生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

要約

膵臓の転生細胞は、膵臓腫瘍を引き起こす悪性細胞の前駆体です。しかし、無傷の生膵細胞を単離することは困難です。ここでは、膵臓組織を解離するための効率的な方法を紹介します。その後、細胞はシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)または2次元または3次元の共培養に使用できます。

要約

膵臓には、ホルモンを産生・分泌する内分泌系と、膵臓の約90%を占め、消化酵素を産生・分泌する細胞を含む外分泌系の2つの主要なシステムがあります。消化酵素は膵腺房細胞で産生され、接合菌と呼ばれる小胞に蓄えられ、膵管 を介して 十二指腸に放出され、代謝プロセスを開始します。腺房細胞によって産生される酵素は、細胞を殺したり、無細胞RNAを分解したりする可能性があります。さらに、腺房細胞は壊れやすく、一般的な解離プロトコルでは、多数の死細胞と無細胞プロテアーゼおよびRNaseが生じます。したがって、膵臓組織の消化における最大の課題の1つは、無傷で生存可能な細胞、特に腺房細胞を回復させることです。この記事で紹介するプロトコルは、このニーズを満たすために開発した2段階の方法を示しています。プロトコルが正常な膵臓、前悪性病変を含んでいる膵臓、または多数の間質および免疫細胞を含んでいる膵臓の腫瘍を消化するのに使用することができる。

概要

膵管腺がん(PDAC)は、最も侵攻性のがんの1つです¹。臨床的証拠は、PDACがKRASがん原遺伝子²の変異によって引き起こされる腺房細胞を含む外分泌系細胞から長年にわたって発生するという考えを支持しています。

膵臓腫瘍には多くの異なる種類の細胞が含まれ、悪性細胞は腫瘍量の20%〜50%にしかカウントされないことが実証されています³。さまざまな種類の細胞が上皮細胞と相互作用し、その形質転換をサポートし、腫瘍の形成と増殖を促進します。初期のイベントは腺房化生を引き起こし、膵臓上皮内腫瘍(PanIN)と呼ばれる顕微鏡的病変を引き起こし、場合によっては^PDAC4に発展する可能性があります。

これらの相互作用を調査し、重要なシグナルを標的にすることが非常に重要になっています。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、シングルセルの分解能で遺伝子発現を明らかにする強力な手法であり、それによって上皮細胞が受ける変化を追跡し、膵臓がんの発生の調査を可能にします。

単一細胞への組織の解剖と消化は、scRNA-seq実験の最初の段階です。いくつかの要因により、膵臓組織の消化が特に困難になります:i)腺房細胞は膵臓の90%以上を占め、腺房細胞には、RNAベースのライブラリの質を低下させるプロテアーゼやRNaseなどの消化酵素が大量に含まれています。(ii)腺房細胞は非常に敏感であり、標準的なプロトコルを使用すると溶解する可能性があります。(iii)腺房細胞は、少数の遺伝子を非常に高いレベルで発現します。したがって、実験中にこれらの細胞を溶解すると、他の細胞の観察された遺伝子発現プロファイルが汚染される可能性があります。(iv)腫瘍から回収された膵臓組織は線維形成性であり、細胞を傷つけずに解剖することは困難です。したがって、すべての細胞タイプで高い生存率を維持する必要がありますが、腺房細胞の数と感度が大きいため、複雑さが増します。これらの要因により、scRNA-seq実験に必要な80%以上の生存率と凝集塊のない単一細胞懸濁液の実現が困難になります。

ここでは、トリプシンCとコラゲナーゼPを使用し、頻繁な組織モニタリングとともにプロトコルを開発しました。これにより、単一細胞への解離がサポートされ、高い生存率が維持され、scRNA-seq実験の成功を裏付けます^5,6。

プロトコル

ヘブライ大学(イスラエル、エルサレム)とハダサ医療センター(イスラエル、エルサレム)の合同倫理委員会(動物実験委員会)は、動物福祉のための研究計画書(MD-18-15417-5「マウスの膵臓癌における組織動態」)を承認し、ここで提示されたプロトコルは、動物実験と研究に関連するすべての倫理規則に準拠しています。ヘブライ大学は、実験動物ケアの評価と認定のための協会国際認定機関です。

注:マウス株ストック#007908、ストック#019378、およびストック#008179は、ジャクソンの研究室から入手しました。PRT(Kras+/LSL-G12D;Ptf1a-Cre^ERです。Rosa26^LSL-tdTomato)マウスは、上記の系統を交配して作製した。この研究には、生後6週間から15ヶ月までの男女のマウスが用いられた。タモキシフェンは、粉末をコーン油に溶解することによって調製した。成体マウス(6〜8週齢、雌雄)に、0日目と2日目に400 mg / kgの用量でタモキシフェンを皮下注射し、注射後に週2回検査しました。.腫瘍は内部に位置していたため、測定することはできなかった。したがって、安楽死は、倫理的プロトコルに従って異常な臨床徴候が観察された場合に行われました。マウスは、タモキシフェン導入後のさまざまな時点で、イソフルランと子宮頸部脱臼を使用して安楽死させました。

1.膵臓解剖

注:抽出中の収量を最適化し、良好な細胞生存率を確保するためには、迅速な解剖が重要です。膵臓の分離に必要な時間を短縮するには、マウスを安楽死させる前に、すべての器具と機器を氷上で準備する必要があります。

1. CO2窒息によりマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼を用いて検証する。このステップから、すべての手順は滅菌された解剖器具で実行する必要があります。
2. マウスを固定し、腹部に70%エタノールをスプレーします。ハサミと鉗子で陰部を2.5cmのV字状に切開し、上に向かって腹腔を全開にします。
3. マウスの左側にある胃を見つけます。脾臓の近くにある膵臓を見つけます。2つの鉗子を使用して、膵臓を胃と十二指腸から分離します(裂け目なし)。続けて、膵臓を小腸、空腸、回腸から分離します。
4. 膵臓をマウスの右側に移動します。膵臓と胸腔の間の残りの接続を鉗子で分離して、膵臓と付着した脾臓を完全に剥離します。
5. 膵臓を取り出し、氷の上のペトリ皿に広げて検査します。
   注意: このステップでは、細胞の汚染を避けるために、膵臓のみを除去し、腸間膜脂肪組織または膵臓と他の隣接する組織を除去しないように注意する必要があります。

