Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Résumé

Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.

Résumé

Certains stimuli, tels que les micro-organismes, amènent les neutrophiles à libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont essentiellement des structures en forme de toile composées d’ADN avec des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile (NE), et des protéines cytoplasmiques et cytosquelettiques. Bien que l’intérêt pour les TNE ait augmenté récemment, il n’existe pas de méthode de dosage sensible et fiable pour mesurer les TNE en milieu clinique. Cet article décrit un test immuno-enzymatique sandwich modifié pour mesurer quantitativement deux composants des TNE circulantes, l’ADN-MPO et les complexes ADN-NE, qui sont des composants spécifiques des TNE et qui sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE. Le test utilise des anticorps monoclonaux spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique de l’ADN. MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Ce test montre une bonne linéarité et une grande précision inter-essais et intra-essais. Nous l’avons utilisé chez 16 patients atteints de COVID-19 avec le syndrome de détresse respiratoire aiguë qui l’accompagne et avons constaté que les concentrations plasmatiques de MPO-ADN et d’ADN-NE étaient significativement plus élevées que dans le plasma obtenu à partir de témoins sains. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans le plasma humain et les surnageants en culture.

Introduction

Cet article décrit une méthode permettant de quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans les fluides biologiques en utilisant le test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) pour détecter les complexes de myéloperoxydase (MPO) et d’élastase neutrophile (NE) avec l’ADN ^1,2. Les TNE sont composées d’un squelette d’ADN décoré de protéases antimicrobiennes provenant de granules de neutrophiles ^3,4. Les complexes MPO-ADN et ADN-E sont tous deux des composants importants et spécifiques des TNE et sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE ^3,4.

Outre leur rôle physiologique important dans la défense antimicrobienne³, les TNE ont également divers effets pathologiques^4,5, notamment la promotion de la thrombogenèse⁶ et l’aggravation de la septicémie⁷. Par conséquent, les TNE ont récemment attiré l’attention. Néanmoins, la quantification in vivo des TNE s’est avérée difficile en raison de l’absence d’une méthode de dosage quantitative sensible et fiable.

Quelques méthodes sont disponibles, notamment la mesure directe des TNE par microscopie à fluorescence^8,9 et cytométrie en flux 10 et la mesure indirecte de l’ADN acellulaire circulant, des nucléosomes et de l’histone H3 citrulliée^, mais chaque méthode a ses propres avantages et limites¹¹. Bien que la méthode microscopique d’immunofluorescence soit spécifique aux TNE et montre clairement la localisation et le degré de formation des TNE, les échantillons sont limités aux tissus de biopsie et aux matériaux sécrétés. De plus, cette méthode doit être réalisée par des chercheurs qualifiés et nécessite beaucoup de temps pour obtenir des résultats. La mesure des niveaux circulants de composants liés aux TNE par cytométrie en flux est facile et fournit des résultats rapidement ; cependant, la méthode n’est pas spécifique aux TNE¹².

Nous¹³ et al. ^1,2 avons mis au point un test très sensible et fiable pour mesurer les composants TNE circulants, l’ADN conjugué MPO ou l’ADN conjugué NE, dans le plasma humain avec une technique ELISA modifiée qui utilise des anticorps spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique à l’ADN. Ce test peut également être utilisé ex vivo pour identifier les composants TNE dans les surnageants de culture cellulaire libérés par les neutrophiles activés en réponse à la stimulation du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA).

Protocole

Cette étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de médecine d’Aichi (2017-H341, 2019-H137). Le consentement éclairé écrit de chaque participant a été obtenu.

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Pour effectuer le test ELISA sandwich, les réactifs sont préparés comme décrit ci-dessous.

1. Tampon de revêtement :
   1. Pour obtenir un tampon carbonate-bicarbonate de 0,1 mol/L, peser 10,6 g de carbonate de sodium anhydre (poids moléculaire, 106 g/mol) et 8,4 g de bicarbonate de sodium (poids moléculaire, 84 g/mol).
   2. Ajoutez-le à environ 900 ml d’eau distillée dans un bécher.
   3. Ajustez le pH du tampon à 9,6 en ajoutant la quantité requise d’acide chlorhydrique dilué ou d’hydroxyde de sodium.
   4. Vérifiez le pH à l’aide d’un pH-mètre.
   5. Ensuite, ajoutez le volume requis d’eau distillée pour obtenir un volume total de 1 000 ml.
   6. Conservez ce tampon carbonate-bicarbonate de 0,1 mol/L au réfrigérateur à 4 °C.
2. Tampon de blocage :
   1. Ajouter environ 250 μL d’azoture de sodium à 20 % et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 70 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) composée de 137 mmol/L de NaCl, 8,1 mmol/L de Na 2HPO 4, 2,68 mmol/L de KCl et 1,47 mol/L de KH₂PO 4 (pH_7,4), et mélanger délicatement.
   2. Ajouter de l’eau distillée pour obtenir un volume total de 100 ml. Les concentrations finales d’albumine sérique bovine et d’azoture de sodium sont respectivement de 1 % et 0,05 %. Attendez 10 minutes, puis la solution est prête à l’emploi.
3. Solution de lavage : Préparer 0,5 % de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol, de polyéthylène glycol tert-octylphényléther (Triton X-100) dans de l’eau distillée.
   1. Diluer 100 % Triton X-100 à 10 % avec de l’eau distillée et laisser reposer la solution à 10 % pendant 1 jour avant utilisation.
   2. Ensuite, rediluez la solution de Triton X-100 à 10 % 20 fois avec de l’eau distillée pour obtenir une concentration de 0,5 %.
4. Dilution des anticorps :
   1. Diluer l’anticorps de capture (anticorps anti-MPO [1 mg/mL] ou anticorps anti-NE [1 mg/mL]) à 1 :2 000 dans le tampon d’enrobage (pH 9,6) avant utilisation le jour 1 de l’essai (voir ci-dessous) et l’anticorps de détection (anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase) à 1 :40 avec PBS avant utilisation le jour 3 de l’essai (voir ci-dessous).
      REMARQUE : Pour l’expérience préliminaire, diluer les anticorps de type iso (IgG de lapin [5 mg/mL] et clone de souris IgG1 Ci4 [0,5 mg/mL]) à 1 :10 000 et 1 :1 000 dans le tampon d’enrobage (pH 9,6).
5. Solution de substrat ABTS : Selon le nombre d’échantillons, dissoudre un, deux ou trois comprimés d’acide 2,2'-azino-bis(3 éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) dans 5 mL, 10 mL ou 15 mL de tampon ABTS (contenant du perborate de sodium, de l’acide citrique et de l’hydrogénophosphate disodique) ; 100 μL sont nécessaires par échantillon. Conservez la solution préparée à une température comprise entre 2 et 8 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable jusqu’à 3 mois.

2. Collecte et stockage des échantillons

1. Isolement du plasma :
   1. Prélever 4 mL d’échantillons de sang périphérique dans un tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium par ponction veineuse avec une seringue de 22 G et centrifuger à 1 600 x g pendant 10 min à 4 °C.
   2. Transvaser le surnageant dans un tube d’échantillon de 2 mL à verrouillage sûr.
   3. Recentrer le surnageant à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les cellules résiduelles.
   4. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube d’échantillon à verrouillage sûr sans perturber la pastille au fond du tube.
   5. Conservez le plasma obtenu à −80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
      REMARQUE : Pour obtenir des résultats à haut débit avec ce test, des échantillons de bonne qualité sont nécessaires. Si des échantillons de plasma sont utilisés, effectuez une deuxième centrifugation pour éliminer les cellules résiduelles. Éviter les décongélations répétées des échantillons. Utilisez l’héparine comme anticoagulant car l’EDTA affecte l’activité de la DNase.
2. Isolement des polynucléaires neutrophiles
   1. Prélever les échantillons de sang périphérique dans un tube de prélèvement sanguin d’héparine au lithium par ponction veineuse à l’aide d’une seringue de 22 G.
   2. Déposer 6 mL de sang sur 6 mL de polymorphes en une étape et centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 45 min à température ambiante (RT).
   3. Récoltez la troisième couche de couche leucocytaire contenant des neutrophiles et lavez-la trois fois dans du rouge de phénol RPMI-1640 à 400 x g pendant 10 min à RT.
   4. Remettre les neutrophiles en suspension dans du RPMI-1640 sans rouge de phénol contenant 2 mM de L-glutamine complété par 6 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et compter les cellules dans le champ du microscope à l’aide d’un hémocytomètre.
      REMARQUE : Cette méthode donne une pureté de 96% à 98% avec une viabilité supérieure à 95%, telle qu’évaluée par l’exclusion du colorant bleu trypan.
3. Activation des polynucléologues, neutrophiles et NETosis in vitro
   1. Diluer les neutrophiles polymorphonucléaires fraîchement isolés à 1 × 10⁵ cellules/mL dans du RPMI-1640 sans rouge de phénol contenant 2 mM de L-glutamine complété par 6 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et les ensemencer dans des boîtes de culture de 35 mm.
   2. Pour induire des TNE, stimuler les polynucléaires neutrophiles avec 25 nM PMA pendant 4 h à 37 °C dans 5 % de CO₂/95 % d’air.
   3. Après 4 h d’incubation, digérer partiellement les TNE en ajoutant 0,6 μg/mL de DNase I directement dans les boîtes de culture pendant 15 min à RT, et arrêter l’activité de la DNase I en ajoutant 5 mM d’EDTA.
   4. Prélever le milieu contenant les TNE synthétisées et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
   5. Obtenir les surnageants de quatre témoins sains, mélanger et conserver à −80 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Les neutrophiles stimulés par la PMA digérés par la DNase obtenus à partir de quatre témoins sains sont utilisés comme norme NET ^1,14,15. Générez une courbe d’étalonnage à partir d’un étalon NET dilué en série avec PBS, et attribuez les valeurs de densité optique (OD) obtenues à partir d’un étalon NET non dilué comme 100 % NET.

3. Méthode d’analyse

REMARQUE : Les étapes pour effectuer le test sont décrites en détail ci-dessous.

1. Jour 1
   1. Appliquer un total de 100 μL d’anticorps anti-MPO ou anti-NE dilué contenant 0,05 μg d’anticorps sur chaque puits de la plaque, y compris le puits vierge.
      REMARQUE : Le tampon de revêtement ne doit contenir aucun type de détergent car, sinon, les anticorps risquent de ne pas se lier uniformément et en douceur aux parois de chaque puits. Pour éviter l’effet d’hameçon, la concentration en protéines de l’enrobage ne doit pas dépasser 20 μg/mL, car des concentrations supérieures à ce niveau saturent la plupart des sites disponibles sur la plaque de microtitration. La plage de concentration typique des solutions d’enrobage protéique est de 2 à 10 μg/mL. Pour l’expérience préliminaire, utiliser des anticorps de contrôle de type iso dilués de lapin IgG pour l’enrobage au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre le MPO. Utiliser un anticorps témoin de type iso dilué de souris IgG1 pour l’enrobage au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre l’EN.
   2. Recouvrez la plaque d’un couvercle en plastique adhésif pour éviter l’évaporation de l’échantillon, et incubez une nuit à 4 °C pour permettre la liaison des anticorps de capture.
2. Jour 2
   1. Jetez la solution d’anticorps diluée des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
   2. Retirez l’excédent de PBS en tapotant l’assiette sur une serviette en papier.
   3. Bloquez chaque puits de la plaque ELISA avec 200 μL de tampon de blocage.
   4. Couvrez étroitement la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et incubez-la pendant 1,5 à 2 h à RT pour obstruer les puits.
   5. Éliminez complètement la solution de blocage des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
   6. Retirez l’excédent de PBS en tapotant l’assiette sur une serviette en papier.
   7. Appliquer un total de 25 μL de plasma ou de milieu dans chaque puits, à l’exception du puits vide, et ajouter 75 μL de PBS comme diluant pour obtenir un volume final de 100 μL ; ajouter 100 μL de PBS dans le puits vierge.
   8. Ensuite, mixez les échantillons à RT pendant 10 s en plaçant la plaque sur un shaker à 250 tr/min.
   9. Appliquer 2 μL de DNase I diluée 100 fois (0,03 mg/mL) dans chaque puits, y compris le puits vierge (concentration finale de DNase I dans le mélange réactionnel : 0,6 μg/mL).
   10. Scellez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et mélangez soigneusement les échantillons à RT pendant 10 s en plaçant la plaque sur un agitateur à 250 tr/min.
       REMARQUE : Pour évaluer les conditions optimales de digestion de l’ADN, lors de la mise au point du test, nous avons incubé des échantillons contenant de l’ADN associé à la MPO provenant de patients atteints de COVID-19 avec 0-0,9 μg/mL DNase I pendant 15 minutes à RT et utilisé des plaques recouvertes d’un anticorps de capture spécifique pour la MPO ou d’un anticorps témoin de type iso apparié selon l’espèce.
   11. Incuber les échantillons pendant 15 min à RT.
   12. Retirez le couvercle en plastique adhésif et appliquez 1 μL d’EDTA 0,5 M sur chaque puits pour arrêter la réaction de la DNase.
   13. Refermez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et secouez-la à RT pendant 15 s en la plaçant sur un shaker à 250 tr/min.
   14. Ensuite, incubez la plaque pendant la nuit à 4 °C pour permettre aux composants protéiques des TNE de se fixer aux anticorps de capture.
3. Jour 3
   1. Retirez le couvercle en plastique adhésif et jetez la solution des puits.
   2. Éliminez complètement la solution des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
   3. Appliquer un total de 100 μL d’anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase diluée dans chaque puits.
   4. Scellez hermétiquement la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et incubez-la pendant 1,5 h à RT.
   5. Éliminez complètement la solution des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
   6. Retirez délicatement la solution résiduelle.
   7. Appliquez un total de 100 μL de solution de substrat ABTS sur chaque puits et recouvrez la plaque d’un couvercle en plastique adhésif.
   8. Incuber la plaque dans l’obscurité à RT pendant 20-30 min sur un shaker à 250 tr/min.
      REMARQUE : Surveillez la plaque à des intervalles de 5 minutes jusqu’à ce que les lectures de diamètre extérieur souhaitées soient obtenues.
   9. Ajouter un total de 50 μL d’acide sulfurique 2 M pour arrêter la réaction.
   10. Mélangez le contenu liquide des puits en tapotant soigneusement le côté de la plaque.
   11. Allumez le lecteur de microplaques et connectez-le à l’ordinateur.
   12. Ouvrez l’application logicielle sur l’ordinateur.
   13. Dans la barre d’état, créez un nouveau test et nommez-le.
   14. Réglez tous les paramètres suivants pour la lecture de la plaque : Type de lecture, Absorbance ; Mode de lecture, point de terminaison ; Longueurs d’onde, 2 ; Lm-1, 405 nm ; Lm-2, 490 nm ; Mélange automatique et suppression avant, Désactivé ; Plaque de pré-lecture, Éteint ; Calibrage automatique, activé ; Bandes, Lire toute la plaque ; Priorité à la longueur d’onde de la colonne, Priorité à la colonne ; Vitesse de chariot, Normal ; et Lecture automatique, Désactivé.
   15. Ensuite, placez la plaque à 96 puits contenant les échantillons dans le tiroir et fermez-la.
   16. Enfin, sélectionnez le bouton Lire pour que la plaque soit lue immédiatement.
   17. Lisez l’absorbance de chaque puits à une longueur d’onde de 405 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (à ce stade, utilisez une longueur d’onde de 490 nm comme référence).
   18. Effectuez une soustraction automatique de la valeur d’absorbance du milieu d’essai seul à partir de tous les échantillons inconnus et enregistrez les données.
       NOTA : Utiliser une courbe étalon obtenue à partir d’un étalon NET dilué en série pour calculer la concentration relative de NET dans l’échantillon 1,14,15. Ici, les résultats finaux sont présentés sous la forme de « complexes d’ADN MPO ou NE (% de la norme NET) ». La limite de détection (LOD) a été calculée à partir de l’écart-type (ET) et de la pente de la courbe d’étalonnage (S) comme suit : LOD = 3,3 (SD/S).

4. Statistiques

1. Effectuer toutes les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié. Ici, SigmaPlot v14.5 a été utilisé. Les pourcentages et les variables continues sont représentés par la médiane de l’intervalle interquartile en raison de la distribution asymétrique de la plupart des paramètres.
2. Comparez les taux plasmatiques d’ADN-MPO et d’ADN-E entre les patients atteints de COVID-19 et les témoins sains à l’aide du test de somme des rangs de Wilcoxon. Utilisez l’analyse de corrélation pour explorer la relation entre la densité optique et le pourcentage de norme NET.

Résultats

Cette méthode a utilisé un test ELISA sandwich avec des anticorps monoclonaux anti-MPO, anti-NE et anti-ADN pour mesurer l’ADN associé au MPO et l’ADN associé à l’EN (Figure 1). Dans cette méthode, les puits d’une plaque de microtitration ont été recouverts d’un anticorps monoclonal spécifique ou spécifique de l’ON pour capturer le MPO associé à l’ADN et l’ON associé à l’ADN, ainsi que le MPO et l’EN non associés à l’ADN. Pour calculer le coefficient de ...

Discussion

Nous avons décrit une méthode ELISA sandwich dans laquelle MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Après le lavage, le « sandwich » est complété par l’incubation des échantillons avec un anticorps monoclonal anti-ADN associé à la peroxydase. Après l’élimination de l’anticorps secondaire non lié, le conjugué peroxydase lié est détecté par l’ajout d’un substrat chromogène ABTS peroxydase,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.