변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

요약

우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

초록

미생물과 같은 특정 자극은 호중구가 호중구 세포외 트랩(NET)을 방출하게 하는데, 이는 기본적으로 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)와 같은 과립 단백질과 세포질 및 세포골격 단백질이 있는 DNA로 구성된 거미줄과 같은 구조입니다. 최근 NET에 대한 관심이 높아졌지만 임상 환경에서 NET을 측정하는 데 사용할 수 있는 민감하고 신뢰할 수 있는 분석 방법은 없습니다. 이 기사에서는 순환 NET의 두 가지 구성 요소인 MPO-DNA 및 NE-DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석에 대해 설명하며, 이는 NET의 특정 구성 요소이며 NET의 분해 산물로 세포외 공간으로 방출됩니다. 상기 분석은 포획 항체 및 DNA 특이적 검출 항체로서 MPO 또는 NE에 대한 특이적 단일클론 항체를 사용한다. MPO 또는 NE는 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 인큐베이션 동안 포획 항체의 한 부위에 결합한다. 이 분석은 우수한 선형성과 높은 분석 간 및 분석 내 정밀도를 보여줍니다. 우리는 급성 호흡 곤란 증후군을 동반하는 COVID-19 환자 16 명에게 사용했으며 MPO-DNA 및 NE-DNA의 혈장 농도가 건강한 대조군에서 얻은 혈장보다 유의하게 높다는 것을 발견했습니다. 이 검출 분석은 인간 혈장 및 배양 상청액에서 NET의 특성을 조사하기 위한 신뢰할 수 있고 매우 민감하며 유용한 방법입니다.

서문

이 기사에서는 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 DNA ^1,2와 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)의 복합체를 검출함으로써 생물학적 체액에서 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 정량화하는 방법을 설명합니다. NET은 호중구 과립 ^3,4에서 유래한 항균 프로테아제로 장식된 DNA 골격으로 구성됩니다. MPO-DNA와 NE-DNA 복합체는 모두 NET의 중요하고 특정한 구성 요소이며 NET ^3,4의 분해 산물로서 세포외 공간으로 방출됩니다.

NET은 항균 방어³에서 중요한 생리^{학적 역할 외에도} 혈전 형성6의^{촉진과 패}혈증7의 악화를 포함하여 다양한 병리학적 효과^4,5를 가지고^있다. 이에 따라 최근 NET이 주목받고 있다. 그럼에도 불구하고 NET의 생체 내 정량화는 민감하고 신뢰할 수 있는 정량 분석 방법이 없기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다.

형광 현미경 ^8,9 및 유세포 분석(flow cytometry⁾¹⁰에 의한 NET의 직접 측정과 순환 cell-free DNA, 뉴클레오솜 및 시트룰린화 히스톤 H3의 간접 측정을 포함하여 몇 가지 방법을 사용할 수 있지만, 각 방법에는 고유한 장점과 한계가 있습니다¹¹. 면역형광 현미경 방법은 NET에 특이적이며 국소화 및 NET 형성 정도를 명확하게 보여주지만 샘플은 생검 조직 및 분비 물질로 제한됩니다. 또한, 이 방법은 숙련된 연구원이 수행해야 하며 결과를 얻는 데 오랜 시간이 필요합니다. 유세포 분석을 통해 NET 관련 구성 요소의 순환 수준을 측정하는 것은 쉽고 결과를 빠르게 제공합니다. 그러나 이 방법은 NET¹²에만 국한되지 않습니다.

우리¹³ 및 기타 ^1,2는 MPO 또는 NE에 대한 특이적 항체를 포획 항체 및 DNA 특이적 검출 항체로 사용하는 변형된 ELISA 기술을 사용하여 인간 혈장에서 순환하는 NET 성분, MPO-접합 또는 NE-접합 DNA를 측정하기 위한 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 분석법을 개발했습니다. 이 분석은 또한 생체 외에서 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA) 자극에 반응하여 활성화된 호중구에 의해 방출되는 세포 배양 상청액의 NET 성분을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

본 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 아이치 의과대학 임상시험심사위원회(2017-H341, 2019-H137)의 승인을 받았다. 각 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.

1. 시약 준비

참고: 샌드위치 ELISA 분석을 수행하기 위해 시약은 아래에 설명된 대로 준비됩니다.

1. 코팅 버퍼:
   1. 0.1 mol/L 탄산염-중탄산염 완충액을 만들기 위해 무수 탄산나트륨 10.6g(분자량, 106g/mol)과 중탄산나트륨 8.4g(분자량, 84g/mol)의 무게를 잰다.
   2. 비커에 있는 약 900mL의 증류수에 추가합니다.
   3. 희석된 염산 또는 수산화나트륨을 필요한 양만큼 첨가하여 완충액의 pH를 9.6으로 조정합니다.
   4. pH 측정기로 pH를 확인하십시오.
   5. 그런 다음 필요한 양의 증류수를 추가하여 총 부피가 1,000mL가 되도록 합니다.
   6. 이 0.1 mol/L 탄산염-중탄산염 완충액을 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
2. 블로킹 버퍼:
   1. 137mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na2HPO4, 2.68mmol/L KCl 및 1.47mol/L KH 2PO 4(pH _7.4)로 구성된 인산염 완충 식염수(PBS) 70mL에 약 250μL의₂₀% 아지드화나트륨과 1g의 소혈청 알부민(BSA)을 넣고 부드럽게 섞습니다.
   2. 증류수를 첨가하여 총 부피가 100mL가 되도록 합니다. 소 혈청 알부민과 아 지드 화 나트륨의 최종 농도는 각각 1 %와 0.05 %입니다. 10분 정도 기다리면 솔루션을 사용할 준비가 됩니다.
3. 세척 용액: 증류수에 0.5% t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌글리콜 tert-옥틸페닐 에테르(Triton X-100)를 준비합니다.
   1. 100 % Triton X-100을 증류수로 10 %로 희석하고 10 % 용액을 사용하기 전에 1 일 동안 방치하십시오.
   2. 그런 다음 10% Triton X-100 용액을 증류수로 20배 다시 희석하여 0.5%의 농도를 얻습니다.
4. 항체 희석:
   1. 포획 항체(항-MPO 항체[1mg/mL] 또는 항-NE 항체[1mg/mL])를 코팅 완충액(pH 9.6)에서 1:2,000으로 희석하여 분석 1일차(아래 참조) 및 검출 항체(퍼옥시다아제 접합 항-DNA 항체)를 분석 3일차에 사용하기 전에 PBS로 1:40으로 희석합니다(아래 참조).
      참고: 예비 실험을 위해 이소형 항체(IgG 토끼[5mg/mL] 및 IgG1 마우스 클론 Ci4[0.5mg/mL])를 코팅 완충액(pH 9.6)에서 1:10,000 및 1:1,000으로 희석합니다.
5. ABTS 기질 용액: 시료 수에 따라 1개, 2개 또는 3개의 2,2'-아지노-비스(3 에틸벤조티아졸린-6-설폰산(ABTS) 정제를 5mL, 10mL 또는 15mL의 ABTS 완충액(과붕산나트륨, 구연산 및 인산수소이나트륨 함유)에 용해합니다. 시료당 100μL이 필요합니다. 준비된 용액을 빛으로부터 보호되는 2-8 °C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 최대 3 개월 동안 안정적입니다.

2. 시료 채취 및 보관

1. 플라즈마 격리:
   1. 4mL의 말초 혈액 샘플을 22G 주사기로 정맥 천자하여 리튬 헤파린 채혈 튜브에 수집하고 4°C에서 10분 동안 1,600 x g 에서 원심분리합니다.
   2. 상층액을 2mL 안전 잠금 샘플 튜브로 옮깁니다.
   3. 상청액을 4°C에서 10분 동안 16,000 x g 로 다시 원심분리하여 잔류 세포를 제거한다.
   4. 튜브 바닥의 펠릿을 방해하지 않고 새로운 안전 잠금 장치 샘플 튜브에 상청액을 수집합니다.
   5. 수득한 혈장을 추가 사용이 있을 때까지 -80°C에서 보관한다.
      참고: 이 분석으로 고처리량 결과를 얻으려면 양질의 샘플이 필요합니다. 혈장 샘플을 사용하는 경우 두 번째 원심분리를 수행하여 잔류 세포를 제거합니다. 샘플의 반복적인 해동을 피하십시오. EDTA가 DNase 활성에 영향을 미치기 때문에 항응고제로 헤파린을 사용하십시오.
2. 다형핵 호중구의 분리
   1. 말초 혈액 샘플을 22G 주사기로 정맥 천자하여 리튬 헤파린 채혈 튜브에 수집합니다.
   2. 6mL의 혈액을 6mL의 원스텝 다형체에 적층하고 실온(RT)에서 45분 동안 1,000 x g 에서 튜브를 원심분리합니다.
   3. 호중구를 함유하는 제3 버피 코팅층을 수확하고, 이를 페놀 레드가 없는 RPMI-1640에서 400 x g 로 RT에서 10분 동안 3회 세척한다.
   4. 6% 열 비활성화 태아 소 혈청이 보충된 2mM L-글루타민을 함유한 페놀 레드가 없는 RPMI-1640에 호중구를 재현탁하고 혈구계로 현미경 필드의 세포를 계수합니다.
      참고: 이 방법은 트리판 블루 염료 배제로 평가한 바와 같이 96%에서 98% 이상의 생존력으로 95% 순도를 산출합니다.
3. 다형핵 호중구의 활성화와 NETosis in vitro
   1. 갓 분리된 다형핵 호중구를 1 × 10⁵ cells/mL로 희석하여 6% 열 비활성화 태아 소 혈청이 보충된 2mM L-글루타민을 함유한 페놀 레드가 없는 RPMI-1640에 넣고 35mm 배양 접시에 파종합니다.
   2. NET을 유도하기 위해, 5% CO₂/95% 공기 중 37°C에서 4시간 동안 25nM PMA로 다형핵 호중구를 자극한다.
   3. 4시간의 배양 후, 0.6μg/mL DNase I을 RT에서 15분 동안 배양 접시에 직접 첨가하여 NET을 부분적으로 분해하고, 5mM EDTA를 첨가하여 DNase I 활성을 중지합니다.
   4. 합성된 NET을 함유하는 배지를 수집하고, 4°C에서 10분 동안 400 x g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.
   5. 4개의 건강한 대조군으로부터 상층액을 얻고, 혼합하고, 사용할 때까지 -80°C에서 보관한다.
      참고: 4개의 건강한 대조군으로부터 얻은 DNase 분해 PMA 자극 호중구는 NET 표준 1,14,15로 사용됩니다. PBS를 사용하여 연속적으로 희석된 NET 표준물질에서 검량선을 생성하고, 희석되지 않은 NET 표준물질에서 얻은 광학 밀도(OD) 값을 100% NET으로 할당합니다.

3. 분석 방법

참고: 분석을 수행하는 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

1. 1일차
   1. 총 100μL의 희석된 항-MPO 또는 0.05μg의 항체를 포함하는 항-NE 항체를 블랭크 웰을 포함한 플레이트의 각 웰에 적용합니다.
      알림: 코팅 완충액에는 어떤 종류의 세제도 포함되어서는 안 되며, 그렇지 않으면 항체가 각 웰의 벽에 균등하고 매끄럽게 결합하지 않을 수 있습니다. 후크 효과를 방지하기 위해 코팅 단백질 농도는 20μg/mL를 넘지 않아야 하는데, 그 수준 이상의 농도는 마이크로타이터 플레이트에서 사용 가능한 대부분의 부위를 포화시키기 때문입니다. 단백질 코팅 용액의 일반적인 농도 범위는 2-10 μg/mL입니다. 예비 실험을 위해, MPO에 대한 특정 단일 클론 항체 대신에 코팅을 위해 희석 된 이소 타입 대조군 항체 IgG 토끼를 사용한다. NE에 대한 특정 단클론 항체 대신 희석된 이소형 대조군 항체 IgG1 마우스를 코팅에 사용하십시오.
   2. 샘플의 증발을 방지하기 위해 접착성 플라스틱 덮개로 플레이트를 덮고, 포획 항체의 결합을 허용하기 위해 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
2. 2일차
   1. 희석된 항체 용액을 웰에서 버리고 웰당 세척 용액 300μL를 피펫팅하고 이 세척 절차를 3-4회 반복합니다.
   2. 종이 타월로 접시를 두드려 말려서 여분의 PBS를 제거합니다.
   3. ELISA 플레이트의 각 웰을 200 μL의 블로킹 완충액으로 블로킹한다.
   4. 접착 플라스틱 덮개로 플레이트를 밀착시키고 RT에서 1.5-2 시간 동안 배양하여 웰을 막습니다.
   5. 블로킹 용액을 웰에서 완전히 버린 다음 웰 당 세척 용액 300μL를 피펫팅하고 이 세척 절차를 3-4회 반복합니다.
   6. 종이 타월로 접시를 두드려 말려서 여분의 PBS를 제거합니다.
   7. 블랭크 웰을 제외한 각 웰에 총 25μL의 혈장 또는 배지를 도포하고 희석제로 PBS 75μL를 첨가하여 최종 부피 100μL를 만듭니다. 블랭크 웰에 PBS 100μL를 추가합니다.
   8. 그런 다음 플레이트를 250rpm의 셰이커에 올려 놓음으로써 RT에서 10초 동안 샘플을 혼합합니다.
   9. 블랭크 웰을 포함한 각 웰에 100배 희석된 DNase I(0.03mg/mL) 2μL를 적용합니다(반응 혼합물 내 DNase I의 최종 농도: 0.6μg/mL).
   10. 접착 플라스틱 덮개로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 250rpm의 셰이커에 올려 놓아 RT에서 10초 동안 샘플을 완전히 혼합합니다.
       참고: DNA 소화를 위한 최적 조건을 평가하기 위해 분석을 개발할 때 RT에서 15분 동안 0-0.9μg/mL DNase I로 COVID-19 환자의 MPO 관련 DNA를 포함하는 샘플을 배양하고 MPO에 대한 특정 포획 항체 또는 종 일치 이소형 대조군 항체로 코팅된 플레이트를 사용했습니다.
   11. RT에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
   12. 접착 플라스틱 덮개를 제거하고 각 웰에 0.5M EDTA 1μL를 도포하여 DNase 반응을 중지합니다.
   13. 접착식 플라스틱 덮개로 플레이트를 다시 밀봉하고 250rpm의 셰이커에 올려 놓아 실온에서 15초 동안 흔듭니다.
   14. 이어서, 플레이트를 4°C에서 밤새 인큐베이션하여 NET의 단백질 성분이 포획 항체에 부착되도록 한다.
3. 3일차
   1. 접착 플라스틱 덮개를 제거하고 웰에서 용액을 버립니다.
   2. 웰로부터 용액을 완전히 버린 다음, 웰 당 세척 용액 300 μL를 피펫팅하고, 이 세척 절차를 3 내지 4회 반복한다.
   3. 희석된 퍼옥시다제 접합 항-DNA 검출 항체를 총 100μL씩 각 웰에 도포합니다.
   4. 접착식 플라스틱 덮개로 플레이트를 밀착 밀봉하고 RT에서 1.5시간 동안 배양합니다.
   5. 웰에서 용액을 완전히 버린 다음 웰 당 세척 용액 300μL를 피펫팅하고 이 세척 절차를 3-4회 반복합니다.
   6. 잔류 용액을 조심스럽게 제거하십시오.
   7. 총 100 μL의 ABTS 기질 용액을 각 웰에 적용하고, 플레이트를 접착성 플라스틱 커버로 덮는다.
   8. 플레이트를 250rpm의 진탕기 상에서 20-30분 동안 RT의 어둠 속에서 배양한다.
      알림: 원하는 OD 판독값을 얻을 때까지 5분 간격으로 플레이트를 모니터링합니다.
   9. 총 50μL의 2M 황산을 추가하여 반응을 중지합니다.
   10. 플레이트의 측면을 조심스럽게 두드려 우물의 액체 내용물을 혼합하십시오.
   11. 마이크로플레이트 리더의 전원을 켜고 컴퓨터에 연결합니다.
   12. 컴퓨터에서 소프트웨어 응용 프로그램을 엽니다.
   13. 상태 표시줄에서 새 실험을 만들고 이름을 지정합니다.
   14. 플레이트 판독을 위해 다음 매개변수를 모두 설정합니다: 읽기 유형, 흡광도; 읽기 모드, 끝점; 파장, 2; Lm-1, 405 나노미터; Lm-2, 490 나노미터; 자동 믹스 & 블랭킹 전, 꺼짐; 미리 읽은 플레이트, 꺼짐; 자동 보정, 켜짐; 스트립, 전체 플레이트 읽기; 컬럼 파장 우선 순위, 컬럼 우선 순위; 캐리지 속도, 정상; 및 자동 읽기, 끄기.
   15. 그런 다음 샘플이 들어 있는 96웰 플레이트를 서랍에 넣고 닫습니다.
   16. 마지막으로 플레이트를 즉시 읽을 수 있도록 읽기 버튼을 선택합니다.
   17. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 판독합니다(이 단계에서는 490nm 파장을 기준으로 사용).
   18. 모든 미지의 샘플에서 분석 배지 단독의 흡광도 값을 자동으로 빼고 데이터를 저장합니다.
       참고: 연속 희석된 NET 표준에서 얻은 표준 곡선을 사용하여 샘플 1,14,15에서 NET의 상대 농도를 계산합니다. 여기서, 최종 결과는 "MPO- 또는 NE-DNA 복합체 (NET 표준의 %)"로 제시된다. 검출한계(LOD)는 표준편차(SD)와 검량선의 기울기(S)로부터 다음과 같이 계산되었습니다: LOD = 3.3(SD/S).

4. 통계

1. 적절한 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 통계 분석을 수행합니다. 여기서는 SigmaPlot v14.5가 사용되었습니다. 백분율과 계량형 변수는 대부분의 매개변수의 편향된 분포로 인해 사분위수 범위의 중앙값으로 표시됩니다.
2. Wilcoxon 순위 합계 테스트를 사용하여 COVID-19 환자와 건강한 대조군 간의 혈장 MPO-DNA 및 NE-DNA 수준을 비교합니다. 상관 분석을 사용하여 광학 밀도와 NET 표준 비율 간의 관계를 탐색할 수 있습니다.

결과

이 방법은 MPO 관련 및 NE 관련 DNA를 측정하기 위해 항-MPO, 항-NE 및 항-DNA 단클론 항체와 함께 샌드위치 ELISA를 사용했습니다(그림 1). 이 방법에서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 MPO-특이적 또는 NE-특이적 단일클론 항체로 코팅하여 DNA-연관 MPO 및 DNA-연관 NE 뿐만 아니라, 비-DNA-연관 MPO 및 NE를 포획하였다. 분석 내 가변성 계수(CV)를 계산하기 위해 COVID-19 환자와 건강한 대조군...

토론

본 발명자들은 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 배양 동안 MPO 또는 NE가 포획 항체의 한 부위에 결합하는 샌드위치 ELISA 방법을 설명하였다. 세척 후, "샌드위치"는 샘플을 퍼옥시다아제-관련 항-DNA 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션함으로써 완성된다. 결합되지 않은 2차 항체를 제거한 후, 발색 ABTS 과산화효소 기질을 첨가하여 결합된 퍼옥시다제 접합체를 검출하고, 이는 405nm에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.