Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Resumo

Apresentamos um protocolo para uma técnica modificada de ensaio imunoenzimático em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de remanescentes de armadilhas extracelulares de neutrófilos, complexos de DNA conjugado à mieloperoxidase e DNA conjugado à elastase neutrofílica, derivados de neutrófilos ativados.

Resumo

Certos estímulos, como microrganismos, fazem com que os neutrófilos liberem armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que são basicamente estruturas semelhantes a teias compostas por DNA com proteínas de grânulos, como mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE), e proteínas citoplasmáticas e citoesqueléticas. Embora o interesse em NETs tenha aumentado recentemente, nenhum método de ensaio sensível e confiável está disponível para medir NETs em ambientes clínicos. Este artigo descreve um ensaio imunoenzimático modificado em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de NETs circulantes, complexos MPO-DNA e NE-DNA, que são componentes específicos de NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação de NETs. O ensaio utiliza anticorpos monoclonais específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção DNA-específico. MPO ou NE liga-se a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Este ensaio apresenta boa linearidade e alta precisão interensaio e intraensaio. Nós o usamos em 16 pacientes com COVID-19 com a síndrome do desconforto respiratório agudo associada e descobrimos que as concentrações plasmáticas de MPO-DNA e NE-DNA eram significativamente mais altas do que no plasma obtido de controles saudáveis. Este ensaio de detecção é um método confiável, altamente sensível e útil para investigar as características das NETs em sobrenadantes de plasma e cultura humanos.

Introdução

Este artigo descreve um método para quantificar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NET) em fluidos biológicos usando ensaio imunoenzimático sanduíche (ELISA) para detectar complexos de mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE) com DNA ^1,2. As NETs são compostas por uma espinha dorsal de DNA decorada com proteases antimicrobianas originárias de grânulos de neutrófilos ^3,4. Tanto o MPO-DNA quanto o NE-DNA complexos são componentes importantes e específicos das NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação das NETs ^3,4.

Além de seu importante papel fisiológico na defesa antimicrobiana³, os TNEs também apresentam vários efeitos patológicos^4,5, incluindo a promoção da trombogênese⁶ e o agravamento da sepse⁷. Nesse sentido, as NETs vêm ganhando atenção recentemente. No entanto, a quantificação in vivo de NETs tem se mostrado desafiadora devido à falta de um método de ensaio quantitativo sensível e confiável.

Alguns métodos estão disponíveis, incluindo a medida direta de NETs por microscopia de fluorescência8,9 e citometria de fluxo10 e a medida indireta de DNA livre de células circulantes, nucleossomos e histona citrulinada H3^, mas cada método tem suas próprias vantagens e^{limitações11}. Embora o método microscópico de imunofluorescência seja específico para NETs e mostre claramente a localização e o grau de formação de NETs, as amostras são limitadas a tecido de biópsia e materiais secretados. Além disso, esse método precisa ser realizado por pesquisadores capacitados e requer muito tempo para que os resultados sejam obtidos. A medição dos níveis circulantes de componentes relacionados à NET por citometria de fluxo é fácil e fornece resultados rapidamente; no entanto, o método não é específico para NETs¹².

Nós¹³ e outros^1,2 desenvolvemos um ensaio altamente sensível e confiável para medir os componentes NET circulantes, DNA conjugado com MPO ou NE^, em plasma humano com uma técnica de ELISA modificada que usa anticorpos específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção específico para DNA. Este ensaio também pode ser usado ex vivo para identificar componentes NET em sobrenadantes de cultura celular liberados por neutrófilos ativados em resposta à estimulação com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).

Protocolo

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Declaração de Helsinque e foi aprovado pelos comitês de revisão institucional da Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante.

1. Preparação dos reagentes

NOTA: Para realizar o ensaio ELISA sanduíche, os reagentes são preparados conforme descrito abaixo.

1. Tampão de revestimento:
   1. Para fazer um tampão carbonato-bicarbonato 0,1 mol/L, pesar 10,6 g de carbonato de sódio anidro (peso molecular, 106 g/mol) e 8,4 g de bicarbonato de sódio (peso molecular, 84 g/mol).
   2. Adicione a aproximadamente 900 mL de água destilada em um copo.
   3. Ajustar o pH do tampão para 9,6 adicionando a quantidade necessária de ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio.
   4. Verifique o pH com um medidor de pH.
   5. Em seguida, adicione o volume necessário de água destilada para atingir um volume total de 1.000 mL.
   6. Conservar este tampão carbonato-bicarbonato 0,1 mol/L no frigorífico a 4 °C.
2. Buffer de bloqueio:
   1. Adicionar aproximadamente 250 μL de azida sódica a 20% e 1 g de albumina de soro bovino (BSA) a 70 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) composta por 137 mmol/L de NaCl, 8,1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol/L de KCl e 1,47 mol/L de KH₂PO 4 (pH_7,4) e misturar delicadamente.
   2. Adicionar água destilada para atingir um volume total de 100 mL. As concentrações finais de albumina sérica bovina e azida sódica são de 1% e 0,05%, respectivamente. Aguarde 10 minutos e, em seguida, a solução está pronta para uso.
3. Solução de lavagem: Preparar 0,5% t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenoglicol terc-octilfenil éter (Triton X-100) em água destilada.
   1. Diluir 100% Triton X-100 a 10% com água destilada e deixar a solução a 10% repousar 1 dia antes da utilização.
   2. Em seguida, diluir novamente a solução de Triton X-100 a 10% 20 vezes com água destilada para atingir uma concentração de 0,5%.
4. Diluição de anticorpos:
   1. Diluir o anticorpo de captura (anticorpo anti-MPO [1 mg/mL] ou anticorpo anti-NE [1 mg/mL]) para 1:2.000 no tampão de revestimento (pH 9,6) antes de usar no dia 1 do ensaio (veja abaixo) e o anticorpo de detecção (anticorpo anti-DNA conjugado à peroxidase) para 1:40 com PBS antes do uso no dia 3 do ensaio (veja abaixo).
      NOTA: Para o experimento preliminar, diluir os anticorpos do tipo iso (IgG coelho [5 mg/mL] e IgG1 clone de camundongo Ci4 [0,5 mg/mL]) para 1:10.000 e 1:1.000 no tampão de revestimento (pH 9,6).
5. Solução de substrato ABTS: Dependendo do número de amostras, dissolver um, dois ou três comprimidos de 2,2'-azino-bis(3 etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS) em 5 mL, 10 mL ou 15 mL de tampão ABTS (contendo perborato de sódio, ácido cítrico e hidrogenofosfato dissódico); 100 μL são necessários por amostra. Conservar a solução preparada a 2-8 °C protegida da luz. A solução é estável por até 3 meses.

2. Coleta e armazenamento de amostras

1. Isolamento de plasma:
   1. Coletar 4 mL de amostras de sangue periférico em um tubo de coleta de sangue de heparina de lítio por punção venosa com seringa de 22 G e centrifugar a 1.600 x g por 10 min a 4 °C.
   2. Transfira o sobrenadante para um tubo de amostra de 2 mL com fechadura segura.
   3. Recentrifugar o sobrenadante a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para remover quaisquer células residuais.
   4. Recolher o sobrenadante num novo tubo de amostra com fecho seguro sem perturbar o pellet no fundo do tubo.
   5. Conservar o plasma obtido a −80 °C até nova utilização.
      NOTA: Para obter resultados de alto rendimento com este ensaio, amostras de boa qualidade são necessárias. Se forem utilizadas amostras de plasma, efectuar uma segunda centrifugação para remover quaisquer células residuais. Evitar descongelamentos repetidos das amostras. Use heparina como anticoagulante, pois o EDTA afeta a atividade da DNase.
2. Isolamento de polimorfonucleares neutrófilos
   1. Coletar as amostras de sangue periférico em um tubo de coleta de sangue de heparina de lítio por punção venosa com uma seringa de 22 G.
   2. Camada de 6 mL de sangue sobre 6 mL de polimorfos de uma etapa e centrifugar os tubos a 1.000 x g por 45 min à temperatura ambiente (TR).
   3. Colher a terceira camada de buffy coat contendo neutrófilos e lavá-la três vezes em RPMI-1640 livre de fenol vermelho a 400 x g por 10 min em TR.
   4. Ressuspender os neutrófilos em RPMI-1640 livre de fenol vermelho contendo 2 mM de L-glutamina suplementada com 6% de soro fetal bovino inativado pelo calor e contar as células no campo do microscópio com um hemocitômetro.
      NOTA: Este método produz 96% a 98% de pureza com viabilidade superior a 95%, conforme avaliado pela exclusão do corante azul de tripano.
3. Ativação de polimorfonucleares neutrófilos e NETosis in vitro
   1. Diluir os neutrófilos polimorfonucleares recém-isolados a 1 × 10⁵ células/mL em RPMI-1640 livre de fenol vermelho contendo 2 mM de L-glutamina suplementada com 6% de soro fetal bovino inativado pelo calor e semeá-los em placas de cultura de 35 mm.
   2. Para induzir NETs, estimular polimorfonucleares neutrófilos com PMA 25 nM por 4 h a 37 °C em 5% de CO₂/95% de ar.
   3. Após 4 h de incubação, digerir parcialmente as NETs adicionando 0,6 μg/mL de DNase I diretamente às placas de cultura por 15 min em TR e interromper a atividade da DNase I adicionando 5 mM de EDTA.
   4. Recolher o meio que contém os TNEs sintetizados e centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 °C para remover os detritos celulares.
   5. Obter os sobrenadantes de quatro controles saudáveis, misturar e armazenar a -80 °C até o uso.
      NOTA: Neutrófilos estimulados por PMA digeridos por DNase, obtidos de quatro controles saudáveis, são usados como padrão NET1,14,15. Gere uma curva de calibração a partir de um padrão NET diluído em série com PBS e atribua os valores de densidade óptica (OD) obtidos de um padrão NET não diluído como 100% NET.

3. Método de ensaio

NOTA: As etapas para executar o ensaio são descritas em detalhes abaixo.

1. Dia 1
   1. Aplicar um total de 100 μL de anticorpo anti-MPO ou anti-NE diluído contendo 0,05 μg de anticorpo em cada poço da placa, incluindo o poço em branco.
      NOTA: O tampão de revestimento não deve conter qualquer tipo de detergente porque, caso contrário, os anticorpos podem não se ligar igualmente e suavemente às paredes de cada poço. Para evitar o efeito gancho, a concentração de proteína de revestimento não deve ser superior a 20 μg/mL, pois concentrações acima desse nível saturarão a maioria dos locais disponíveis na placa de microtitulação. A faixa de concentração típica de soluções de revestimento proteico é de 2-10 μg/mL. Para o experimento preliminar, use o anticorpo controle IgG de coelho do tipo iso diluído para revestimento em vez de anticorpos monoclonais específicos contra MPO. Use camundongos IgG1 com anticorpo controle do tipo iso diluído para revestimento em vez de anticorpos monoclonais específicos contra NE.
   2. Cobrir a placa com uma tampa plástica adesiva para evitar a evaporação da amostra e incubar durante a noite a 4 °C para permitir a ligação dos anticorpos de captura.
2. Dia 2
   1. Eliminar a solução de anticorpos diluída dos poços e, em seguida, pipetar 300 μL de solução de lavagem por poço e repetir este procedimento de lavagem três a quatro vezes.
   2. Retire o excesso de PBS batendo o prato seco em um papel toalha.
   3. Bloquear cada poço da placa de ELISA com 200 μL do tampão de bloqueio.
   4. Cubra a placa com uma tampa plástica adesiva e incube-a por 1,5-2 h no TR para obstruir os poços.
   5. Eliminar completamente a solução de bloqueio dos poços e, em seguida, pipetar 300 μL de solução de lavagem por poço e repetir este procedimento de lavagem três a quatro vezes.
   6. Retire o excesso de PBS batendo o prato seco em um papel toalha.
   7. Aplicar um total de 25 μL de plasma ou meio em cada poço, exceto no poço em branco, e adicionar 75 μL de PBS como diluente para tornar o volume final de 100 μL; adicionar 100 μL de PBS ao poço em branco.
   8. Em seguida, misture as amostras em RT por 10 s colocando a placa em um agitador a 250 rpm.
   9. Aplicar 2 μL de DNase I 100 vezes diluída (0,03 mg/mL) em cada poço, incluindo o poço em branco (concentração final de DNase I na mistura de reação: 0,6 μg/mL).
   10. Sele a placa com uma tampa plástica adesiva e misture bem as amostras em RT por 10 s, colocando a placa em um agitador a 250 rpm.
       NOTA: Para avaliar as condições ideais para a digestão do DNA, ao desenvolver o ensaio, incubamos amostras contendo DNA associado à MPO de pacientes com COVID-19 com 0-0,9 μg/mL DNase I por 15 minutos no RT e usamos placas revestidas com anticorpo de captura específico para MPO ou um anticorpo de controle de isotipo combinado com espécie.
   11. Incubar as amostras por 15 min em TR.
   12. Retire a tampa plástica adesiva e aplique 1 μL de EDTA 0,5 M em cada poço para interromper a reação de DNase.
   13. Volte a selar a placa com uma tampa plástica adesiva e agite-a em RT por 15 s, colocando-a em um agitador a 250 rpm.
   14. Em seguida, incubar a placa durante a noite a 4 °C para permitir que os componentes proteicos das NETs se liguem aos anticorpos de captura.
3. Dia 3
   1. Retire a tampa plástica adesiva e descarte a solução dos poços.
   2. Eliminar completamente a solução dos poços e, em seguida, pipetar 300 μL da solução de lavagem por poço e repetir este procedimento de lavagem três a quatro vezes.
   3. Aplicar um total de 100 μL do anticorpo anti-detecção de ADN conjugado com peroxidase diluído em cada poço.
   4. Sele a placa com uma tampa plástica adesiva e incube-a por 1,5 h no RT.
   5. Descarte completamente a solução dos poços e, em seguida, pipete 300 μL de solução de lavagem por poço e repita esse procedimento de lavagem de três a quatro vezes.
   6. Remova cuidadosamente a solução residual.
   7. Aplicar um total de 100 μL de solução de substrato ABTS em cada poço e cobrir a placa com uma tampa plástica adesiva.
   8. Incubar a placa no escuro em RT por 20-30 min em um agitador a 250 rpm.
      NOTA: Monitorar a placa em intervalos de 5 min até que as leituras OD desejadas sejam obtidas.
   9. Adicionar um total de 50 μL de ácido sulfúrico 2 M para interromper a reação.
   10. Misture o conteúdo líquido dos poços batendo cuidadosamente na lateral da placa.
   11. Ligue o leitor de microplacas e conecte-o ao computador.
   12. Abra o aplicativo de software no computador.
   13. Na barra de status, crie um novo experimento e nomeie-o.
   14. Defina todos os seguintes parâmetros para leitura da placa: Tipo de leitura, Absorbância; Modo de leitura, Endpoint; comprimentos de onda, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Auto mix & Blanking antes, Off; Placa de pré-leitura, Off; Auto calibração, On; Tiras, Ler chapa inteira; Prioridade de comprimento de onda da coluna, prioridade da coluna; Velocidade do carro Normal; e Leitura automática, Off.
   15. Em seguida, coloque a placa de 96 poços contendo as amostras na gaveta e feche-a.
   16. Por último, selecione o botão Ler para que a placa seja lida imediatamente.
   17. Leia a absorbância de cada poço em um comprimento de onda de 405 nm usando um leitor de microplacas (neste estágio, use um comprimento de onda de 490 nm como referência).
   18. Execute a subtração automática do valor de absorbância do meio de ensaio sozinho de todas as amostras desconhecidas e salve os dados.
       NOTA: Utilizar uma curva padrão obtida a partir do padrão NET diluído em série para calcular a concentração relativa de NET na amostra 1,14,15. Aqui, os resultados finais são apresentados como "complexos de MPO ou NE-DNA (% do padrão NET)". O limite de detecção (LOD) foi calculado a partir do desvio padrão (DP) e a inclinação da curva de calibração (S) da seguinte forma: LOD = 3,3(DP/S).

4. Estatísticas

1. Realizar todas as análises estatísticas utilizando um software de análise estatística apropriado. Aqui foi utilizado o SigmaPlot v14.5. As porcentagens e variáveis contínuas são apresentadas como mediana com o intervalo interquartil devido à distribuição assimétrica da maioria dos parâmetros.
2. Compare os níveis plasmáticos de MPO-DNA e NE-DNA entre pacientes COVID-19 e controles saudáveis usando o teste da soma de classificação de Wilcoxon. Use a análise de correlação para explorar a relação entre a densidade óptica e a porcentagem do padrão NET.

Resultados

Esse método utilizou um ELISA sanduíche com anticorpos monoclonais anti-MPO, anti-NE, e anti-DNA para medir o DNA associado à MPO e ao NE-associado (Figura 1). Neste método, os poços de uma placa de microtitulação foram revestidos com um anticorpo monoclonal específico para MPO ou NE-específico para capturar MPO associado ao DNA e NE, bem como MPO e NEs não associados ao DNA. Para calcular o coeficiente de variabilidade intra-ensaio (CV), medidas duplicadas foram realizadas dentro ...

Discussão

Descrevemos um método de ELISA sanduíche no qual MPO ou NE se liga a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Após a lavagem, o "sanduíche" é completado incubando as amostras com um anticorpo monoclonal anti-DNA associado à peroxidase. Após a remoção do anticorpo secundário não ligado, o conjugado peroxidase ligado é detectado pela adição de um substrato cromogênico ABTS peroxidase, que produz um produto final solúvel que pode ser lid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.