Рассечение тканей поджелудочной железы для выделения жизнеспособных единичных клеток

Резюме

Метапластические клетки поджелудочной железы являются предшественниками злокачественных клеток, которые дают начало опухолям поджелудочной железы. Тем не менее, выделение неповрежденных жизнеспособных клеток поджелудочной железы является сложной задачей. Здесь мы представляем эффективный метод диссоциации тканей поджелудочной железы. Затем клетки могут быть использованы для секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) или для двух- или трехмерного совместного культивирования.

Аннотация

Поджелудочная железа включает в себя две основные системы: эндокринную, которая вырабатывает и секретирует гормоны, и экзокринную систему, которая составляет примерно 90% поджелудочной железы и включает клетки, вырабатывающие и секретирующие пищеварительные ферменты. Пищеварительные ферменты вырабатываются в ацинарных клетках поджелудочной железы, хранятся в везикулах, называемых зимогенами, а затем высвобождаются в двенадцатиперстную кишку через проток поджелудочной железы для запуска метаболических процессов. Ферменты, продуцируемые ацинарными клетками, могут убивать клетки или разрушать внеклеточную РНК. Кроме того, ацинарные клетки хрупки, и общие протоколы диссоциации приводят к большому количеству мертвых клеток и внеклеточных протеаз и РНКаз. Таким образом, одной из самых больших проблем в переваривании тканей поджелудочной железы является восстановление неповрежденных и жизнеспособных клеток, особенно ацинарных клеток. Протокол, представленный в этой статье, показывает двухэтапный метод, который мы разработали для удовлетворения этой потребности. Протокол может быть использован для переваривания нормальной поджелудочной железы, поджелудочной железы, которые включают предраковые поражения, или опухолей поджелудочной железы, которые включают большое количество стромальных и иммунных клеток.

Введение

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых агрессивных типов рака¹. Клинические данные подтверждают представление о том, что PDAC развивается из клеток экзокринной системы, включая ацинарные клетки, в течение многих лет, что обусловлено мутациями в протоонкогене KRAS².

Опухоли поджелудочной железы включают в себя множество различных типов клеток, и было продемонстрировано, что злокачественные клетки составляют только 20-50^{% массы опухоли}. Различные типы клеток взаимодействуют с эпителиальными клетками, поддерживают их трансформацию и усиливают образование и рост опухолей. Ранние события вызывают ацинарную метаплазию, которая приводит к микроскопическим поражениям, называемым интраэпителиальной неоплазией поджелудочной железы (PanINs), которые в некоторых случаях могут перерасти в PDAC⁴.

Существует острая необходимость в исследовании этих взаимодействий и нацеливании на ключевые сигналы. Секвенирование РНК одной клетки (scRNA-seq) является мощным методом, который выявляет экспрессию генов с разрешением одной клетки, тем самым отслеживая изменения, которые претерпевают эпителиальные клетки, что позволяет исследовать развитие рака поджелудочной железы.

Рассечение тканей и их расщепление на отдельные клетки является первым этапом эксперимента scRNA-seq. Несколько факторов делают пищеварение тканей поджелудочной железы особенно сложным: i) ацинарные клетки составляют более 90% поджелудочной железы, а ацинарные клетки содержат большое количество пищеварительных ферментов, включая протеазы и РНКазы, которые снижают качество библиотек на основе РНК; (ii) ацинарные клетки очень чувствительны и могут лизироваться при использовании стандартных протоколов; (iii) Ацинарные клетки экспрессируют небольшое количество генов на очень высоких уровнях. Поэтому, если эти клетки лизировать во время эксперимента, это может привести к контаминации наблюдаемого профиля экспрессии генов других клеток; (iv) ткань поджелудочной железы, извлеченная из опухолей, является десмопластической, что затрудняет ее вскрытие без повреждения клеток. Таким образом, несмотря на то, что требуется поддержание высокой жизнеспособности всех типов клеток, большое количество и чувствительность ацинарных клеток добавляют дополнительную сложность. Эти факторы затрудняют получение одноклеточной суспензии, жизнеспособной более чем на 80% и не имеющей скоплений, как это требуется для экспериментов scRNA-seq.

Здесь мы разработали протокол с использованием трипсина С и коллагеназы Р, а также частого мониторинга тканей. Это поддерживает диссоциацию на одиночные клетки, сохраняя при этом высокую жизнеспособность, что способствует успеху экспериментов scRNA-seq ^5,6.

протокол

Объединенный комитет по этике (Institutional Animal Care and Use Committee) Еврейского университета (Иерусалим, Израиль) и медицинского центра «Хадасса» (Иерусалим, Израиль) одобрил протокол исследования по благополучию животных (MD-18-15417-5 «Тканевая динамика при раке поджелудочной железы у мышей»), и представленный здесь протокол соответствовал всем соответствующим этическим нормам для испытаний и исследований на животных. Еврейский университет является аккредитованным Международной ассоциацией по оценке и аккредитации института по уходу за лабораторными животными.

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы мышей #007908, #019378 и #008179 были получены в лаборатории Джексона. ПРТ (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-Cre^ER; Мыши Rosa26^LSL-tdTomato) были созданы путем скрещивания вышеуказанных штаммов. Для исследования использовались мыши обоих полов в возрасте от 6 недель до 15 месяцев. Тамоксифен получали путем растворения порошка в кукурузном масле. Взрослым мышам (в возрасте 6-8 недель, самкам и самцам) вводили тамоксифен подкожно на 0-й и 2-й дни в дозе 400 мг/кг и обследовали два раза в неделю после инъекции. Невозможно было измерить опухоли по их внутреннему расположению; Поэтому эвтаназию проводили, если наблюдались аномальные клинические признаки согласно этическому протоколу. Мышей усыпляли в разные моменты времени после индукции тамоксифена, используя изофлуран и вывих шейки матки.

1. Расслоение поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального выхода во время экстракции и обеспечения хорошей жизнеспособности клеток решающее значение имеет быстрое препарирование. Чтобы сократить время, необходимое для изоляции поджелудочной железы, все инструменты и оборудование должны быть готовы на льду перед эвтаназией мыши.

1. Усыпьте мышь с помощью удушья_СО2 и проверьте с помощью вывиха шейки матки. Начиная с этого этапа, все процедуры должны выполняться стерильными препарирующими инструментами.
2. Зафиксируйте мышь и опрыскайте живот 70% этиловым спиртом. Ножницами и щипцами сделайте V-образный разрез 2,5 см в области гениталий и продвигайтесь вверх до полного раскрытия брюшной полости.
3. Расположите живот с левой стороны мыши. Найдите поджелудочную железу, которая находится рядом с селезенкой. Отделите поджелудочную железу от желудка и двенадцатиперстной кишки с помощью двух щипцов (без разрыва). Продолжайте и отделите поджелудочную железу от тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки.
4. Переместите поджелудочную железу в правую сторону от мыши. Отделите щипцами оставшиеся соединения между поджелудочной железой и грудной полостью, чтобы полностью отделить поджелудочную железу и прикрепленную селезенку.
5. Удалите поджелудочную железу и разложите ее для исследования в чашке Петри на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе необходимо соблюдать осторожность, чтобы удалить только поджелудочную железу, а не брыжеечную жировую ткань или другие соседние ткани вместе с поджелудочной железой, чтобы избежать клеточного загрязнения.

