JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת בדיקה אימונוסורבית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של שרידי מלכודת חוץ-תאיים של נויטרופילים, מיילאופרוקסידז מצומד-DNA וקומפלקסים של דנ"א מצומד אלסטאז נויטרופילים, הנגזרים מנויטרופילים פעילים.

Abstract

גירויים מסוימים, כגון מיקרואורגניזמים, גורמים לנויטרופילים לשחרר מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs), שהם בעצם מבנים דמויי רשת המורכבים מדנ"א עם חלבוני גרגירים, כגון myeloperoxidase (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE), וחלבונים ציטופלזמיים וציטו-שלד. למרות שהעניין ב- NETs גדל לאחרונה, אין שיטת בדיקה רגישה ואמינה זמינה למדידת NETs במסגרות קליניות. מאמר זה מתאר בדיקה אימונוסורבנטית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של NETs במחזור, MPO-DNA וקומפלקסים NE-DNA, שהם רכיבים ספציפיים של NETs ומשוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs. הבדיקה משתמשת בנוגדנים חד-שבטיים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. MPO או NE נקשר לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. בדיקה זו מראה ליניאריות טובה ודיוק גבוה בין בדיקות ותוך מבחנים. השתמשנו בו ב-16 חולי COVID-19 עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה נלווית ומצאנו כי ריכוזי ה-MPO-DNA וה-NE-DNA בפלזמה היו גבוהים משמעותית מאשר בפלזמה שהתקבלה מקבוצת ביקורת בריאה. בדיקת זיהוי זו היא שיטה אמינה, רגישה ביותר ושימושית לחקירת המאפיינים של NETs בפלזמה אנושית ובתרבית-על.

Introduction

מאמר זה מתאר שיטה לכימות היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים (NET) בנוזלים ביולוגיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים סנדוויץ' (ELISA) כדי לזהות קומפלקסים של מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE) עם DNA 1,2. NETs מורכבים מעמוד שדרה של DNA המעוטר בפרוטאזות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בגרגרי נויטרופילים 3,4. הן קומפלקסים MPO-DNA והן NE-DNA הם מרכיבים חשובים וספציפיים של NETs והם משוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs 3,4.

מלבד תפקידם הפיזיולוגי החשוב בהגנה אנטי-מיקרוביאלית3, ל-NETs יש גם השפעות פתולוגיות שונות4,5, כולל קידום טרומבוגנזה6 והחמרה באלח דם7. בהתאם לכך, רשתות צוברים תשומת לב לאחרונה. עם זאת, כימות in vivo של NETs הוכח כמאתגר בשל היעדר שיטת בדיקה כמותית רגישה ואמינה.

קיימות מספר שיטות, כולל מדידה ישירה של NETs במיקרוסקופ פלואורסצנטי8,9 וציטומטריית זרימה 10 ומדידה עקיפה של דנ"א נטול תאים במחזור, נוקלאוזומים והיסטון H3 ציטרולינציה, אך לכל שיטה יתרונות ומגבלות משלה11. למרות שהשיטה המיקרוסקופית האימונופלואורסצנטית היא ספציפית ל- NETs ומראה בבירור את הלוקליזציה ואת מידת היווצרות ה- NET, הדגימות מוגבלות לרקמת ביופסיה וחומרים מופרשים. יתר על כן, שיטה זו צריכה להתבצע על ידי חוקרים מיומנים ודורשת זמן רב לקבלת תוצאות. מדידת רמות במחזור של רכיבים הקשורים ל- NET באמצעות ציטומטריית זרימה היא קלה ומספקת תוצאות במהירות; עם זאת, השיטה אינה ספציפית ל- NETs12.

אנו13 ואחרים1,2 פיתחנו בדיקה רגישה ואמינה ביותר למדידת רכיבי NET במחזור, MPO-conjugated או NE-conjugated DNA, בפלזמה אנושית עם טכניקת ELISA שונה המשתמשת בנוגדנים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. בדיקה זו יכולה לשמש גם ex vivo כדי לזהות רכיבי NET בסופרנאטנטים של תרביות תאים המשתחררים על ידי נויטרופילים פעילים בתגובה לגירוי phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם להצהרת הלסינקי ואושר על ידי מועצות הסקירה המוסדיות של האוניברסיטה הרפואית אאיצ'י (2017-H341, 2019-H137). התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל משתתף.

1. הכנת מגיב

הערה: כדי לבצע את בדיקת הכריך ELISA, הריאגנטים מוכנים כמתואר להלן.

  1. חיץ ציפוי:
    1. כדי ליצור חיץ של 0.1 mol/L קרבונט-ביקרבונט, שקול 10.6 גרם נתרן פחמתי נטול מים (משקל מולקולרי, 106 גרם/מול) ו-8.4 גרם נתרן ביקרבונט (משקל מולקולרי, 84 גרם/מול).
    2. מוסיפים אותו לכ-900 מ"ל מים מזוקקים בכד.
    3. התאם את ה- pH של המאגר ל- 9.6 על ידי הוספת הכמות הנדרשת של חומצה הידרוכלורית מדוללת או נתרן הידרוקסידי.
    4. בדוק את ה- pH עם מד pH.
    5. לאחר מכן, הוסף את הנפח הנדרש של מים מזוקקים כדי להגיע לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
    6. אחסנו מאגר זה של 0.1 מול/ליטר פחמתי-ביקרבונט במקרר בטמפרטורה של 4°C.
  2. חיץ חוסם:
    1. הוסף כ-250 מיקרוליטר של 20% נתרן אזיד ו-1 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-70 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המורכב מ-137 mmol / L NaCl, 8.1 mmol / L Na 2 HPO 4, 2.68 mmol/ L KCl ו- 1.47 mol/L KH2PO 4 (pH7.4), וערבב בעדינות.
    2. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע לנפח כולל של 100 מ"ל. הריכוזים הסופיים של אלבומין בסרום בקר ונתרן אזיד הם 1% ו-0.05%, בהתאמה. המתן 10 דקות, ואז הפתרון מוכן לשימוש.
  3. תמיסת כביסה: הכינו 0.5% t-אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול, אתר פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל (Triton X-100) במים מזוקקים.
    1. יש לדלל 100% Triton X-100 עד 10% במים מזוקקים, ולאפשר לתמיסה 10% לעמוד יום אחד לפני השימוש.
    2. לאחר מכן, דללו מחדש את תמיסת 10% Triton X-100 פי 20 עם מים מזוקקים כדי להשיג ריכוז של 0.5%.
  4. דילול נוגדנים:
    1. יש לדלל את נוגדן הלכידה (נוגדן אנטי-MPO [1 מ"ג/מ"ל] או נוגדן אנטי-NE [1 מ"ג/מ"ל]) ל-1:2,000 במאגר הציפוי (pH 9.6) לפני השימוש ביום הראשון של הבדיקה (ראה להלן) ואת נוגדן הזיהוי (נוגדן אנטי-DNA מצומד לפרוקסידז) ל-1:40 עם PBS לפני השימוש ביום השלישי של הבדיקה (ראה להלן).
      הערה: לצורך הניסוי הראשוני, דללו את הנוגדנים מסוג ISO (ארנב IgG [5 מ"ג/מ"ל] ושיבוט עכבר IgG1 Ci4 [0.5 מ"ג/מ"ל]) ל-1:10,000 ו-1:1,000 במאגר הציפוי (pH 9.6).
  5. תמיסת מצע ABTS: בהתאם למספר הדגימות, יש להמיס אחת, שתיים או שלוש טבליות 2,2'-azino-bis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) ב-5 מ"ל, 10 מ"ל או 15 מ"ל של מאגר ABTS (המכיל נתרן פרבוראט, חומצת לימון ודיסודיום מימן פוספט); יש צורך ב-100 μL לכל דגימה. אחסנו את התמיסה המוכנה בטמפרטורה של 2-8°C כשהיא מוגנת מפני אור. הפתרון יציב עד 3 חודשים.

2. איסוף ואחסון דוגמאות

  1. בידוד פלזמה:
    1. לאסוף 4 מ"ל של דגימות דם היקפיות לתוך צינור ליתיום הפרין איסוף דם על ידי ניקור עם מזרק 22 G, וצנטריפוגה ב 1,600 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    2. העבירו את הסופרנאטנט לצינור דגימה בעל מנעול כספת בנפח 2 מ"ל.
    3. צנטריפוגה מחדש של הסופרנאטנט ב 16,000 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים שיורית.
    4. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינור דגימה חדש לנעילה בטוחה מבלי להפריע לגלולה בתחתית הצינור.
    5. יש לאחסן את הפלזמה המתקבלת בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
      הערה: כדי להשיג תוצאות תפוקה גבוהה עם בדיקה זו, נדרשות דגימות באיכות טובה. אם נעשה שימוש בדגימות פלזמה, בצע צנטריפוגה שנייה כדי להסיר תאים שיורית. הימנעו מהפשרה חוזרת ונשנית של הדגימות. השתמש הפרין כמו נוגד קרישה כי EDTA משפיע על פעילות DNase.
  2. בידוד נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים
    1. לאסוף את דגימות הדם ההיקפיות לתוך צינור ליתיום הפרין איסוף דם על ידי venipuncture עם מזרק 22 G.
    2. שכבה 6 מ"ל של דם על 6 מ"ל של פולימורפים בצעד אחד, וצנטריפוגה את הצינורות ב 1,000 x גרם במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. קצרו את שכבת הפרווה השלישית המכילה נויטרופילים, ושטפו אותה שלוש פעמים ב-RPMI-1640 ללא אדום פנול במהירות של 400 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.
    4. יש להשהות מחדש את הנויטרופילים בסל"ד אדום פנול ללא RPMI-1640 המכיל 2 מילימטר L-גלוטמין בתוספת 6% נסיוב בקר עוברי מומת חום, ולספור את התאים בשדה המיקרוסקופ עם המוציטומטר.
      הערה: שיטה זו מניבה טוהר של 96% עד 98% עם כדאיות של יותר מ- 95%, כפי שהוערך על ידי אי הכללת צבע כחול טריפאן.
  3. הפעלה של נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים ו- NETosis in vitro
    1. לדלל נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים טריים שבודדו ל-1 × 105 תאים/מ"ל בפנול ללא אדום RPMI-1640 המכיל 2 mM L-גלוטמין בתוספת 6% סרום בקר עוברי מומת חום, ולזרוע אותם בצלחות תרבית 35 מ"מ.
    2. כדי לגרום ל-NETs, לעורר נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים עם PMA של 25 ננומטר למשך 4 שעות ב-37°C ב-5% CO2/95% אוויר.
    3. לאחר 4 שעות של דגירה, לעכל חלקית את ה- NETs על ידי הוספת 0.6 מיקרוגרם / מ"ל DNase I ישירות לצלחות התרבית למשך 15 דקות ב- RT, ולהפסיק את פעילות DNase I על ידי הוספת 5 mM EDTA.
    4. אסוף את המדיום המכיל את רשתות המסונתזות, וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את פסולת התא.
    5. השיגו את הסופרנאטנטים מארבע בקרות בריאות, ערבבו ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
      הערה: נויטרופילים המעוכלים על ידי PMA המעוכלים על ידי DNase המתקבלים מארבע בקרות בריאות משמשים כתקן NET 1,14,15. צור עקומת כיול מהתקן NET בדילול סדרתי עם PBS, והקצה את ערכי הצפיפות האופטית (OD) המתקבלים מתקן NET לא מדולל כ- 100% NET.

3. שיטת Assay

הערה: השלבים לביצוע הבדיקה מתוארים בפירוט להלן.

  1. יום 1
    1. החל סך של 100 μL של נוגדן מדולל anti-MPO או anti-NE המכיל 0.05 מיקרוגרם של נוגדן על כל באר של הצלחת, כולל הבאר הריקה.
      הערה: חיץ הציפוי אינו יכול להכיל כל סוג של חומר ניקוי מכיוון שאחרת, הנוגדנים עלולים שלא להיקשר באופן שווה וחלק לדפנות של כל באר. כדי למנוע את אפקט הוו, ריכוז חלבון הציפוי לא חייב להיות יותר מ -20 מיקרוגרם / מ"ל, מכיוון שריכוזים מעל רמה זו ירוו את רוב האתרים הזמינים על לוח המיקרוטייטר. טווח הריכוז האופייני של תמיסות ציפוי חלבון הוא 2-10 מיקרוגרם/מ"ל. עבור הניסוי הראשוני, השתמש נוגדן בקרה מדולל מסוג ISO IgG ארנב לציפוי במקום נוגדנים חד שבטיים ספציפיים נגד MPO. השתמש בעכבר נוגדן בקרה מסוג ISO מדולל IgG1 לציפוי במקום נוגדנים חד שבטיים ספציפיים נגד NE.
    2. מכסים את הצלחת בכיסוי פלסטיק דביק כדי למנוע אידוי של הדגימה, ודגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר קשירה של נוגדני הלכידה.
  2. יום 2
    1. השליכו את תמיסת הנוגדנים המדוללת מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר, וחזרו על הליך כביסה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    2. הסר עודפי PBS על ידי הקשה יבשה על הצלחת על מגבת נייר.
    3. חסום כל באר של צלחת ELISA עם 200 μL של מאגר החסימה.
    4. מכסים את הצלחת היטב בכיסוי פלסטיק דביק, ודגרים עליה במשך 1.5-2 שעות ב- RT כדי לחסום את הבארות.
    5. השליכו את תמיסת החסימה לחלוטין מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר, וחזרו על הליך שטיפה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    6. הסר עודפי PBS על ידי הקשה יבשה על הצלחת על מגבת נייר.
    7. החל סך של 25 μL של פלזמה או בינוני על כל באר למעט באר ריקה, ולהוסיף 75 μL של PBS כמו מדלל כדי להפוך את נפח הסופי 100 μL; הוסף 100 μL של PBS לבאר הריקה.
    8. לאחר מכן, ערבבו את הדגימות ב-RT במשך 10 שניות על ידי הנחת הצלחת על שייקר ב-250 סל"ד.
    9. יש למרוח 2 μL של DNase I מדולל פי 100 (0.03 מ"ג/מ"ל) על כל באר, כולל הבאר הריקה (ריכוז סופי של DNase I בתערובת התגובה: 0.6 מיקרוגרם/מ"ל).
    10. אטמו את הצלחת עם כיסוי פלסטיק דביק, וערבבו היטב את הדגימות ב-RT במשך 10 שניות על ידי הנחת הצלחת על שייקר ב-250 סל"ד.
      הערה: כדי להעריך את התנאים האופטימליים לעיכול DNA, בעת פיתוח הבדיקה, דגרנו על דגימות המכילות DNA הקשור ל- MPO מחולים עם COVID-19 עם 0-0.9 מיקרוגרם / מ"ל DNase I במשך 15 דקות ב- RT והשתמשנו בצלחות מצופות בנוגדן לכידה ספציפי עבור MPO או נוגדן בקרה מסוג ISO תואם מין.
    11. דגרו על הדגימות במשך 15 דקות ב- RT.
    12. הסר את כיסוי הפלסטיק הדביק, והחל 1 μL של 0.5 M EDTA על כל באר כדי לעצור את תגובת DNase.
    13. אטמו מחדש את הצלחת עם כיסוי פלסטיק דביק, ונערו אותה ב-RT למשך 15 שניות על ידי הנחתה על שייקר ב-250 סל"ד.
    14. לאחר מכן, דגרו על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר לרכיבי החלבון של ה-NETs להיצמד לנוגדנים שנלכדו.
  3. יום 3
    1. הסירו את מכסה הפלסטיק הדביק, והשליכו את התמיסה מהבארות.
    2. השליכו את התמיסה לחלוטין מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת השטיפה לכל באר, וחזרו על הליך כביסה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    3. החל סך של 100 μL של נוגדן אנטי DNA מצומד peroxidase מצומד על כל באר.
    4. אטמו היטב את הצלחת עם כיסוי פלסטיק דביק, ודגרו עליה במשך שעה וחצי ב-RT.
    5. השליכו את התמיסה לחלוטין מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר, וחזרו על הליך כביסה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    6. הסר בזהירות את התמיסה השיורית.
    7. יש למרוח על כל באר סך של 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע ABTS, ולכסות את הצלחת בכיסוי פלסטיק דביק.
    8. דוגרים על הצלחת בחושך ב-RT למשך 20-30 דקות על שייקר ב-250 סל"ד.
      הערה: נטר את הצלחת במרווחים של 5 דקות עד לקבלת קריאות OD רצויות.
    9. הוסף סך של 50 μL של 2 M חומצה גופרתית כדי לעצור את התגובה.
    10. מערבבים את התוכן הנוזלי של הבארות על ידי הקשה בזהירות על הצד של הצלחת.
    11. הפעל את קורא המיקרו-לוחות וחבר אותו למחשב.
    12. פתח את יישום התוכנה במחשב.
    13. בשורת המצב, צור ניסוי חדש ותן לו שם.
    14. הגדר את כל הפרמטרים הבאים לקריאת לוחות: סוג קריאה, ספיגה; מצב קריאה, נקודת קצה; אורכי גל, 2; Lm-1, 405 ננומטר; Lm-2, 490 ננומטר; ערבוב אוטומטי וריקון לפני, כבוי; צלחת קריאה מראש, כבוי; כיול אוטומטי, מופעל; רצועות, לקרוא צלחת שלמה; עדיפות אורך גל עמודה, עדיפות עמודה; מהירות הכרכרה, רגילה; וקריאה אוטומטית, כבוי.
    15. לאחר מכן, הכניסו את צלחת 96 הבאר המכילה את הדגימות למגירה וסגרו אותה.
    16. לבסוף, בחר בלחצן קרא כך שהלוח ייקרא מיד.
    17. קרא את הבליעה של כל באר באורך גל של 405 ננומטר באמצעות קורא microplate (בשלב זה, השתמש באורך גל של 490 ננומטר כהפניה).
    18. בצע חיסור אוטומטי של ערך הספיגה של מדיום הבדיקה בלבד מכל הדגימות הלא ידועות, ושמור את הנתונים.
      הערה: השתמש בעקומה סטנדרטית המתקבלת מהתקן NET בדילול סדרתי כדי לחשב את הריכוז היחסי של NET במדגם 1,14,15. כאן, התוצאות הסופיות מוצגות כ"קומפלקסים MPO או NE-DNA (% מסטנדרט NET)". גבול הגילוי (LOD) חושב מתוך סטיית התקן (SD) ושיפוע עקומת הכיול (S) באופן הבא: LOD = 3.3(SD/S).

4. סטטיסטיקה

  1. לבצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית מתאימה. כאן SigmaPlot v14.5 שימש. אחוזים ומשתנים רציפים מוצגים כחציון עם הטווח הבין-רבעוני עקב ההתפלגות המוטה של רוב הפרמטרים.
  2. השווה את רמות MPO-DNA ו- NE-DNA בפלזמה בין חולי COVID-19 לבקרות בריאות באמצעות מבחן סכום הדירוג של Wilcoxon. השתמש בניתוח מתאם כדי לחקור את הקשר בין צפיפות אופטית לבין אחוז תקן NET.

תוצאות

שיטה זו השתמשה בכריך ELISA עם נוגדנים חד-שבטיים אנטי-MPO, אנטי-NE ואנטי-דנ"א כדי למדוד דנ"א הקשור ל-MPO ול-NE (איור 1). בשיטה זו, הבארות של צלחת מיקרוטיטר צופו בנוגדן חד-שבטי ספציפי ל-MPO או NE ספציפי כדי ללכוד MPO הקשור ל-DNA ו-NE הקשור ל-DNA, כמו גם MPO ו-NE שאינם קשורים ל-DNA. כדי לחשב את מקדם השונות ?...

Discussion

תיארנו שיטת סנדוויץ' ELISA שבה MPO או NE נקשרים לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. לאחר השטיפה, "הכריך" הושלם על ידי דגירה של הדגימות עם נוגדן חד שבטי הקשור לפרוקסידז נגד DNA. לאחר הסרת נוגדן משני לא קשור, מצומד הפרוקסידז הכבול מזוהה על ידי תוספת של מצ...

Disclosures

כל הנתונים שנוצרו ו / או נותחו במהלך מחקר זה כלולים במאמר זה שפורסם. המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מודים לד"ר הוק מוחמד אמינול על סיועו בעיון בכתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step PolymorphsAccurate Chemical and Scientific CorporationAN221725Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plateThermo Fisher Scientific467466flat bottom
ABTS buffer solutionSigma-Aldrich Merck11 204 530 001Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tabletsSigma-Aldrich Merck11 204 521 001 Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, AxygenThermo Fisher Scientific14222348
Anti-MPO antibodySigma-Aldrich Merck 07-496-IStore at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10Sigma-Aldrich MerckMABS461Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albuminBiomedical ScienceBR-220700081Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase INew England BioLabsM0303MStore at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype ControlGENETEX, Inc.GTX35035Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4Merck MABC002Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tubeBecton Dickinson and Company
Microplate mixerAs one corporationNS-P
Microplate ReaderMolecular DevicesSpectraMax 190 Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader applicationMolecular DevicesSoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISARoche Diagnostics1154467500 bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-Aldrich MerckP8139Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solutionTakara BioT9181Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5 Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azideFujifilm Wako Chemicals190-14901Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl etherFujifilm Wako Chemicals9002-93-1Store at room temperature.

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved