胰腺组织解剖以分离活的单细胞

摘要

胰腺化生细胞是引起胰腺肿瘤的恶性细胞的前体。然而，分离完整的活胰腺细胞具有挑战性。在这里，我们提出了一种有效的胰腺组织解离方法。然后，这些细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维或三维共培养。

摘要

胰腺包括两个主要系统：产生和分泌激素的内分泌系统，以及约占胰腺90%的外分泌系统，包括产生和分泌消化酶的细胞。消化酶在胰腺腺泡细胞中产生，储存在称为酶原的囊泡中，然后 通过 胰管释放到十二指肠中以启动代谢过程。腺泡细胞产生的酶可以杀死细胞或降解游离RNA。此外，腺泡细胞很脆弱，常见的解离方案会导致大量死细胞和游离蛋白酶和RNase。因此，胰腺组织消化的最大挑战之一是恢复完整和活的细胞，尤其是腺泡细胞。本文中介绍的协议显示了我们为满足这一需求而开发的两步方法。该方案可用于消化正常胰腺、包含癌前病变的胰腺或包含大量基质和免疫细胞的胰腺肿瘤。

引言

胰腺导管腺癌 （PDAC） 是最具侵袭性的癌症类型之一¹.临床证据支持这样一种观点，即PDAC是由KRAS原癌基因²突变驱动的外分泌系统细胞（包括腺泡细胞）发展而来的。

胰腺肿瘤包括许多不同的细胞类型，并且已经证明恶性细胞仅占肿瘤质量的 20%-50%³。不同的细胞类型与上皮细胞相互作用，支持其转化，并促进肿瘤的形成和生长。早期事件导致腺泡化生，从而引起称为胰腺上皮内瘤变 （PanINs） 的微观病变，在某些情况下可发展为 PDAC⁴。

迫切需要研究这些相互作用并瞄准关键信号。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种强大的方法，它以单细胞分辨率揭示基因表达，从而跟踪上皮细胞所经历的变化，从而能够探索胰腺癌的发展。

组织解剖和消化为单细胞是scRNA-seq实验的第一阶段。有几个因素使胰腺组织消化特别具有挑战性：i）腺泡细胞占胰腺的90%以上，腺泡细胞含有大量的消化酶，包括蛋白酶和RNase，这些酶会降低基于RNA的文库的质量;（ii） 腺泡细胞非常敏感，如果使用标准方案，可能会裂解;（iii） 腺泡细胞以非常高的水平表达少量基因。因此，如果这些细胞在实验过程中裂解，可能会....

研究方案

希伯来大学（以色列耶路撒冷）和哈达萨医学中心（以色列耶路撒冷）的联合伦理委员会（机构动物护理和使用委员会）批准了动物福利研究方案（MD-18-15417-5“小鼠胰腺癌的组织动力学”），此处介绍的方案符合动物试验和研究的所有相关伦理法规。希伯来大学是国际实验动物护理评估和认证协会认可的机构。

注：小鼠品系原液 #007908、原液 #019378 和原液 #008179 是从杰克逊实验室获得的。PRT（Kras+/LSL-G12D;Ptf1a-Cre^内质网;Rosa26^LSL-tdTomato）小鼠是通过杂交上述菌株产生的。该研究使用了6周至15个月大的男女小鼠。通过将粉末溶解在玉米油中来制备他莫昔芬。成年小鼠（6-8周龄，雌性和雄性）在第0天和第2天皮下注射他莫昔芬，剂量为400mg / kg，注射后每周检查两次。由于肿瘤位于内部，因此无法测量肿瘤;因此，如果根据伦理协议观察到异常临床症状，则进行安乐死。在他莫昔芬诱导后的不同时间点，使用异氟醚和宫颈脱位对小鼠实施安乐死。

1.胰腺清扫术

注：为了在提取过程中获得最佳产量并确保良好的细胞活力，快速解剖至关重要。为了缩短胰腺分离所需的时间，在对小鼠实施安乐死之前，所有仪器和设备都必须准备好在冰上。

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结果

在最近发表的工作⁵中，我们应用上述协议来探索使用小鼠模型的PDAC开发的早期阶段。小鼠经过基因工程改造，包括 Ptf1a-CreER、LSL-Kras-G12D、LSL-tdTomato 7 盒，其允许在他莫昔芬注射后腺泡细胞中表达组成型活性 KRAS。

颈椎脱位后（根据小鼠伦理方案），切除胰腺，并应用上述方案（见 图1

讨论

在本文中，我们提出了胰腺组织解离的方案。该方案简单易用，并提供了一种在恶性肿瘤过程（包括实体瘤）的不同阶段从胰腺组织中分离活单细胞的工具。在以前的研究中，不同类型的胶原酶被用来消化胰腺^8,9。使用非常有效的胶原酶，如胶原酶D，可产生大量的免疫细胞和较低比例的上皮细胞。使用胶原酶P可以进行胰腺消化，适用于完整或肿瘤胰腺.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or Resource
70 µm nylon mesh	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Experimental Models: Organisms/Strains
Fetal Bovine Serum South American	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D mice	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS dead cells removal kit	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsin C-EDTA 0.05%	Biological industries	cat# 03-053-1A
Trypsin inhibitor	Roche	cat#T6522