Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

Riepilogo

Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.

Abstract

Il pancreas comprende due sistemi principali: il sistema endocrino, che produce e secerne ormoni, e il sistema esocrino, che rappresenta circa il 90% del pancreas e comprende cellule che producono e secernono enzimi digestivi. Gli enzimi digestivi sono prodotti nelle cellule acinose pancreatiche, immagazzinate in vescicole chiamate zimogeni, e vengono quindi rilasciati nel duodeno attraverso il dotto pancreatico per avviare i processi metabolici. Gli enzimi prodotti dalle cellule acinari possono uccidere le cellule o degradare l'RNA privo di cellule. Inoltre, le cellule acinari sono fragili e i comuni protocolli di dissociazione si traducono in un gran numero di cellule morte e proteasi e RNasi prive di cellule. Pertanto, una delle maggiori sfide nella digestione del tessuto pancreatico è il recupero di cellule intatte e vitali, in particolare cellule acinose. Il protocollo presentato in questo articolo mostra un metodo in due fasi che abbiamo sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il protocollo può essere utilizzato per digerire la pancreata normale, la pancreata che include lesioni pre-maligne o i tumori pancreatici che includono un gran numero di cellule stromali e immunitarie.

Introduzione

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tipi di cancro più aggressivi¹. L'evidenza clinica supporta l'idea che il PDAC si sviluppi da cellule del sistema esocrino, comprese le cellule acinari, nel corso di molti anni, guidate da mutazioni nel proto-oncogene^{KRAS 2}.

I tumori del pancreas comprendono molti tipi di cellule diverse ed è stato dimostrato che le cellule maligne contano solo per il 20%-50% della massa tumorale³. Diversi tipi di cellule interagiscono con le cellule epiteliali, supportano la loro trasformazione e migliorano la formazione e la crescita del tumore. Gli eventi precoci causano metaplasia acinare, che dà origine a lesioni microscopiche chiamate neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanINs), che in alcuni casi possono evolvere in PDAC⁴.

C'è una necessità critica di studiare queste interazioni e di individuare i segnali cardine. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è un potente metodo che rivela l'espressione genica con una risoluzione a singola cellula, monitorando così i cambiamenti che le cellule epiteliali subiscono, consentendo così l'esplorazione dello sviluppo del cancro al pancreas.

La dissezione e la digestione dei tessuti in singole cellule è la prima fase di un esperimento scRNA-seq. Diversi fattori rendono la digestione del tessuto pancreatico particolarmente impegnativa: i) le cellule acinari rappresentano oltre il 90% del pancreas e le cellule acinari contengono grandi quantità di enzimi digestivi, tra cui proteasi e RNasi che riducono la qualità delle librerie basate sull'RNA; (ii) le cellule acinari sono molto sensibili e possono lisare se vengono utilizzati protocolli standard; (iii) le cellule acinari esprimono un piccolo numero di geni a livelli molto elevati. Pertanto, se queste cellule vengono lisate durante l'esperimento, questo può contaminare il profilo di espressione genica osservato di altre cellule; (iv) il tessuto pancreatico recuperato dai tumori è desmoplastico, il che lo rende difficile da sezionare senza danneggiare le cellule. Pertanto, anche se è necessario mantenere un'elevata vitalità di tutti i tipi di cellule, il gran numero e la sensibilità delle cellule acinari aggiungono ulteriore complessità. Questi fattori impongono difficoltà nel raggiungere una sospensione a singola cellula che sia vitale per oltre l'80% e non abbia grumi, come richiesto per gli esperimenti scRNA-seq.

Qui, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza tripsina C e collagenasi P, insieme a un frequente monitoraggio dei tessuti. Ciò supporta la dissociazione in singole cellule pur mantenendo un'elevata vitalità per supportare il successo degli esperimenti scRNA-seq ^5,6.

Protocollo

Il comitato etico congiunto (Institutional Animal Care and Use Committee) dell'Università Ebraica (Gerusalemme, Israele) e dell'Hadassah Medical Center (Gerusalemme, Israele) ha approvato il protocollo di studio per il benessere degli animali (MD-18-15417-5 "Dinamica tissutale nel cancro del pancreas nei topi") e il protocollo qui presentato è conforme a tutte le normative etiche pertinenti per la sperimentazione e la ricerca sugli animali. L'Università Ebraica è un istituto accreditato a livello internazionale per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio.

