاد المعينة يمكن أن يكون أمرا صعبا ، خاصة لفترات طويلة من الزمن.
يقدم هذا العمل طريقة مفصلة للتوليد القابل للتكرار من العضويات الدماغية التي تسمح للأنسجة بالنضوج بشكل كبير في الحجم لفترات أطول. ظل إنشاء الأعضاء الدماغية موحدا نسبيا ، حيث اعتمد طرقا من عدة بروتوكولات بارزة10,11. ومع ذلك ، تم اقتراح العديد من التعديلات لتحسين التمايز والصيانة. تشمل هذه الطرق البديلة استخدام العوامل العصبية لتعزيز التمايز العصبي12 ، وسقالات إضافية لتحسين تبادل المغذيات لتعزيز طول العمر الخلوي 13 ، وإثارة الإجهاد المنخفض للثقافة والنمو لفترات طويلة14. تم دمج هذه التحسينات في هذه الطريقة لتطوير عضويات ناضجة قادرة على التعبير عن الأنماط الظاهرية التنكسية العصبية والشيخوخة.
تمت الموافقة على دراسات المرضى من قبل مجلس المراجعة المؤسسية. وقع جميع المشاركين على موافقة خطية مستنيرة وموافقة مستودع للسماح بإعادة استخدام بياناتهم وعيناتهم الحيوية. تم إنشاء خطوط iPSC وفقا لإرشادات IRB والمؤسسية. يوضح الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية لسير عمل هذا البروتوكول.
1. إعادة برمجة وصيانة iPSC
2. تلطيخ تعدد القدرات
3. اختبار الميكوبلازما
ملاحظة: راجع بروتوكول مجموعة الكشف (انظر جدول المواد) للحصول على خطوات مفصلة لتنفيذ الفحص وتحليله. توفر مجموعة الكشف الكاشف والركيزة والمخزن المؤقت للفحص لاختبار الميكوبلازما.
4. إعداد الشعيرات الدقيقة
5. تشكيل الجسم الجنيني (EB)
ملاحظة: يجب تسخين جميع الوسائط والحلول إلى RT.
6. الحث العصبي الظهاري
7. التمايز العضوي والنضج
ملاحظة: يجب تسخين جميع الوسائط إلى RT.
يؤدي دمج ألياف PLGA وتضمين الدمل والإثارة إلى جيل قوي من الكائنات العضوية الدماغية التي تمكن من الحفاظ على الثقافات المشتقة من iPSC لفترات طويلة من الزمن (الشكل 1).
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل والجدول الزمني لهذه الطريقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
فترة الحث العصبي الأولية قابلة للمقارنة مع الإجراءات المنشورة مسبقا11. تبدأ الأجسام الجنينية (EB) كمجاميع دائرية (الشكل 2B) بحواف بيضاء أو شفافة. مع تغير EB من وسائط الحث العصبي إلى وسائط الصيانة العصبية في DIV7 ، تظهر النتوءات والتبرعم في غضون 24 ساعة من الأنسجة الدائرية (الشكل 2C). علاوة على ذلك ، مع استمرار نمو العضو العضوي ، تساعد مساحة سطح ألياف PLGA العضو العضوي على الاستطالة (الشكل 2 د). أثناء النضج ، يجب أن تظل حواف العضو سليمة ، لأنها علامة جيدة على الخلايا السليمة والتطور ؛ خلاف ذلك ، يجب توفير مغذيات إضافية13 (الشكل 2E). يتم تسهيل نمو المواد العضوية بشكل أكبر من خلال إثارة الثقافة العضوية ، لأن هذا يحسن التروية بالمواد المغذية.
الشكل 2: تمايز ونضج العضويات الدماغية . (أ) صورة تمثيلية لثقافة iPSC عند التقاء 70٪ -80٪. (ب) تم إنشاء الأجسام الجنينية (EBs) وتم تحفيز التكوين العصبي الظهاري حتى DIV7. ثم تم تضمين EBs في مصفوفة الغشاء وتمييزها بشكل أكبر نحو الكائنات العضوية الدماغية. (ج) عضويات في DIV10 تعرض تكوينات ناشئة متميزة. يمكن أن تنضج الكائنات العضوية بشكل أكبر في مصفوفة الغشاء باستخدام إما (D) الدمل أو (E) تضمين شطيرة ، كما هو موضح هنا في DIV30. (F) تظهر الثقافة طويلة الأجل نمو عضويات دماغية إلى أحجام كبيرة (DIV70). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتستكمل الأبعاد والتشكل الخارجي للعضوي ببنية معقدة داخل العضو العضوي. بعد تثبيت الأنسجة في DIV7 بعد المرحلة الأولى من التمايز ، تعبر خلايا EB عن SOX2 ، وهو عامل نسخ صندوق HMG يعمل كعلامة للخلايا الجذعية العصبية متعددة القدرات21 ، بالإضافة إلى صندوق البروتين المقترن Pax-6 ، مما يشير إلى الخلايا السلفية العصبية (الشكل 3). يمكن بالفعل رؤية الخلايا العصبية غير الناضجة التي تتميز ب TuJ1 (الفئة الثالثة β-tubulin)22 منتشرة في جميع أنحاء الأنسجة.
في هذه المرحلة ، يصبح مثال على التنظيم الذاتي الذي تمر به هذه الكائنات العضوية واضحا. يشبه تنظيم الهياكل الشعاعية ، التي تسمى الوريدات ، الأنبوب العصبي ، مع خلايا SOX2 + في مركز الوردة21 و PAX6 باتجاه محيط الوردة. هذه الوريدات تؤدي إلى الخلايا العصبية أثناء هجرتها. هذه الخلايا المشعة هي في البداية إيجابية مزدوجة لعلامة الخلايا الجذعية / السلفية العصبية Nestin23 والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، على غرار الدبقية الشعاعية الموجودة في المناطق العصبية في الدماغ في الجسم الحي . عندما تنضج هذه الخلايا العصبية المهاجرة ، تعكس علامات الهيكل الخلوي هذا التغيير22. تظهر علامة التمايز العصبي في المرحلة المبكرة TuJ122 في الدائرة الداخلية للوردة وتتحول إلى البروتين 2 المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2) 24 ، وهي علامة نضج خاصة بالخلايا العصبية في المحيط.
الشكل 3: تظهر الأجسام الجنينية في DIV7 تنظيما هيكليا وتوصيف غير ناضج. صورة كاملة للكيمياء المناعية ل EB في DIV7. (أ) صورة مركبة ل EB تعرض (B) وريدات عصبية SOX2 + ، (C) خلايا عصبية غير ناضجة (TUJ1) منتشرة في جميع أنحاء EB ، (D) خلايا السلف العصبي (PAX6) ، و (E) نوى تصورها DAPI. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
مع تقدم الكائنات العضوية في العمر ، يبدأ تنظيم وعلامات الخلايا العصبية النامية في تكرار الظروف الفسيولوجية. في DIV30 ، يمكن ملاحظة العديد من الوريدات التي تؤدي إلى ظهور مناطق عصبية مكافئة للدماغ النامي25. بواسطة DIV60 ، هذه المناطق العصبية SOX2 + غير موجودة ويتم استبدالها ب MAP2 و NeuN26 الناضجين ، وعلامة تمايز الخلايا العصبية ، والخلايا العصبية الإيجابية (الشكل 4 والشكل 5).
الشكل 4: تظهر الكائنات العضوية في DIV120 توصيفا عصبيا ناضجا. صورة الكيمياء الهيستولوجية المناعية لقسم عضوي في DIV 120. (أ) صورة مركبة للمقطع توضح علامات عصبية ناضجة للعدد (ب) MAP2 (أرجواني) و(ج) نيوون (أخضر). (د) تصور النوى بواسطة DAPI. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقطرات العضوية DIV120. الرسوم البيانية الرقمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات التي توضح قيمة التعبير المطلق ل (A) MAP2 (أعلى ، أزرق) و (B) NeuN (أسفل ، أخضر). تفصل الخطوط الصفراء المائلة بين خطوط iPSC المختلفة (A ، B ، C ، إلخ) ، وقد تم تجميع المواد العضوية معا. ن = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن استخدام هذه الواسمات الهيكلية الخلوية جنبا إلى جنب مع علامات ما بعد الانقسام (مثل doublecortin27 و synapsin28) للتحقيق في اللدونة المشبكية وغيرها من الانخفاضات المرتبطة بالعمر (الشكل 6) ، بالإضافة إلى أنسجة المخ الإضافية مثل الخلايا النجمية والدبقية (الشكل 7).
الشكل 6: مثال على التحليل التشابكي الطرفي. صورة الكيمياء الهيستولوجية المناعية لقسم من العضو العضوي في DIV 120. (أ) صورة مركبة للمقطع ملطخة ب (ب) MAP2 و (ج) دبل كورتين (DCX) و (د) المشبك الأول (SYN). (ه) تصورت النوى بواسطة DAPI. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: دليل على تطور الخلايا الدبقية. صورة الكيمياء الهيستولوجية المناعية لقسم من العضو العضوي في DIV 120. أ: صورة مركبة للمقطع الملون للجزيء 1 (Iba1) و(ج) NeuN: (ب) (د) تصور النوى بواسطة DAPI. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الكاشف | التركيز النهائي | الحجم (إجمالي 50 مل) |
DMEM-F12 | 50% | 25 مل |
الوسط العصبي القاعدي | 50% | 25 مل |
ملحق N2 (100x) | 1x | 0.25 مل |
مكمل B27 - / + فيتامين أ (50x) | 0.5 مرة | 0.5 مل |
إنسولين | 0.25% | 12.5 ميكرولتر |
جلوتا ماكس (100x) | 1x | 0.5 مل |
MEM-NEAA (100x) | 0.5 مرة | 0.25 مل |
هيبس (1 م) | 10 مللي متر | 0.5 مل |
مضاد حيوي / مضاد حيوي (100x) | 1x | 0.5 مل |
2-β-ميركابتوإيثانول | 50 ميكرومتر | 17.5 ميكرولتر |
* ملاحظة: بعض DMEM-F12 يحتوي بالفعل على GlutaMAX ، لا حاجة لإضافة إضافية. |
الجدول 1: تركيب وسائط التمايز المستخدمة في هذه الدراسة.
يعد التكوين الموحد ل EBs خطوة حاسمة في التحويل القابل للتكرار للخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى عضويات دماغية. يمكن أن يختلف تجميع قوة الخلايا الجذعية إلى أنسجة مفردة اعتمادا على هندسة الآبار المقعرة وكثافة البذر ومعالجة البئر. على الرغم من أن الطريقة الحالية تشير إلى نطاق قطر يتراوح بين 500 و 600 ميكرومتر بعد 6 أيام ، إلا أن هذه الأقطار لا تستبعد الأقطار الأخرى للتكوين العضوي السليم ، حيث أثبتت العديد من الأقطار الأخرى نجاحها. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الأقطار المتفاوتة تؤثر على معدلات التمايز والنجاح29. لأغراض التكاثر ، يوصى بشدة بتغيرات القطر التي تقل عن 50 ميكرومتر20. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تمديد عدد أيام الحث العصبي من 6 إلى 10 أيام للسماح لقطر EBs بالنمو ، حيث ثبت أن استخدام مثبطات SMAD ينتج بكفاءة ويحافظ على تكوين الظهارة العصبية بعد 5 أيام فقط من التعرض30. في غياب مثبطات SMAD ، يمكن أن يؤدي الحث العصبي إلى نتائج غير متسقة ، مما يتطلب فترات تحريض أطول. مثبطات SMAD المذكورة في هذا العمل هي الأكثر فعالية ، ولكن يمكن استخدام جزيئات صغيرة أخرى من dorsomorphin و TGF β بتركيزها الفعال.
توفر مصفوفة الغشاء القاعدي ركيزة ممتازة للنمو ويمكن إدارتها بشكل مختلف. تضمنت الاستخدامات المبكرة للمصفوفة الغشاء القاعدي كطلاء جيد31. ومع ذلك ، أظهر استخدام المصفوفة لتضمين الأنسجة لتحسين التمايز والنضج في هذه الأنسجة32. بالنسبة للعضويات ، فقد ثبت أن استخدام المصفوفة يحسن تمايز EB إلى عضويات ، ويعزز النضج ، ويطيل فترات الاستزراع33. في حين أنه لا يزال من الممكن تشكيل المواد العضوية بدون المصفوفة ، حيث سعت العديد من المجموعات إلى تحقيق زراعة أنسجة خالية من المصفوفة 34,35 ، فقد وجدت الدراسات أن الكائنات العضوية المضمنة فيالمصفوفة لديها فرصة أكبر لأوقات استزراع طويلة وتتطلب صيانة أقل 36. توفر طريقة الدمل للتضمين تغطية متساوية للسطح العضوي ، مما يضمن انتشارا مشابها ، والوصول إلى العناصر الغذائية ، والتمايز القابل للتكرار. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام تضمين القبة لتغليف المواد العضوية بالكامل37.
يعد نقل EBs إلى غمازات مصفوفة الغشاء خطوة حاسمة. على الرغم من أن طرف ماصة سعة 1 مل له فتحة واسعة بما يكفي لنقل EBs ، إلا أنه يفضل استخدام طرف 200 ميكرولتر لسهولة النقل. يجب قطع أطراف 200 ميكرولتر لإنشاء فتحة كبيرة بما يكفي ، مما يضمن حافة ناعمة لتقليل إجهاد القص عند الماصة. بدلا من ذلك ، توجد أطراف عريضة التجويف 200 ميكرولتر لسهولة النقل. يجب أن يتم السحب ببطء ، لأن السحب السريع قد يعطل محيط العضو ويعيق النمو السليم. يجب إيلاء اهتمام خاص لضمان نقل وسيط كاف لتوفير العناصر الغذائية. القليل جدا من الوسط يتعرض لخطر جفاف العضو العضوي ، مما يسبب النخر. يمكن أن يؤدي نقل EB مع الكثير من وسائط الثقافة إلى تخفيف المصفوفة بشكل كبير والفشل في تغليف العضو العضوي بشكل آمن. من الناحية المثالية ، يجب عدم تخفيف المصفوفة بأكثر من 50٪ لضمان بلمرتها وعملها كوحدة تحكم في المحتوى المؤسسي ل EBs. إذا لم ينجح التضمين ، فيمكن استرداد EB وإعادة تغليفه. يمكن إجراء إعادة التغليف في المصفوفة الجديدة في أي وقت لتزويد العضو العضوي بدعم إضافي.
على غرار تضمين المصفوفة للسقالات ، توفر ألياف PLGA دعما إضافيا للنمو ثلاثي الأبعاد. تم دمجها في الأصل لإنتاج عضويات ممدودة وزيادة مساحة السطح38 ، وقد تم تحديد دمج ألياف PLGA تدريجيا كأداة إضافية لتحسين التمايز العضوي والنضج39. نظرا لأن المزيد من المختبرات تتطلع إلى تقليل استخدام المصفوفة أو إلغائها تماما ، فإن خصائص التنظيم الذاتي للعضويات المدعومة بالألياف المدمجة توفر سقالات كافية لإنشاء الأنسجة ثلاثية الأبعاد والتمايز39. هنا ، تم الجمع بين كلتا الطريقتين لزيادة فرص الثقافة طويلة الأجل38,39. يعد دمج الألياف أثناء التجميع الأولي أمرا بالغ الأهمية ، حيث قد لا يتم إدخالها في مرحلة لاحقة. بعد الطرد المركزي ، فإن التحقق من وجود اثنين من الألياف بين الخلايا المجمعة سيضمن دمج الألياف في EB. إذا لم ينجح ، فإن الطموح اللطيف للبئر وإعادة الطرد المركزي يجب أن يضمن الخلط.
خطوة أخرى حاسمة في صيانة المواد العضوية هي إدخال شاكر مداري لتحسين تروية الوسائط. في التكرارات المبكرة لبروتوكولات الأعضاء ، تم استخدام مفاعل حيوي دوار لإنشاء التحريض11. يوفر الهزاز المداري عند 90 دورة في الدقيقة تحريضا كافيا دون تدمير قطرة المصفوفة أو إتلاف مورفولوجيا العضوي. تمتنع بعض المجموعات عن استخدام سقالة المصفوفة ولكنها تحتفظ بإثارة شاكر لتوفير بيئة مناسبة34. كما هو الحال مع جميع البروتوكولات ، يجب ضبط سرعة الدوران اعتمادا على شاكر لتقليل مقدار إجهاد القص. إذا تم اختيار تضمين قبة ، فيمكن استخدام شاكر مائل لتقليل مقدار إجهاد القص11,34.
مجتمعة ، يوفر تكامل العديد من التقنيات المختارة طريقة قوية لتشكيل عضوي مشتق من iPSC. هناك عدة طرق لإنشاء المواد العضوية والحفاظ عليها ، لكن العديد منها يركز على مسارات التمايز المبكرة. في هذا العمل ، تم الجمع بين العديد من التقنيات المختلفة لزرع المواد العضوية لفترات طويلة من الزمن ، بعد مرحلة التمايز ، وفي فترة النضج حيث يمكن أن تبدأ الأنماط الظاهرية للشيخوخة في التطور. يسمح دمج هذه التقنيات بالنضج المطول دون الحاجة إلى عوامل بيولوجية خارجية للحفاظ على الثقافات ، مع الاحتفاظ بالتنظيم الذاتي والتقدم الطبيعي للشيخوخة.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل مبادرة هولندا للأعضاء على الرقاقة ، وهو مشروع NWO Gravitation (024.003.001) بتمويل من وزارة التعليم والثقافة والعلوم في حكومة هولندا. ولحسن الحظ، تعترف DCB بالدعم المالي المقدم من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT) في شكل منحة دراسية للدكتوراه.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved