JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا لتقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم شطيرة معدلة لقياس مكونين من بقايا فخ العدلات خارج الخلية كميا ، وهما الحمض النووي المترافق للميلوبيروكسيديز ومجمعات الحمض النووي المترافق لإيلاستاز العدلات ، المشتقة من العدلات المنشطة.

Abstract

تتسبب بعض المحفزات ، مثل الكائنات الحية الدقيقة ، في إطلاق العدلات لمصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، وهي في الأساس هياكل تشبه الويب تتكون من الحمض النووي مع البروتينات الحبيبية ، مثل الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) ، والبروتينات السيتوبلازمية والهيكلية الخلوية. على الرغم من أن الاهتمام بالشبكات قد زاد مؤخرا ، إلا أنه لا توجد طريقة فحص حساسة وموثوقة متاحة لقياس الشبكات في البيئات السريرية. تصف هذه المقالة مقايسة ممتز مناعي معدل مرتبط بالإنزيم لقياس مكونين من مكونات الشبكات المنتشرة كميا ، مجمعات MPO-DNA و NE-DNA ، وهي مكونات محددة من NETs ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار NETs. يستخدم الفحص أجساما مضادة وحيدة النسيلة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يرتبط MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي يتم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. يظهر هذا الفحص خطيا جيدا ودقة عالية بين المقايسة وداخل المقايسة. استخدمناه في 16 مريضا مصابا ب COVID-19 يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة المصاحبة ووجدنا أن تركيزات البلازما من MPO-DNA و NE-DNA كانت أعلى بكثير من البلازما التي تم الحصول عليها من الضوابط الصحية. يعد اختبار الكشف هذا طريقة موثوقة وحساسة للغاية ومفيدة للتحقيق في خصائص الشبكات في البلازما البشرية وطافات الثقافة.

Introduction

توضح هذه المقالة طريقة لتحديد تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية (NET) في السوائل البيولوجية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش (ELISA) للكشف عن معقدات الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) مع الحمض النووي1،2. تتكون الشبكات من العمود الفقري للحمض النووي المزين بالبروتياز المضاد للميكروبات الناشئة من حبيبات العدلات 3,4. تعد كل من معقدات MPO-DNA و NE-DNA مكونات مهمة ومحددة للشبكات ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار ل NETs 3,4.

إلى جانب دورها الفسيولوجي الهام في الدفاع المضاد للميكروبات3 ، فإن الشبكات لها أيضا تأثيرات مرضية مختلفة 4,5 ، بما في ذلك تعزيز تكوين الخثار6 وتفاقم الإنتان7. وبناء على ذلك، حظيت الشبكات بالاهتمام في الآونة الأخيرة. ومع ذلك، فقد ثبت أن القياس الكمي للشبكات في الجسم الحي يمثل تحديا بسبب عدم وجود طريقة اختبار كمية حساسة وموثوقة.

تتوفر بعض الطرق ، بما في ذلك القياس المباشر للشبكات بواسطة المجهر الفلوري 8,9 وقياس التدفق الخلوي 10 والقياس غير المباشر للحمض النووي الخالي من الخلايا ، والنيوكليوسومات ، وهيستون سيترولين H3 ، ولكن كل طريقة لها مزاياها وقيودهاالخاصة 11. على الرغم من أن الطريقة المجهرية المناعية خاصة بالشبكات وتظهر بوضوح توطين ودرجة تكوين NET ، إلا أن العينات تقتصر على أنسجة الخزعة والمواد المفرزة. علاوة على ذلك ، يجب أن يتم تنفيذ هذه الطريقة من قبل باحثين مهرة وتتطلب وقتا طويلا للحصول على النتائج. يعد قياس المستويات المتداولة للمكونات المرتبطة بالشبكة عن طريق قياس التدفق الخلوي أمرا سهلا ويوفر نتائج سريعة ؛ ومع ذلك ، فإن الطريقة ليست خاصة بالشبكات12.

لقد طورنانحن 13 وآخرون 1,2 مقايسة حساسة للغاية وموثوقة لقياس مكونات NET المتداولة ، الحمض النووي المترافق MPO أو NE المترافق ، في البلازما البشرية باستخدام تقنية ELISA المعدلة التي تستخدم أجساما مضادة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار خارج الجسم الحي لتحديد مكونات NET في طافات زراعة الخلايا التي تطلقها العدلات المنشطة استجابة لتحفيز phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل مجالس المراجعة المؤسسية لجامعة أيشي الطبية (2017-H341 ، 2019-H137). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مشارك.

1. إعداد الكاشف

ملاحظة: لإجراء فحص شطيرة ELISA ، يتم تحضير الكواشف كما هو موضح أدناه.

  1. طلاء العازلة:
    1. لعمل مخزن مؤقت 0.1 مول / لتر من كربونات بيكربونات ، قم بوزن 10.6 جم من كربونات الصوديوم اللامائية (الوزن الجزيئي ، 106 جم / مول) و 8.4 جم من بيكربونات الصوديوم (الوزن الجزيئي ، 84 جم / مول).
    2. أضفه إلى حوالي 900 مل من الماء المقطر في كأس زجاجية.
    3. اضبط الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت على 9.6 عن طريق إضافة الكمية المطلوبة من حمض الهيدروكلوريك المخفف أو هيدروكسيد الصوديوم.
    4. تحقق من درجة الحموضة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
    5. ثم أضف الحجم المطلوب من الماء المقطر لتحقيق حجم إجمالي قدره 1000 مل.
    6. قم بتخزين هذا المخزن المؤقت 0.1 مول / لتر من كربونات البيكربونات في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
  2. حظر المخزن المؤقت:
    1. أضف ما يقرب من 250 ميكرولتر من 20٪ أزيد الصوديوم و 1 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 70 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يتكون من 137 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 8.1 مليمول / لتر Na 2 HPO 4 ،2.68 مليمول / لتر KCl ، و 1.47 مول / لتر KH2PO 4 (درجة الحموضة7.4) ، واخلطهم بلطف.
    2. أضف الماء المقطر لتحقيق حجم إجمالي قدره 100 مل. التركيزات النهائية لألبومين مصل الأبقار وأزيد الصوديوم هي 1٪ و 0.05٪ على التوالي. انتظر لمدة 10 دقائق ، ثم يصبح الحل جاهزا للاستخدام.
  3. محلول الغسيل: تحضير 0.5٪ t-octylphenoxypolyethoxyethanol ، البولي إيثيلين جلايكول ثلاثي أوكتيل فينيل الأثير (Triton X-100) في الماء المقطر.
    1. تمييع 100٪ Triton X-100 إلى 10٪ بالماء المقطر ، والسماح لمحلول 10٪ بالوقوف لمدة يوم واحد قبل الاستخدام.
    2. ثم أعد تخفيف محلول Triton X-100 بنسبة 10٪ 20 ضعفا بالماء المقطر لتحقيق تركيز 0.5٪.
  4. تخفيف الأجسام المضادة:
    1. قم بتخفيف الجسم المضاد للالتقاط (الجسم المضاد المضاد ل MPO [1 مجم / مل] أو الجسم المضاد المضاد ل NE [1 مجم / مل]) إلى 1: 2000 في محلول الطلاء (درجة الحموضة 9.6) قبل الاستخدام في اليوم الأول من الفحص (انظر أدناه) والجسم المضاد للكشف (الجسم المضاد للحمض النووي المترافق بالبيروكسيداز) إلى 1:40 مع برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام في اليوم الثالث من الفحص (انظر أدناه).
      ملاحظة: بالنسبة للتجربة الأولية ، قم بتخفيف الأجسام المضادة من النوع iso (أرنب IgG [5 مجم / مل] واستنساخ الماوس IgG1 Ci4 [0.5 مجم / مل]) إلى 1: 10000 و 1: 1000 في المخزن المؤقت للطلاء (درجة الحموضة 9.6).
  5. محلول ركيزة ABTS: اعتمادا على عدد العينات ، قم بإذابة واحد أو اثنين أو ثلاثة أقراص 2,2'-azino-bis(3 أقراص إيثيل بنزوثيازولين -6-حمض السلفونيك (ABTS) في 5 مل أو 10 مل أو 15 مل من المخزن المؤقت ABTS (يحتوي على بيربورات الصوديوم وحامض الستريك وفوسفات هيدروجين الصوديوم) ؛ هناك حاجة إلى 100 ميكرولتر لكل عينة. قم بتخزين المحلول المحضر في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية محمية من الضوء. الحل مستقر لمدة تصل إلى 3 أشهر.

2. جمع العينات وتخزينها

  1. عزل البلازما:
    1. اجمع 4 مل من عينات الدم المحيطية في أنبوب جمع دم الهيبارين الليثيوم عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 22 جم ، وأجهزة طرد مركزي عند 1600 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. انقل المادة الطافية إلى أنبوب عينة آمن القفل سعة 2 مل.
    3. أعد الطرد المركزي للطافد عند 16000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي خلايا متبقية.
    4. اجمع المادة الطافية في أنبوب عينة جديد آمن القفل دون إزعاج الحبيبات الموجودة في أسفل الأنبوب.
    5. قم بتخزين البلازما التي تم الحصول عليها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: للحصول على نتائج عالية الإنتاجية باستخدام هذا الفحص ، يلزم وجود عينات عالية الجودة. إذا تم استخدام عينات البلازما ، فقم بإجراء طرد مركزي ثان لإزالة أي خلايا متبقية. تجنب الذوبان المتكرر للعينات. استخدم الهيبارين كمضاد للتخثر لأن EDTA يؤثر على نشاط DNase.
  2. عزل العدلات متعددة الأشكال النووية
    1. اجمع عينات الدم المحيطية في أنبوب جمع الدم من الهيبارين الليثيوم عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 22 جرام.
    2. ضع 6 مل من الدم على 6 مل من الأشكال المتعددة ذات الخطوة الواحدة ، وطرد مركزي الأنابيب عند 1000 × جم لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. احصد طبقة معطف بافي الثالثة التي تحتوي على العدلات ، واغسلها ثلاث مرات في RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر عند 400 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
    4. أعد تعليق العدلات في RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر الذي يحتوي على 2 mM L-glutamine المكمل بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 6٪ ، وعد الخلايا في حقل المجهر باستخدام مقياس الدم.
      ملاحظة: تنتج هذه الطريقة نقاء بنسبة 96٪ إلى 98٪ مع قابلية صلاحية أكبر من 95٪ ، كما تم تقييمها من خلال استبعاد صبغة التريبان الزرقاء.
  3. تفعيل العدلات متعددة الأشكال النووية و NETosis في المختبر
    1. تمييع العدلات متعددة الأشكال النووية المعزولة حديثا إلى 1 × 105 خلايا / مل في RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر الخالي من الفينول الذي يحتوي على 2 mM L-glutamine المكمل بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 6٪ ، وزرعها في أطباق استزراع 35 مم.
    2. للحث على الشبكات ، قم بتحفيز العدلات متعددة الأشكال النووية مع 25 نانومتر PMA لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2/95٪ هواء.
    3. بعد 4 ساعات من الحضانة ، قم بهضم الشبكات جزئيا عن طريق إضافة 0.6 ميكروغرام / مل DNase I مباشرة إلى أطباق الاستزراع لمدة 15 دقيقة في RT ، وإيقاف نشاط DNase I بإضافة 5 mM EDTA.
    4. اجمع الوسط الذي يحتوي على الشبكات المركبة وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية.
    5. احصل على المواد الطافية من أربعة عناصر تحكم صحية ، واخلطها ، واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يتم استخدام العدلات المحفزة ب DNase التي تم الحصول عليها من أربعة عناصر تحكم صحية كمعيار NET1،14،15. قم بإنشاء منحنى معايرة من معيار NET مخفف بشكل متسلسل باستخدام PBS ، وقم بتعيين قيم الكثافة الضوئية (OD) التي تم الحصول عليها من معيار NET غير مخفف ك 100٪ NET.

3. طريقة الفحص

ملاحظة: يتم وصف خطوات إجراء الفحص بالتفصيل أدناه.

  1. اليوم 1
    1. ضع ما مجموعه 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة المضادة ل MPO أو المضادة ل NE التي تحتوي على 0.05 ميكروغرام من الجسم المضاد على كل بئر من اللوحة ، بما في ذلك البئر الفارغة.
      ملاحظة: يجب ألا يحتوي المخزن المؤقت للطلاء على أي نوع من المنظفات لأنه ، بخلاف ذلك ، قد لا ترتبط الأجسام المضادة بشكل متساو وسلس بجدران كل بئر. لمنع تأثير الخطاف ، يجب ألا يزيد تركيز بروتين الطلاء عن 20 ميكروغرام / مل ، لأن التركيزات فوق هذا المستوى ستشبع معظم المواقع المتاحة على لوحة المعايرة الدقيقة. نطاق التركيز النموذجي لمحاليل طلاء البروتين هو 2-10 ميكروغرام / مل. بالنسبة للتجربة الأولية ، استخدم أرنب IgG المخفف للتحكم في الأجسام المضادة من نوع iso للطلاء بدلا من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المحددة ضد MPO. استخدم ماوس IgG1 المخفف للتحكم في الأجسام المضادة من نوع iso للطلاء بدلا من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المحددة ضد NE.
    2. قم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق لمنع تبخر العينة ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح بربط الأجسام المضادة للالتقاط.
  2. اليوم 2
    1. تخلص من محلول الأجسام المضادة المخفف من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    2. قم بإزالة PBS الزائد عن طريق النقر على اللوحة الجافة على منشفة ورقية.
    3. سد كل بئر من لوحة ELISA مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر.
    4. قم بتغطية اللوحة بإحكام بغطاء بلاستيكي لاصق ، واحتضانها لمدة 1.5-2 ساعة في RT لعرقلة الآبار.
    5. تخلص من محلول الانسداد تماما من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    6. قم بإزالة PBS الزائد عن طريق النقر على اللوحة الجافة على منشفة ورقية.
    7. ضع ما مجموعه 25 ميكرولتر من البلازما أو الوسط على كل بئر باستثناء البئر الفارغ ، وأضف 75 ميكرولتر من PBS كمخفف لجعل الحجم النهائي 100 ميكرولتر ؛ أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى البئر الفارغة.
    8. بعد ذلك ، امزج العينات في RT لمدة 10 ثوان عن طريق وضع اللوحة على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
    9. ضع 2 ميكرولتر من DNase I المخفف 100 ضعف (0.03 مجم / مل) على كل بئر ، بما في ذلك البئر الفارغ (التركيز النهائي ل DNase I في خليط التفاعل: 0.6 ميكروغرام / مل).
    10. أغلق اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق ، وامزج العينات جيدا في RT لمدة 10 ثوان عن طريق وضع اللوحة على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: لتقييم الظروف المثلى لهضم الحمض النووي ، عند تطوير الفحص ، قمنا باحتضان عينات تحتوي على الحمض النووي المرتبط ب MPO من مرضى COVID-19 مع 0-0.9 ميكروغرام / مل DNase I لمدة 15 دقيقة في RT واستخدمنا لوحات مغلفة بجسم مضاد التقاط محدد ل MPO أو جسم مضاد للتحكم من نوع iso مطابق للأنواع.
    11. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في RT.
    12. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي اللاصق ، وقم بتطبيق 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA على كل بئر لإيقاف تفاعل DNase.
    13. أعد إغلاق اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق ، ورجها في RT لمدة 15 ثانية عن طريق وضعها على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
    14. بعد ذلك ، احتضن اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح لمكونات البروتين في الشبكات بالالتصاق بالأجسام المضادة الملتقطة .
  3. اليوم 3
    1. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي اللاصق ، وتخلص من المحلول من الآبار.
    2. تخلص من المحلول تماما من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    3. ضع ما مجموعه 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف عن الحمض النووي المخفف المترافق بالبيروكسيديز على كل بئر.
    4. أغلق اللوحة بإحكام بغطاء بلاستيكي لاصق ، واحتضنها لمدة 1.5 ساعة في RT.
    5. تخلص من المحلول تماما من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    6. قم بإزالة الحل المتبقي بعناية.
    7. ضع ما مجموعه 100 ميكرولتر من محلول ركيزة ABTS على كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق.
    8. احتضان اللوحة في الظلام في RT لمدة 20-30 دقيقة على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: راقب اللوحة على فترات 5 دقائق حتى يتم الحصول على قراءات OD المطلوبة.
    9. أضف إجمالي 50 ميكرولتر من 2 M من حمض الكبريتيك لإيقاف التفاعل.
    10. امزج المحتويات السائلة للآبار عن طريق النقر بعناية على جانب اللوحة.
    11. قم بتشغيل قارئ الألواح الدقيقة ، وقم بتوصيله بالكمبيوتر.
    12. افتح التطبيق البرمجي على الكمبيوتر.
    13. من شريط الحالة، أنشئ تجربة جديدة وقم بتسميتها.
    14. اضبط جميع المعلمات التالية لقراءة اللوحة: نوع القراءة ، الامتصاص ؛ وضع القراءة ، نقطة النهاية ؛ الأطوال الموجية ، 2 ؛ Lm-1 ، 405 نانومتر ؛ Lm-2 ، 490 نانومتر ؛ خلط تلقائي وطمس قبل ، إيقاف ؛ لوحة ما قبل القراءة ، إيقاف ؛ المعايرة التلقائية ، تشغيل ؛ شرائط ، قراءة لوحة كاملة. أولوية الطول الموجي للعمود ، أولوية العمود ؛ سرعة النقل ، عادي ؛ والقراءة التلقائية، إيقاف.
    15. ثم ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على العينات في الدرج وأغلقها.
    16. أخيرا ، حدد ملف قراءة زر بحيث تتم قراءة اللوحة على الفور.
    17. اقرأ امتصاص كل بئر بطول موجي 405 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة (في هذه المرحلة ، استخدم طولا موجيا يبلغ 490 نانومتر كمرجع).
    18. قم بإجراء الطرح التلقائي لقيمة الامتصاص لوسط الفحص وحده من جميع العينات غير المعروفة ، واحفظ البيانات.
      ملاحظة: استخدم منحنى قياسيا تم الحصول عليه من معيار NET المخفف بشكل متسلسل لحساب التركيز النسبي ل NET في العينة1،14،15. هنا ، يتم تقديم النتائج النهائية على أنها "مجمعات MPO أو NE-DNA (٪ من معيار NET)." تم حساب حد الكشف (LOD) من الانحراف المعياري (SD) وميل منحنى المعايرة (S) على النحو التالي: LOD = 3.3 (SD / S).

4. الإحصاء

  1. إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برامج التحليل الإحصائي المناسبة. هنا تم استخدام SigmaPlot v14.5. يتم عرض النسب المئوية والمتغيرات المستمرة كوسيط مع النطاق الربيعي بسبب التوزيع المنحرف لمعظم المعلمات.
  2. قارن مستويات MPO-DNA و NE-DNA في البلازما بين مرضى COVID-19 والضوابط الصحية باستخدام اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون. استخدم تحليل الارتباط لاستكشاف العلاقة بين الكثافة الضوئية والنسبة المئوية لمعيار NET.

النتائج

استخدمت هذه الطريقة شطيرة ELISA مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل MPO و anti-NE والمضادة للحمض النووي لقياس الحمض النووي المرتبط ب MPO والمرتبط ب NE (الشكل 1). في هذه الطريقة ، تم طلاء آبار صفيحة العيار الدقيق بجسم مضاد أحادي النسيلة خاص ب MPO أو خاص ب NE لالتقاط MPO المرتبط بالح?...

Discussion

لقد وصفنا طريقة شطيرة ELISA التي يرتبط فيها MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي تم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. بعد الغسيل ، يتم الانتهاء من "الساندويتش" عن طريق احتضان العينات بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للحمض النووي مرتبط بالبيروكسيداز. بعد إز...

Disclosures

يتم تضمين جميع البيانات التي تم إنشاؤها و / أو تحليلها خلال هذه الدراسة في هذه المقالة المنشورة. يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدكتور حق محمد أمينول على مساعدته في مراجعة المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step PolymorphsAccurate Chemical and Scientific CorporationAN221725Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plateThermo Fisher Scientific467466flat bottom
ABTS buffer solutionSigma-Aldrich Merck11 204 530 001Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tabletsSigma-Aldrich Merck11 204 521 001 Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, AxygenThermo Fisher Scientific14222348
Anti-MPO antibodySigma-Aldrich Merck 07-496-IStore at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10Sigma-Aldrich MerckMABS461Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albuminBiomedical ScienceBR-220700081Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase INew England BioLabsM0303MStore at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype ControlGENETEX, Inc.GTX35035Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4Merck MABC002Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tubeBecton Dickinson and Company
Microplate mixerAs one corporationNS-P
Microplate ReaderMolecular DevicesSpectraMax 190 Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader applicationMolecular DevicesSoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISARoche Diagnostics1154467500 bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-Aldrich MerckP8139Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solutionTakara BioT9181Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5 Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azideFujifilm Wako Chemicals190-14901Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl etherFujifilm Wako Chemicals9002-93-1Store at room temperature.

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved