Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Özet

Aktive edilmiş nötrofillerden türetilen nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarının, miyeloperoksidaz konjuge DNA ve nötrofil elastaz konjuge DNA komplekslerinin iki bileşenini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent test tekniği için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mikroorganizmalar gibi bazı uyaranlar, nötrofillerin, temel olarak miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) gibi granül proteinli DNA'dan ve sitoplazmik ve hücre iskeleti proteinlerinden oluşan ağ benzeri yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) serbest bırakmasına neden olur. Son zamanlarda NET'lere olan ilgi artmış olsa da, klinik ortamlarda NET'leri ölçmek için hassas, güvenilir bir test yöntemi mevcut değildir. Bu makalede, NET'lerin spesifik bileşenleri olan ve NET'lerin parçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınan dolaşımdaki NET'lerin iki bileşenini, MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent testi açıklanmaktadır. Test, yakalama antikorları ve DNA'ya özgü bir tespit antikoru olarak MPO veya NE için spesifik monoklonal antikorlar kullanır. MPO veya NE, MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında yakalama antikorunun bir bölgesine bağlanır. Bu tahlil, iyi doğrusallık ve yüksek tahliller arası ve tahlil içi hassasiyet gösterir. Eşlik eden akut solunum sıkıntısı sendromu olan COVID-19'lu 16 hastada kullandık ve MPO-DNA ve NE-DNA'nın plazma konsantrasyonlarının sağlıklı kontrollerden elde edilen plazmadan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk. Bu tespit testi, insan plazması ve kültür süpernatantlarındaki NET'lerin özelliklerini araştırmak için güvenilir, oldukça hassas ve kullanışlı bir yöntemdir.

Giriş

Bu makale, DNA ^1,2 ile miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) komplekslerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak biyolojik sıvılarda nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumunu ölçmek için bir yöntemi özetlemektedir. NET'ler, nötrofil granüllerinden kaynaklanan antimikrobiyal proteazlarla süslenmiş bir DNA omurgasından oluşur ^3,4. Hem MPO-DNA hem de NE-DNA kompleksleri, NET'lerin önemli ve spesifik bileşenleridir ve NET'lerin^parçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınır ^3,4.

Antimikrobiyal savunmadaki önemli fizyolojik rollerinin³ yanı sıra, NET'lerin trombogenezin⁶ teşviki ve sepsisin^{kötüleşmesi 7} dahil olmak üzere çeşitli patolojik etkileri de vardır ^4,5. Bu doğrultuda, NET'ler son zamanlarda dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, NET'lerin in vivo kantitifikasyonu, hassas, güvenilir bir kantitatif test yönteminin olmaması nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır.

NET'lerin floresan mikroskobu^8,9 ve akış sitometrisi 10 ile doğrudan ölçümü ve dolaşımdaki hücresiz DNA, nükleozomlar ve sitrüline histon H3'ün dolaylı ölçümü dahil olmak üzere birkaç yöntem mevcuttur^, ancak her yöntemin kendi avantajları ve sınırlamaları^{vardır 11}. İmmünofloresan mikroskobik yöntem NET'lere özgü olmasına ve NET oluşumunun lokalizasyonunu ve derecesini net olarak göstermesine rağmen, örnekler biyopsi dokusu ve salgılanan materyallerle sınırlıdır. Üstelik bu yöntemin yetenekli araştırmacılar tarafından yapılması gerekiyor ve sonuçların elde edilmesi uzun zaman alıyor. NET ile ilgili bileşenlerin dolaşımdaki seviyelerinin akış sitometrisi ile ölçülmesi kolaydır ve hızlı bir şekilde sonuç verir; ancak, yöntem NET^12'ye özgü değildir.

Biz¹³ ve diğerleri^1,2, yakalama antikorları olarak MPO veya NE için spesifik antikorlar ve DNA'ya özgü bir tespit antikoru kullanan modifiye edilmiş bir ELISA tekniği ile insan plazmasında dolaşımdaki NET bileşenlerini^, MPO-konjuge veya NE-konjuge DNA'yı ölçmek için oldukça hassas ve güvenilir bir test geliştirdik. Bu test, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) stimülasyonuna yanıt olarak aktive edilmiş nötrofiller tarafından salınan hücre kültürü süpernatantlarındaki NET bileşenlerini tanımlamak için ex vivo olarak da kullanılabilir.

Protokol

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütülmüş ve Aichi Tıp Üniversitesi kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır (2017-H341, 2019-H137). Her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Reaktif hazırlama

NOT: Sandviç ELISA testini gerçekleştirmek için reaktifler aşağıda açıklandığı gibi hazırlanır.

1. Kaplama tamponu:
   1. 0,1 mol/L karbonat-bikarbonat tamponu yapmak için 10,6 g susuz sodyum karbonat (moleküler ağırlık, 106 g/mol) ve 8,4 g sodyum bikarbonat (moleküler ağırlık, 84 g/mol) tartın.
   2. Bir beherde yaklaşık 900 mL damıtılmış suya ekleyin.
   3. Gerekli miktarda seyreltilmiş hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ekleyerek tamponun pH'ını 9.6'ya ayarlayın.
   4. pH'ı bir pH metre ile kontrol edin.
   5. Ardından, toplam 1.000 mL hacim elde etmek için gerekli hacimde damıtılmış su ekleyin.
   6. Bu 0.1 mol/L karbonat-bikarbonat tamponunu buzdolabında 4 °C'de saklayın.
2. Engelleme tamponu:
   1. 137 mmol/L NaCl, 8.1 mmol/_LNa2HPO4, 2.68 mmol/L KCl ve 1.47 mol/L KH₂PO 4 (pH _7.4) ve 1.47 mol/L KH'den oluşan 70 mL fosfat tamponlu saline (PBS) yaklaşık 250 μL %20 sodyum azid ve 1 g sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
   2. Toplam 100 mL hacim elde etmek için damıtılmış su ekleyin. Sığır serum albümini ve sodyum azidin nihai konsantrasyonları sırasıyla% 1 ve% 0.05'tir. 10 dakika bekleyin, ardından çözelti kullanıma hazırdır.
3. Yıkama çözeltisi: Damıtılmış suda% 0.5 t-oktilfenoksipolietoksietanol, polietilen glikol tert-oktilfenil eter (Triton X-100) hazırlayın.
   1. % 100 Triton X-100'ü% 10'a damıtılmış suyla seyreltin ve% 10'luk çözeltiyi kullanmadan önce 1 gün bekletin.
   2. Ardından, %0,5'lik bir konsantrasyon elde etmek için %10'luk Triton X-100 çözeltisini 20 kat damıtılmış suyla yeniden seyreltin.
4. Antikor dilüsyon:
   1. Yakalama antikorunu (anti-MPO antikoru [1 mg / mL] veya anti-NE antikoru [1 mg / mL]) testin 1. gününde kullanmadan önce kaplama tamponunda (pH 9.6) 1: 2.000'e seyreltin (aşağıya bakınız) ve tespit antikoru (peroksidaz-konjuge anti-DNA antikoru) testin 3. gününde kullanmadan önce PBS ile 1:40'a kadar (aşağıya bakınız).
      NOT: Ön deney için, izo-tipi antikorları (IgG tavşanı [5 mg / mL] ve IgG1 fare klonu Ci4 [0.5 mg / mL]) kaplama tamponunda 1: 10.000 ve 1: 1.000'e seyreltin (pH 9.6).
5. ABTS substrat çözeltisi: Numune sayısına bağlı olarak, bir, iki veya üç 2,2'-azino-bis(3 etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS) tabletini 5 mL, 10 mL veya 15 mL ABTS tamponunda çözün (sodyum perborat, sitrik asit ve disodyum hidrojen fosfat içerir); numune başına 100 μL gereklidir. Hazırlanan çözeltiyi ışıktan koruyarak 2-8 ° C'de saklayın. Çözelti 3 aya kadar stabildir.

2. Numune toplama ve saklama

1. Plazma izolasyonu:
   1. 22 G'lik bir şırınga ile damar delinerek bir lityum heparin kan alma tüpüne 4 mL periferik kan örneği toplayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı 2 mL'lik güvenli kilitli bir numune tüpüne aktarın.
   3. Kalıntı hücreleri çıkarmak için süpernatanı 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yeniden santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı, tüpün altındaki peleti bozmadan yeni bir güvenli kilitli numune tüpüne toplayın.
   5. Elde edilen plazmayı daha fazla kullanana kadar −80 °C'de saklayın.
      NOT: Bu tahlil ile yüksek verimli sonuçlar elde etmek için kaliteli numuneler gereklidir. Plazma örnekleri kullanılıyorsa, kalan hücreleri çıkarmak için ikinci bir santrifüjleme gerçekleştirin. Numunelerin tekrar tekrar çözülmesinden kaçının. Antikoagülan olarak heparin kullanın, çünkü EDTA DNaz aktivitesini etkiler.
2. Polimorfonükleer nötrofillerin izolasyonu
   1. Periferik kan örneklerini 22 G'lik bir şırınga ile damar delinerek bir lityum heparin kan alma tüpüne toplayın.
   2. 6 mL kanı 6 mL tek adımlı polimorflar üzerine katmanlayın ve tüpleri oda sıcaklığında (RT) 45 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
   3. Nötrofiller içeren üçüncü buffy coat tabakasını hasat edin ve RT'de 10 dakika boyunca fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta 400 x g'da üç kez yıkayın.
   4. Nötrofilleri, %6 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile desteklenmiş 2 mM L-glutamin içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta yeniden süspanse edin ve mikroskop alanındaki hücreleri bir hemositometre ile sayın.
      NOT: Bu yöntem, tripan mavisi boya hariç tutma ile değerlendirildiği gibi, %95'ten fazla canlılık ile %96 ila %98 saflık sağlar.
3. Polimorfonükleer nötrofillerin ve NETosis'in in vitro aktivasyonu
   1. Taze izole edilmiş polimorfonükleer nötrofilleri, %6 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 2 mM L-glutamin içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta 1 ×^{10 5} hücre/mL'ye seyreltin ve 35 mm'lik kültür kaplarında tohumlayın.
   2. NET'leri indüklemek için, polimorfonükleer nötrofilleri 25 nM PMA ile 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO₂/95% havada uyarın.
   3. 4 saatlik inkübasyondan sonra, RT'de 15 dakika boyunca doğrudan kültür kaplarına 0.6 μg/mL DNaz I ekleyerek NET'leri kısmen sindirin ve 5 mM EDTA ekleyerek DNaz I aktivitesini durdurun.
   4. Sentezlenen NET'leri içeren ortamı toplayın ve hücre kalıntılarını gidermek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanları dört sağlıklı kontrolden alın, karıştırın ve kullanana kadar −80 °C'de saklayın.
      NOT: Dört sağlıklı kontrolden elde edilen DNaz sindirilmiş PMA ile uyarılmış nötrofiller, NET standardı 1,14,15 olarak kullanılır. PBS ile seri olarak seyreltilmiş bir NET standardından bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve seyreltilmemiş bir NET standardından elde edilen optik yoğunluk (OD) değerlerini %100 NET olarak atayın.

3. Tahlil yöntemi

NOT: Testi gerçekleştirme adımları aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. 1. Gün
   1. Boş kuyucuk da dahil olmak üzere plakanın her bir oyuğuna toplam 100 μL seyreltilmiş anti-MPO veya 0.05 μg antikor içeren anti-NE antikoru uygulayın.
      NOT: Kaplama tamponu herhangi bir deterjan içermemelidir, aksi takdirde antikorlar her bir oyuğun duvarlarına eşit ve düzgün bir şekilde bağlanmayabilir. Kanca etkisini önlemek için, kaplama proteini konsantrasyonu 20 μg/mL'den fazla olmamalıdır, çünkü bu seviyenin üzerindeki konsantrasyonlar mikrotitre plakasındaki mevcut bölgelerin çoğunu doyuracaktır. Protein kaplama çözeltilerinin tipik konsantrasyon aralığı 2-10 μg/mL'dir. Ön deney için, MPO'ya karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine kaplama için seyreltilmiş izo-tip kontrol antikoru IgG tavşanı kullanın. NE'ye karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine kaplama için seyreltilmiş izo tipi kontrol antikoru IgG1 faresi kullanın.
   2. Numunenin buharlaşmasını önlemek için plakayı yapışkan plastik bir kapakla örtün ve yakalama antikorlarının bağlanmasına izin vermek için gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
2. 2. Gün
   1. Seyreltilmiş antikor çözeltisini kuyucuklardan atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama çözeltisi pipetleyin ve bu yıkama prosedürünü üç ila dört kez tekrarlayın.
   2. Plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayarak fazla PBS'yi çıkarın.
   3. ELISA plakasının her bir kuyusunu 200 μL bloke edici tampon ile bloke edin.
   4. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla sıkıca örtün ve kuyucukları tıkamak için RT'de 1.5-2 saat inkübe edin.
   5. Engelleme solüsyonunu kuyucuklardan tamamen atın ve ardından kuyucuk başına 300 μL yıkama solüsyonu pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.
   6. Plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayarak fazla PBS'yi çıkarın.
   7. Boş kuyu hariç her bir oyuğa toplam 25 μL plazma veya ortam uygulayın ve son hacmi 100 μL yapmak için seyreltici olarak 75 μL PBS ekleyin; boş kuyuya 100 μL PBS ekleyin.
   8. Ardından, plakayı 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri RT'de 10 saniye karıştırın.
   9. Boş kuyucuk da dahil olmak üzere her bir oyuğa 2 μL 100 kat seyreltilmiş DNaz I (0.03 mg/mL) uygulayın (reaksiyon karışımındaki DNaz I'in nihai konsantrasyonu: 0.6 μg/mL).
   10. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla kapatın ve plakayı 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri RT'de 10 saniye boyunca iyice karıştırın.
       NOT: DNA sindirimi için optimum koşulları değerlendirmek için, testi geliştirirken, COVID-19'lu hastalardan MPO ile ilişkili DNA içeren numuneleri RT'de 0-0.9 μg/mL DNaz I ile 15 dakika inkübe ettik ve MPO için spesifik yakalama antikoru veya türle uyumlu bir izo tipi kontrol antikoru ile kaplanmış plakalar kullandık.
   11. Numuneleri RT'de 15 dakika inkübe edin.
   12. Yapışkan plastik kapağı çıkarın ve DNaz reaksiyonunu durdurmak için her bir oyuğa 1 μL 0,5 M EDTA uygulayın.
   13. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla tekrar kapatın ve 250 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirerek RT'de 15 saniye çalkalayın.
   14. Daha sonra, NET'lerin protein bileşenlerinin yakalama antikorlarına bağlanmasına izin vermek için plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
3. 3. Gün
   1. Yapışkan plastik kapağı çıkarın ve çözeltiyi kuyulardan atın.
   2. Çözeltiyi kuyucuklardan tamamen atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama solüsyonu pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.
   3. Her bir oyuğa toplam 100 μL seyreltilmiş peroksidaz konjuge anti-DNA tespit antikoru uygulayın.
   4. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla sıkıca kapatın ve RT'de 1,5 saat inkübe edin.
   5. Çözeltiyi kuyulardan tamamen atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama çözeltisi pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.
   6. Kalan çözeltiyi dikkatlice çıkarın.
   7. Her bir oyuğa toplam 100 μL ABTS substrat çözeltisi uygulayın ve plakayı yapışkan plastik bir örtü ile örtün.
   8. Plakayı karanlıkta RT'de 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 20-30 dakika inkübe edin.
      NOT: İstenen OD okumaları elde edilene kadar plakayı 5 dakikalık aralıklarla izleyin.
   9. Reaksiyonu durdurmak için toplam 50 μL 2 M sülfürik asit ekleyin.
   10. Kuyucukların sıvı içeriğini, plakanın kenarına dikkatlice vurarak karıştırın.
   11. Mikroplaka okuyucuyu açın ve bilgisayara bağlayın.
   12. Bilgisayardaki yazılım uygulamasını açın.
   13. Durum çubuğundan yeni bir deneme oluşturun ve adlandırın.
   14. Plaka okuması için aşağıdaki tüm parametreleri ayarlayın: Okuma tipi, Absorbans; Okuma modu, Uç nokta; Dalga boyları, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Otomatik karıştırma ve Boşaltma öncesi, Kapalı; Ön okuma plakası, Kapalı; Otomatik kalibrasyon, Açık; Şeritler, Tüm plakayı okuyun; Kolon dalga boyu önceliği, Kolon önceliği; Taşıma hızı, Normal; ve Otomatik okuma, Kapalı.
   15. Ardından, numuneleri içeren 96 oyuklu plakayı çekmeceye koyun ve kapatın.
   16. Son olarak, plakanın hemen okunması için Oku düğmesini seçin.
   17. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun absorbansını 405 nm dalga boyunda okuyun (bu aşamada referans olarak 490 nm dalga boyu kullanın).
   18. Bilinmeyen tüm numunelerden tek başına tahlil ortamının absorbans değerinin otomatik olarak çıkarılmasını sağlayın ve verileri kaydedin.
       NOT:^{Örnek 1,14,15'teki} NET'in nispi konsantrasyonunu hesaplamak için seri olarak seyreltilmiş NET standardından elde edilen standart bir eğri kullanın. Burada, nihai sonuçlar "MPO- veya NE-DNA kompleksleri (NET standardının %'si)" olarak sunulur. Algılama limiti (LOD), standart sapmadan (SD) ve kalibrasyon eğrisinin eğiminden (S) aşağıdaki gibi hesaplandı: LOD = 3.3(SD/S).

4. İstatistik

1. Uygun istatistiksel analiz yazılımını kullanarak tüm istatistiksel analizleri gerçekleştirin. Burada SigmaPlot v14.5 kullanıldı. Yüzdeler ve sürekli değişkenler, parametrelerin çoğunun çarpık dağılımı nedeniyle çeyrekler arası aralığa sahip medyan olarak gösterilir.
2. Wilcoxon sıra toplamı testini kullanarak COVID-19 hastaları ve sağlıklı kontroller arasındaki plazma MPO-DNA ve NE-DNA düzeylerini karşılaştırın. Optik yoğunluk ile NET standardının yüzdesi arasındaki ilişkiyi keşfetmek için korelasyon analizini kullanın.

Sonuçlar

Bu yöntem, MPO ile ilişkili ve NE ile ilişkili DNA'yı ölçmek için anti-MPO, anti-NE ve anti-DNA monoklonal antikorları olan bir sandviç ELISA kullandı (Şekil 1). Bu yöntemde, bir mikrotitre plakasının kuyucukları, DNA ile ilişkili MPO ve DNA ile ilişkili NE'nin yanı sıra DNA ile ilişkili olmayan MPO ve NE'yi yakalamak için MPO'ya özgü veya NE'ye özgü bir monoklonal antikor ile kaplandı. Test içi değişkenlik katsayısını (CV) hesaplamak için, COVID-19'lu hastal...

Tartışmalar

MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında MPO veya NE'nin yakalama antikorunun bir bölgesine bağlandığı bir sandviç ELISA yöntemini tanımladık. Yıkandıktan sonra, numunelerin peroksidaz ile ilişkili bir anti-DNA monoklonal antikoru ile inkübe edilmesiyle "sandviç" tamamlanır. Bağlanmamış sekonder antikorun çıkarılmasından sonra, bağlı peroksidaz konjugatı, 405 nm'de spektrofotometrik olarak okunabilen çözünür bir son ürün veren bir kromojenik ABTS per...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.