2.膵臓の酵素的および機械的解離

1. 以下のバッファーをあらかじめ用意しておきます。
   1. 解離緩衝液 1:各サンプルに 4 mL のトリプシン C + 6 mL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)( 表 1 を参照)。
   2. 解離緩衝液 2:9 mL のハンクス平衡塩溶液(HBSS)1x;4%ウシ血清アルブミン(BSA);1 mL のコラゲナーゼ P (10 mg/mL);200 μL のトリプシン阻害剤 (10 mg/mL);および 200 μL の DNase I(10 mg/mL)( 表 1 を参照)。
   3. 洗浄バッファー:50 mLのHBSS 1x;2gのBSA。1 mLのトリプシン阻害剤(10 mg / mL);DNase 1 1 1 mL(10 mg/mL)を添加します。
   4. 酵素活性停止液:5%ウシ胎児血清(FBS)とDNase I(0.2mg/mL)150gを含有するHBSS 1x。
2. 膵臓を氷上の50mLチューブに入れます。HBSS 1xの10%FBSで膵臓をすすぎます。脂肪組織が浮遊し、膵臓が沈みます。これは、膵臓にまだ付着している汚染された白色脂肪組織を視覚化し、迅速に除去する簡単な方法です。
3. マウスの膵臓組織を、氷上で5 mLのHBSS 1xを含む滅菌シャーレに移します。膵臓を1〜^3mm3 の小片に、Noyesハサミとメスを使用して切断します(図2A)。複数のサンプルの場合、サンプルは10%FBS / HBSS 1xで氷上に保管する必要があります。
4. 組織を遠心分離管に移します。350 x g 、4°C、5分間遠心分離します。上清を吸引して廃棄し、細胞片と血球を除去します。
5. 0.02%トリプシンC-0.05%EDTAを含む解離バッファー1に、37°Cで10分間、撹拌(180rpm)しながら再懸濁します。直ちに10%FBS/ダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で洗浄します。4°C、350gで5分間遠心分離します。
6. ペレットを10 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、350 x g で4°Cで5分間遠心分離してから、次の解離ステップを行って再度洗浄します。
7. 膵臓を解離バッファー2で37°Cで15分間、撹拌(180rpm)しながらインキュベートします。
8. 15分後、サイズを小さくした滅菌ピペット(25、10、5 mLの血清ピペット)で膵臓断片を上下に激しくピペッティングして機械的解離を行い、37°Cに戻します。
   1. さらに5分後、機械的解離を繰り返し、光学顕微鏡を使用して、単一細胞懸濁液の量に応じて解離をモニターします。通常、この段階で懸濁液の90%未満が単離された単一細胞で構成されている場合、より長いインキュベーション時間が必要です。トリパンブルーを使用して、細胞の生存率をモニターします。
   2. インキュベーションを続行し、5分ごとに解離を検出するためのサンプルを採取します。
      注:合計インキュベーション時間は組織によって異なり、サンプルによって異なる場合があります。インキュベーションと組織の解離は、細胞の90%が単一細胞に分離されたとき、または生存率の低下が検出されたときに終了する必要があります。
9. 膵臓組織が十分に解離した後(膵臓断片の消失と溶液の濁度の増加に対応)(図2)、酵素活性停止液で4°Cで5分間2回洗浄して酵素反応を停止します。 このステップから、細胞懸濁液を氷上に保管します。
10. 細胞懸濁液を70μmのナイロンメッシュに通し、顕微鏡で細胞の生存率を確認します。ナイロンメッシュのサイズが小さいと、細胞の生存率が低下する可能性があります。
11. ペレットを再懸濁し、5〜10 mLの氷冷緩衝洗浄液で洗浄します。セルを数えます。
12. 複数の赤血球が観察された場合は、赤血球溶解緩衝液で室温で2分間処理します。凝集塊が観察された場合は、ステップ2.5で説明したように、サンプルをトリプシンで再度処理する必要があります。生存率は顕微鏡下のトリパンブルーで検出し、生存率が80%未満の場合は、MACS MSカラムを備えた磁気活性化細胞ソーティング(MACS)死細胞除去キットを使用して生細胞を単離する必要があります( 表1を参照)。

結果

最近発表された研究⁵では、上記のプロトコルを適用して、マウスモデルを使用してPDAC開発の初期段階を調査しました。マウスは、タモキシフェン注射後に腺房細胞で恒常的に活性なKRASを発現させるカセットPtf1a-CreER、LSL-Kras-G12D、LSL-tdTomato7を含むように遺伝子操作されました。

子宮頸部脱臼後(マウ?...

ディスカッション

この記事では、膵臓組織解離のプロトコルを紹介します。このプロトコルはシンプルで使いやすく、固形腫瘍を含む悪性腫瘍プロセス中のさまざまな段階で、膵臓組織から生細胞を分離するためのツールを提供します。以前の研究では、膵臓を消化するためにさまざまな種類のコラゲナーゼが使用されました^8,9。コラゲナーゼDなどの非常に強力な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or Resource
70 µm nylon mesh	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Experimental Models: Organisms/Strains
Fetal Bovine Serum South American	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D mice	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS dead cells removal kit	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsin C-EDTA 0.05%	Biological industries	cat# 03-053-1A
Trypsin inhibitor	Roche	cat#T6522