2. Ферментативная и механическая диссоциация поджелудочной железы

1. Заранее подготовьте следующие буферы.
   1. Диссоциационный буфер 1: 4 мл трипсина С + 6 мл фосфатного солевого буфера (PBS) (см. таблицу 1) для каждого образца.
   2. Диссоциационный буфер 2: 9 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) 1x; 4% бычий сывороточный альбумин (БСА); 1 мл коллагеназы Р (10 мг/мл); 200 мкл ингибитора трипсина (10 мг/мл); и 200 мкл ДНКазы I (10 мг/мл) (см. таблицу 1).
   3. Буфер для промывки: 50 мл HBSS 1x; 2 г БСА; 1 мл ингибитора трипсина (10 мг/мл); и 1 мл ДНКазы 1 (10 мг/мл).
   4. Раствор для остановки активности ферментов: HBSS 1x, содержащий 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 150 г ДНКазы I (0,2 мг/мл).
2. Поместите поджелудочную железу в пробирку объемом 50 мл на лед. Промыть поджелудочную железу в 10% FBS в HBSS 1x. Жировая ткань всплывет, а поджелудочная железа опустится. Это простой способ визуализировать и быстро удалить загрязняющую белую жировую ткань, все еще прикрепленную к поджелудочной железе.
3. Перенесите ткань поджелудочной железы мыши в стерильную чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 1x на льду. Разрежьте поджелудочную железу на небольшие кусочки от 1 до 3^мм3 с помощью ножниц Нойеса и скальпеля (рис. 2А). В случае более чем одной пробы образцы следует держать на льду в 10% FBS/HBSS 1x.
4. Перенесите ткани в центрифужную пробирку. Центрифуга при 350 x g при 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость для удаления фрагментов клеток и клеток крови.
5. Повторно суспендировать кусочки в диссоциационном буфере 1, содержащем 0,02% трипсина С-0,05% ЭДТА, в течение 10 мин при 37 °C при перемешивании (180 об/мин). Немедленно вымойте 10% модифицированным средством Eagle's medium (DMEM) от FBS/Dulbecco. Центрифугу в течение 5 мин при 350 г при 4 °C.
6. Промывают еще раз, повторно суспендировав гранулы в 10 мл буфера для промывки и центрифугируя при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C перед следующим этапом диссоциации.
7. Инкубируют поджелудочную железу в диссоциационном буфере 2 в течение 15 мин при 37 °C при перемешивании (180 об/мин).
8. Через 15 мин проводят механическую диссоциацию, энергично пипетируя фрагменты поджелудочной железы вверх и вниз в стерильных пипетках уменьшения размера (серологические пипетки объемом 25, 10 и 5 мл) 10 раз и доводят до 37 °C.
   1. Еще через 5 мин повторите механическую диссоциацию и с помощью световой микроскопии контролируйте диссоциацию в зависимости от количества одноклеточной суспензии. Обычно, если на этом этапе менее 90% суспензии состоит из изолированных единичных клеток, необходим более длительный инкубационный период. Используйте трипановый синий для контроля жизнеспособности клеток.
   2. Продолжайте инкубацию и отбирайте пробы для обнаружения диссоциации каждые 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время инкубации зависит от ткани и может варьироваться в зависимости от образца. Инкубация и диссоциация тканей должны закончиться, когда 90% клеток будут разделены на отдельные клетки или когда будет обнаружено снижение жизнеспособности.
9. После того, как ткань поджелудочной железы хорошо диссоциирует (что соответствует исчезновению фрагментов поджелудочной железы и нарастанию помутнения раствора) (рис. 2), остановить ферментативную реакцию путем двукратного промывания раствором с активностью фермента в течение 5 мин при 4 °С. С этого шага держите клеточную суспензию на льду.
10. Пропустите клеточную суспензию через нейлоновую сетку размером 70 мкм и проверьте жизнеспособность клетки под микроскопом. Меньшие размеры нейлоновой сетки могут снизить жизнеспособность клеток.
11. Ресуспендируйте и промойте гранулу 5-10 мл ледяного буферного промывочного раствора. Подсчитайте ячейки.
12. Если наблюдается несколько эритроцитов, обработайте клетки буфером для лизиса эритроцитов в течение 2 мин при комнатной температуре. В тех случаях, когда наблюдаются скопления, образец следует снова обработать трипсином, как описано в шаге 2.5. Жизнеспособность определяется с помощью трипанового синего под микроскопом, и если жизнеспособность составляет менее 80%, живые клетки следует выделять с помощью набора для удаления мертвых клеток с магнитно-активированной сортировкой клеток (MACS) со столбцами MACS MS (см. таблицу 1).

Результаты

В недавно опубликованной работе⁵ мы применили протокол, описанный выше, для изучения ранних стадий разработки PDAC с использованием мышиной модели. Мышь была генетически модифицирована, чтобы включить кассеты Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷, которые ?...

Обсуждение

В этой статье мы представляем протокол диссоциации тканей поджелудочной железы. Протокол прост, удобен в использовании и предоставляет инструмент для выделения жизнеспособных единичных клеток из ткани поджелудочной железы на разных стадиях злокачественного процесса, включая солидн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or Resource
70 µm nylon mesh	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Experimental Models: Organisms/Strains
Fetal Bovine Serum South American	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D mice	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS dead cells removal kit	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsin C-EDTA 0.05%	Biological industries	cat# 03-053-1A
Trypsin inhibitor	Roche	cat#T6522