تشريح أنسجة البنكرياس لعزل الخلايا المفردة القابلة للحياة

Summary

الخلايا النتوءية البنكرياسية هي سلائف للخلايا الخبيثة التي تؤدي إلى أورام البنكرياس. ومع ذلك ، فإن عزل خلايا البنكرياس السليمة القابلة للحياة يمثل تحديا. هنا ، نقدم طريقة فعالة لتفكك أنسجة البنكرياس. يمكن بعد ذلك استخدام الخلايا لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) أو للزراعة المشتركة ثنائية أو ثلاثية الأبعاد.

Abstract

يشتمل البنكرياس على جهازين رئيسيين: جهاز الغدد الصماء، الذي ينتج الهرمونات ويفرزها، والجهاز الخارجي الإفراز، الذي يمثل حوالي 90٪ من البنكرياس، ويشمل الخلايا التي تنتج إنزيمات الهضم وتفرزها. تنتج إنزيمات الهضم في الخلايا العنيبية البنكرياسية، وتخزن في حويصلات تسمى الزيموجينات، ثم تطلق في الاثني عشر عبر قناة البنكرياس لبدء عمليات التمثيل الغذائي. يمكن للإنزيمات التي تنتجها الخلايا العنيبية أن تقتل الخلايا أو تحلل الحمض النووي الريبي الخالي من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلايا العنيبية هشة ، وتؤدي بروتوكولات التفكك الشائعة إلى عدد كبير من الخلايا الميتة والبروتياز و RNases الخالية من الخلايا. لذلك ، فإن أحد أكبر التحديات في هضم أنسجة البنكرياس هو استعادة الخلايا السليمة والقابلة للحياة ، وخاصة الخلايا العنيبة. يوضح البروتوكول المقدم في هذه المقالة طريقة من خطوتين قمنا بتطويرها لتلبية هذه الحاجة. يمكن استخدام البروتوكول لهضم البنكرياس الطبيعي أو البنكرياس الذي يتضمن آفات ما قبل خبيثة أو أورام البنكرياس التي تشمل عددا كبيرا من الخلايا اللحمية والمناعية.

Introduction

يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) أحد أكثر أنواع السرطان عدوانية¹. تدعم الأدلة السريرية فكرة أن PDAC يتطور من خلايا نظام الإفراز الخارجي ، بما في ذلك الخلايا العنيبية ، على مدى سنوات عديدة ، مدفوعة بطفرات في الجين الورمي الأولي KRAS².

تشمل أورام البنكرياس العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، وقد ثبت أن الخلايا الخبيثة تمثل 20٪ -50٪ فقط من كتلة الورم³. تتفاعل أنواع الخلايا المختلفة مع الخلايا الظهارية ، وتدعم تحولها ، وتعزز تكوين الورم ونموه. تسبب الأحداث المبكرة حؤول الآسيين ، مما يؤدي إلى آفات مجهرية تسمى ورم البنكرياس داخل الظهارة (PanINs) ، والتي يمكن أن تتطور في بعض الحالات إلى PDAC⁴.

هناك حاجة ماسة للتحقيق في هذه التفاعلات واستهداف الإشارات المحورية. يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) طريقة قوية تكشف عن التعبير الجيني بدقة خلية واحدة ، وبالتالي تتبع التغييرات التي تمر بها الخلايا الظهارية ، وبالتالي تمكين استكشاف تطور سرطان البنكرياس.

تشريح الأنسجة وهضمها إلى خلايا مفردة هي المرحلة الأولى في تجربة scRNA-seq. هناك عدة عوامل تجعل عملية هضم أنسجة البنكرياس صعبة بشكل خاص: أ) تمثل الخلايا العنيبية أكثر من 90٪ من البنكرياس وتحتوي الخلايا العنيبية على كميات كبيرة من الإنزيمات الهضمية ، بما في ذلك البروتياز و RNases التي تقلل من جودة المكتبات القائمة على الحمض النووي الريبي ؛ (ii) الخلايا العنيبية حساسة للغاية وقد تتحلل إذا تم استخدام البروتوكولات القياسية ؛ (iii) تعبر الخلايا العنيبية عن عدد صغير من الجينات بمستويات عالية جدا. لذلك ، إذا تم تحليل هذه الخلايا أثناء التجربة ، فقد يؤدي ذلك إلى تلويث ملف تعريف التعبير الجيني المرصود للخلايا الأخرى ؛ (IV) أنسجة البنكرياس المستعادة من الأورام هي مادة لاصقة ، مما يجعل من الصعب تشريحها دون إتلاف الخلايا. وبالتالي ، على الرغم من أن الحفاظ على قابلية عالية لجميع أنواع الخلايا أمر مطلوب ، إلا أن العدد الكبير وحساسية الخلايا العنيبية يضيفان تعقيدا إضافيا. تفرض هذه العوامل صعوبات في تحقيق تعليق أحادي الخلية قابل للتطبيق بنسبة تزيد عن 80٪ ولا يحتوي على كتل ، كما هو مطلوب لتجارب scRNA-seq.

هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول باستخدام التربسين C وكولاجيناز P ، جنبا إلى جنب مع المراقبة المتكررة للأنسجة. هذا يدعم التفكك إلى خلايا مفردة مع الحفاظ على قابلية عالية لدعم نجاح تجارب scRNA-seq ^5,6.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات المشتركة (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان) التابعة للجامعة العبرية (القدس ، إسرائيل) ومركز هداسا الطبي (القدس ، إسرائيل) على بروتوكول الدراسة لرعاية الحيوان (MD-18-15417-5 "ديناميات الأنسجة في سرطان البنكرياس في الفئران") ، وامتثل البروتوكول المقدم هنا لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة للاختبارات والبحوث على الحيوانات. الجامعة العبرية هي جمعية لتقييم واعتماد المعهد الدولي لرعاية المختبرات.

ملاحظة: تم الحصول على مخزون سلالة الماوس # 007908 والمخزون # 019378 والمخزون # 008179 من مختبر جاكسون. PRT (كراس+/LSL-G12D; Ptf1a-Cre^ER ؛ Rosa26^LSL-tdTomato) الفئران عن طريق عبور السلالات المذكورة أعلاه. تم استخدام الفئران من كلا الجنسين ، بين 6 أسابيع و 15 شهرا من العمر ، للدراسة. تم تحضير عقار تاموكسيفين عن طريق إذابة المسحوق في زيت الذرة. تم حقن الفئران البالغة (6-8 أسابيع من العمر ، الإناث والذكور) بعقار تاموكسيفين تحت الجلد في اليومين 0 و 2 بجرعة 400 مغ / كغ وفحصت مرتين في الأسبوع بعد الحقن. لم يكن من الممكن قياس الأورام لأنها كانت موجودة داخليا. لذلك ، تم إجراء القتل الرحيم إذا لوحظت علامات سريرية غير طبيعية وفقا للبروتوكول الأخلاقي. تم القتل الرحيم للفئران في نقاط زمنية مختلفة بعد تحريض عقار تاموكسيفين ، باستخدام إيزوفلوران وخلع عنق الرحم.

1. تشريح البنكرياس

ملاحظة: للحصول على العائد الأمثل أثناء الاستخراج ولضمان بقاء الخلية بشكل جيد ، يعد التشريح السريع أمرا بالغ الأهمية. لتقصير الوقت اللازم لعزل البنكرياس ، يجب أن تكون جميع الأدوات والمعدات جاهزة على الجليد قبل القتل الرحيم للفأر.

1. القتل الرحيم للفأر عن طريق الاختناق CO₂ والتحقق باستخدام خلع عنق الرحم. من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام أدوات تشريح معقمة.
2. إصلاح الماوس ورش البطن مع 70 ٪ من الإيثانول. قم بعمل شق على شكل حرف V بطول 2.5 سم في منطقة الأعضاء التناسلية بالمقص والملقط وانتقل إلى الأعلى لفتح تجويف البطن بالكامل.
3. حدد موقع المعدة على الجانب الأيسر من الماوس. حدد موقع البنكرياس, الذي هو بالقرب من الطحال. افصل البنكرياس عن المعدة والاثني عشر باستخدام ملقطين (بدون تمزق). استمر وافصل البنكرياس عن الأمعاء الدقيقة والصائم والدقاقي.
4. حرك البنكرياس إلى الجانب الأيمن من الماوس. افصل الوصلات المتبقية بين البنكرياس والتجويف الصدري بالملقط لفصل البنكرياس والطحال المتصل به تماما.
5. أخرج البنكرياس وانشره لفحصه في طبق بتري على الجليد.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر خلال هذه الخطوة لإزالة البنكرياس فقط ، وعدم إزالة الأنسجة الدهنية المساريقية أو الأنسجة المجاورة الأخرى جنبا إلى جنب مع البنكرياس ، لتجنب التلوث الخلوي.

2. التفكك الأنزيمي والميكانيكي للبنكرياس

1. قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية مسبقا.
   1. مخزن التفكك 1: 4 مل من التربسين C + 6 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1) لكل عينة.
   2. مخزن التفكك 2: 9 مل من محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) 1x ؛ 4 ٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ؛ 1 مل من كولاجيناز P (10 ملغ / مل) ؛ 200 ميكرولتر من مثبطات التربسين (10 ملغ / مل) ؛ و 200 ميكرولتر من DNase I (10 ملغ / مل) (انظر الجدول 1).
   3. غسل العازلة: 50 مل من HBSS 1x ؛ 2 غرام من BSA ؛ 1 مل من مثبطات التربسين (10 ملغ / مل) ؛ و 1 مل من DNase 1 (10 مجم / مل).
   4. محلول إيقاف نشاط الإنزيم: يحتوي HBSS 1x على 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 150 جم من DNase I (0.2 مجم / مل).
2. ضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 مل على الثلج. شطف البنكرياس في 10٪ FBS في HBSS 1x. سوف تطفو الأنسجة الدهنية ويغرق البنكرياس. هذه طريقة سهلة لتصور وإزالة الأنسجة الدهنية البيضاء الملوثة التي لا تزال متصلة بالبنكرياس بسرعة.
3. نقل أنسجة البنكرياس الماوس إلى طبق بتري معقم يحتوي على 5 مل من HBSS 1x على الجليد. قطع البنكرياس إلى قطع صغيرة من 1 إلى 3 مم³ باستخدام مقص Noyes ومشرط (الشكل 2 أ). في حالة وجود أكثر من عينة واحدة ، يجب حفظ العينات على الثلج بنسبة 10٪ FBS / HBSS 1x.
4. نقل الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتخلص من المادة الطافية لإزالة شظايا الخلايا وخلايا الدم.
5. أعد تعليق القطع في مخزن التفكك 1 الذي يحتوي على 0.02٪ تربسين C-0.05٪ EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع التقليب (180 دورة في الدقيقة). يغسل على الفور باستخدام 10٪ من وسط النسر المعدل من FBS / Dulbecco (DMEM). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 جم عند 4 درجات مئوية.
6. اغسل مرة أخرى عن طريق تعليق الحبيبات في 10 مل من المخزن المؤقت للغسيل والطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية قبل خطوة التفكك التالية.
7. احتضان البنكرياس في مخزن التفكك 2 لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التقليب (180 دورة في الدقيقة).
8. بعد 15 دقيقة ، قم بإجراء التفكك الميكانيكي عن طريق سحب شظايا البنكرياس بقوة لأعلى ولأسفل في ماصات معقمة ذات حجم متناقص (25 و 10 و 5 مل من الماصات المصلية) 10 مرات وإعادتها إلى 37 درجة مئوية.
   1. بعد 5 دقائق إضافية ، كرر التفكك الميكانيكي واستخدم الفحص المجهري الضوئي لمراقبة التفكك وفقا لمقدار التعليق أحادي الخلية. عادة إذا كان أقل من 90٪ من التعليق في هذه المرحلة يتكون من خلايا مفردة معزولة ، فهناك حاجة إلى وقت حضانة أطول. استخدم المثقب الأزرق لمراقبة صلاحية الخلية.
   2. استمر في الحضانة وأخذ عينات للكشف عن التفكك كل 5 دقائق.
      ملاحظة: يعتمد إجمالي وقت الحضانة على الأنسجة ويمكن أن يختلف بين العينات. يجب أن تنتهي الحضانة وتفكك الأنسجة عندما يتم فصل 90٪ من الخلايا إلى خلايا مفردة أو عند اكتشاف انخفاض في قابلية الحياة.
9. بعد أن يتفكك نسيج البنكرياس جيدا (يتوافق مع اختفاء شظايا البنكرياس وزيادة تعكر المحلول) (الشكل 2) ، أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق الغسيل مرتين بمحلول إيقاف نشاط الإنزيم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. من هذه الخطوة ، احتفظ بتعليق الخلية على الجليد.
10. مرر تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 70 ميكرومتر وتحقق من صلاحية الخلية تحت المجهر. قد تقلل الأحجام الأصغر من شبكة النايلون من صلاحية الخلية.
11. أعد تعليق الحبيبات واغسلها ب 5-10 مل من محلول الغسيل المخزن بالثلج البارد. عد الخلايا.
12. إذا لوحظت العديد من خلايا الدم الحمراء ، عالج الخلايا بمحلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في الحالات التي لوحظت فيها كتل ، يجب معالجة العينة مرة أخرى بالتربسين ، كما هو موضح في الخطوة 2.5. يتم الكشف عن الصلاحية باستخدام التريبان الأزرق تحت المجهر ، وإذا كانت الصلاحية أقل من 80٪ ، فيجب عزل الخلايا الحية باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) مع أعمدة MACS MS (انظر الجدول 1).

النتائج

في عمل نشر مؤخرا⁵ ، قمنا بتطبيق البروتوكول الموضح أعلاه لاستكشاف المراحل المبكرة من تطوير PDAC باستخدام نموذج الماوس. تم تصميم الفأر وراثيا ليشمل الكاسيتات Ptf1a-CreER و LSL-Kras-G12D و LSL-tdTomato⁷ ، والتي تسمح بالتعبير عن KRAS النشط بشكل أساسي في الخلايا العنيبي...

Discussion

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا لتفكك أنسجة البنكرياس. البروتوكول بسيط وسهل الاستخدام ويوفر أداة لعزل الخلايا المفردة القابلة للحياة من أنسجة البنكرياس في مراحل مختلفة أثناء عملية الورم الخبيث ، بما في ذلك الأورام الصلبة. في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنواع مختلفة من الكولاجين لهضم ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or Resource
70 µm nylon mesh	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Experimental Models: Organisms/Strains
Fetal Bovine Serum South American	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D mice	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS dead cells removal kit	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsin C-EDTA 0.05%	Biological industries	cat# 03-053-1A
Trypsin inhibitor	Roche	cat#T6522