NOTA: Il ceppo di topo #007908, il ceppo #019378 e il ceppo #008179 sono stati ottenuti dal laboratorio di Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; PTF1a-Cre^ER; I topi Rosa26^LSL-tdTomato) sono stati creati incrociando i ceppi di cui sopra. Per lo studio sono stati utilizzati topi di entrambi i sessi, di età compresa tra 6 settimane e 15 mesi. Il tamoxifene veniva preparato sciogliendo la polvere in olio di mais. Topi adulti (6-8 settimane di età, femmine e maschi) sono stati iniettati con tamoxifene per via sottocutanea nei giorni 0 e 2 alla dose di 400 mg/kg ed esaminati due volte alla settimana dopo l'iniezione. Non è stato possibile misurare i tumori in quanto erano localizzati internamente; Pertanto, l'eutanasia è stata eseguita se sono stati osservati segni clinici anomali secondo il protocollo etico. I topi sono stati soppressi in diversi momenti dopo l'induzione del tamoxifene, utilizzando isoflurano e lussazione cervicale.

1. Dissezione pancreatica

NOTA: Per una resa ottimale durante l'estrazione e per garantire una buona vitalità cellulare, è fondamentale una rapida dissezione. Per ridurre il tempo necessario per l'isolamento del pancreas, tutti gli strumenti e le attrezzature devono essere pronti sul ghiaccio prima dell'eutanasia del topo.

1. Sopprimere il topo mediante asfissia da CO₂ e verificare utilizzando la lussazione cervicale. Da questa fase in poi, tutte le procedure devono essere eseguite con strumenti di dissezione sterili.
2. Fissa il topo e spruzza l'addome con etanolo al 70%. Praticare un'incisione a forma di V di 2,5 cm nella zona genitale con forbici e pinze e procedere verso l'alto per aprire completamente la cavità addominale.
3. Individua lo stomaco sul lato sinistro del mouse. Individua il pancreas, che si trova vicino alla milza. Separare il pancreas dallo stomaco e dal duodeno utilizzando due pinze (senza strappi). Continuare e separare il pancreas dall'intestino tenue, dal digiuno e dall'ileo.
4. Sposta il pancreas sul lato destro del mouse. Separare le connessioni rimanenti tra il pancreas e la cavità toracica con una pinza per staccare completamente il pancreas e la milza attaccata.
5. Rimuovere il pancreas e stenderlo per l'esame in una capsula di Petri con ghiaccio.
   NOTA: È necessario prestare attenzione durante questa fase per rimuovere solo il pancreas e non rimuovere il tessuto adiposo mesenterico o altro tessuto adiacente insieme al pancreas, per evitare la contaminazione cellulare.

2. Dissociazione enzimatica e meccanica del pancreas

1. Preparare in anticipo i seguenti buffer.
   1. Tampone di dissociazione 1: 4 mL di tripsina C + 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (cfr. tabella 1) per ciascun campione.
   2. Tampone di dissociazione 2: 9 mL di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) 1x; 4% albumina sierica bovina (BSA); 1 mL di collagenasi P (10 mg/mL); 200 μL di inibitore della tripsina (10 mg/mL); e 200 μL di DNasi I (10 mg/mL) (vedere Tabella 1).
   3. Tampone di lavaggio: 50 mL di HBSS 1x; 2 g di BSA; 1 mL di inibitore della tripsina (10 mg/mL); e 1 mL di DNasi 1 (10 mg/mL).
   4. Soluzione per l'arresto dell'attività enzimatica: HBSS 1x contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) e 150 g di DNasi I (0,2 mg/mL).
2. Mettere il pancreas in una provetta da 50 ml su ghiaccio. Risciacquare il pancreas in FBS al 10% in HBSS 1x. Il tessuto adiposo galleggerà e il pancreas affonderà. Questo è un modo semplice per visualizzare e rimuovere rapidamente il tessuto adiposo bianco contaminante ancora attaccato al pancreas.
3. Trasferire il tessuto pancreatico del topo in una capsula di Petri sterile contenente 5 ml di HBSS 1x su ghiaccio. Tagliare il pancreas in piccoli pezzi da 1 a 3 mm³ usando le forbici Noyes e un bisturi (Figura 2A). In caso di più di un campione, i campioni devono essere conservati in ghiaccio al 10% FBS/HBSS 1x.
4. Trasferire i tessuti in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 350 x g a 4 °C per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante per rimuovere i frammenti cellulari e le cellule del sangue.
5. Risospendere i pezzi nel tampone di dissociazione 1 contenente tripsina C-0,05% EDTA allo 0,02% per 10 minuti a 37 °C con agitazione (180 giri/min). Lavare immediatamente con il 10% di terreno modificato di Eagle (DMEM) di FBS/Dulbecco. Centrifugare per 5 min a 350 g a 4 °C.
6. Lavare nuovamente risospendendo il pellet in 10 mL di tampone di lavaggio e centrifugando a 350 x g per 5 minuti a 4 °C prima della successiva fase di dissociazione.
7. Incubare il pancreas nel tampone di dissociazione 2 per 15 minuti a 37 °C con agitazione (180 giri/min).
8. Dopo 15 minuti, eseguire la dissociazione meccanica pipettando vigorosamente i frammenti pancreatici su e giù in pipette sterili di dimensioni decrescenti (pipette sierologiche da 25, 10 e 5 ml) 10 volte e riportare a 37 °C.
   1. Dopo altri 5 minuti, ripetere la dissociazione meccanica e utilizzare la microscopia ottica per monitorare la dissociazione in base alla quantità di sospensione unicellulare. Di solito se in questa fase meno del 90% della sospensione è costituito da singole cellule isolate, è necessario un tempo di incubazione più lungo. Usa il blu di tripano per monitorare la vitalità cellulare.
   2. Continuare con l'incubazione e prelevare campioni per rilevare la dissociazione ogni 5 minuti.
      NOTA: Il tempo totale di incubazione dipende dal tessuto e può variare da un campione all'altro. L'incubazione e la dissociazione tissutale dovrebbero terminare quando il 90% delle cellule viene separato in singole cellule o quando viene rilevata una riduzione della vitalità.
9. Dopo che il tessuto pancreatico è ben dissociato (in corrispondenza della scomparsa dei frammenti pancreatici e dell'aumento della torbidità della soluzione) (Figura 2), arrestare la reazione enzimatica lavando due volte con la soluzione di arresto dell'attività enzimatica per 5 minuti a 4 °C. A partire da questo passaggio, mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio.
10. Passare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 70 μm e verificare la vitalità cellulare al microscopio. Maglie di nylon di dimensioni più piccole possono ridurre la vitalità cellulare.
11. Risospendere e lavare il pellet con 5-10 mL di soluzione di lavaggio tamponata ghiacciata. Conta le celle.
12. Se si osservano diversi globuli rossi, trattare le cellule con un tampone di lisi dei globuli rossi per 2 minuti a temperatura ambiente. Nei casi in cui si osservano grumi, il campione deve essere trattato nuovamente con tripsina, come descritto al punto 2.5. La vitalità viene rilevata con il blu di tripano al microscopio e, se la vitalità è inferiore all'80%, le cellule vive devono essere isolate utilizzando il kit di rimozione delle cellule morte MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) con colonne MACS MS (vedere Tabella 1).

Risultati

In un lavoro⁵ pubblicato di recente, abbiamo applicato il protocollo sopra descritto per esplorare le prime fasi dello sviluppo di PDAC utilizzando un modello murino. Il topo è stato geneticamente modificato per includere le cassette Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷, che consentono l'espressione di KRAS costitutivamente attivo nelle cellule acinari dopo l'iniezione di tamoxifene.

Dopo la lus...

Discussione

In questo articolo presentiamo un protocollo per la dissociazione del tessuto pancreatico. Il protocollo è semplice, facile da usare e fornisce uno strumento per isolare singole cellule vitali dal tessuto pancreatico in diverse fasi del processo di malignità, compresi i tumori solidi. In studi precedenti, diversi tipi di collagenasi sono stati utilizzati per digerire il pancreas ^8,9. L'uso di una collagenasi molto potente, come la collagenasi D, si traduce in u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or Resource
70 µm nylon mesh	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Experimental Models: Organisms/Strains
Fetal Bovine Serum South American	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D mice	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS dead cells removal kit	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsin C-EDTA 0.05%	Biological industries	cat# 03-053-1A
Trypsin inhibitor	Roche	cat#T6522