생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부

요약

췌장 메타 플라스틱 세포는 췌장 종양을 일으키는 악성 세포의 전구체입니다. 그러나 온전한 생존 가능한 췌장 세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 췌장 조직 해리를 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 그런 다음 세포를 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 또는 2차원 또는 3차원 공동 배양에 사용할 수 있습니다.

초록

췌장에는 호르몬을 생산하고 분비하는 내분비계와 췌장의 약 90%를 차지하고 소화 효소를 생산하고 분비하는 세포를 포함하는 외분비계의 두 가지 주요 시스템이 있습니다. 소화 효소는 췌장 아시나 세포에서 생성되어 자이모겐(zymogen)이라고 하는 소포에 저장되었다가 췌관을 통해 십이지장으로 방출되어 대사 과정을 시작합니다. 아시나 세포에서 생성된 효소는 세포를 죽이거나 cell-free RNA를 분해할 수 있습니다. 또한 아시나 세포는 깨지기 쉬우며, 일반적인 해리 프로토콜은 많은 수의 죽은 세포와 cell-free 프로테아제 및 RNase를 초래합니다. 따라서 췌장 조직 소화의 가장 큰 과제 중 하나는 온전하고 생존 가능한 세포, 특히 아시나 세포를 회복하는 것입니다. 이 문서에 제시된 프로토콜은 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 개발한 2단계 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 정상 췌장, 전악성 병변을 포함하는 췌장 또는 많은 수의 기질 및 면역 세포를 포함하는 췌장 종양을 소화하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

췌관 선암(PDAC)은 가장 공격적인 암 유형^{중 하나입니다 1}. 임상적 증거는 PDAC가 KRAS 원발암유전자²의 돌연변이에 의해 수년에 걸쳐 아시나 세포를 포함한 외분비 시스템 세포에서 발생한다는 개념을 뒷받침합니다.

췌장 종양에는 다양한 세포 유형이 포함되며, 악성 세포는 종양 질량의 20%-50%에 불과하다는 것이 입증되었습니다³. 다양한 세포 유형이 상피 세포와 상호 작용하여 형질전환을 지원하며 종양 형성 및 성장을 촉진합니다. 초기 사건은 췌장 상피내 종양(PanIN)이라고 하는 미세한 병변을 유발하는 침상 상피화생을 유발하며, 경우에 따라 PDAC⁴로 발전할 수 있습니다.

이러한 상호 작용을 조사하고 중추적인 신호를 목표로 삼아야 합니다. 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 단일 세포 분해능으로 유전자 발현을 밝혀 상피 세포가 겪는 변화를 추적하여 췌장암 발병을 탐색할 수 있는 강력한 방법입니다.

단일 세포에 대한 조직 절개 및 분해는 scRNA-seq 실험의 첫 번째 단계입니다. 몇 가지 요인이 췌장 조직 소화를 특히 어렵게 만듭니다: i) 아시나 세포는 췌장의 90% 이상을 차지하고 아시나 세포는 RNA 기반 라이브러리의 품질을 떨어뜨리는 프로테아제 및 RNase를 포함한 많은 양의 소화 효소를 함유하고 있습니다. (ii) 아시나 세포는 매우 민감하며 표준 프로토콜을 사용하는 경우 용해될 수 있습니다. (iii) 아시나 세포는 매우 높은 수준에서 소수의 유전자를 발현합니다. 따라서 이러한 세포가 실험 중에 용해되면 다른 세포의 관찰된 유전자 발현 프로파일을 오염시킬 수 있습니다. (iv) 종양에서 회수된 췌장 조직은 탈형성(desmoplastic)이기 때문에 세포를 손상시키지 않고는 절개하기 어렵다. 따라서 모든 세포 유형의 높은 생존율을 유지하는 것이 필요하지만 아시나 세포의 많은 수와 감도는 복잡성을 더합니다. 이러한 요인은 scRNA-seq 실험에 필요한 것처럼 80% 이상 생존 가능하고 응집이 없는 단일 세포 현탁액을 달성하는 데 어려움을 초래합니다.

여기서는 빈번한 조직 모니터링과 함께 트립신 C와 콜라겐분해효소 P를 사용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이는 scRNA-seq 실험 ^5,6의 성공을 지원하기 위해 높은 생존력을 유지하면서 단일 세포로의 해리를 지원합니다.

프로토콜

히브리 대학교(이스라엘 예루살렘)와 하다사 메디컬 센터(이스라엘 예루살렘)의 공동 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)는 동물 복지를 위한 연구 프로토콜(MD-18-15417-5 "생쥐의 췌장암 조직 역학")을 승인했으며, 여기에 제시된 프로토콜은 동물 실험 및 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 히브리 대학교는 국제 공인 기관인 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회입니다.

참고: 마우스 균주 스톡 #007908, 스톡 #019378 및 스톡 #008179는 Jackson의 실험실에서 수득하였다. PRT(크라스+/LSL-G12D; PTF1a-CRE^ER입니다. Rosa26^LSL-tdTomato) 마우스는 상기 균주를 교배하여 생성하였다. 생후 6주에서 15개월 사이의 남녀 생쥐가 연구에 사용되었다. 타목시펜은 분말을 옥수수 기름에 용해시켜 제조하였다. 성인 마우스 (6-8 주 나이, 여성 및 남성)는 400 mg/kg의 복용량으로 0 일과 2 일에 타목시펜을 피하 주사하고 주사 후 일주일에 두 번 검사했습니다. 종양이 내부에 위치했기 때문에 종양을 측정하는 것은 불가능했습니다. 따라서 윤리 프로토콜에 따라 비정상적인 임상 징후가 관찰되면 안락사를 수행했습니다. 마우스는 타목시펜 유도 후 다른 시점에서 이소플루란과 자궁경부 탈구를 사용하여 안락사시켰다.

1. 췌장 박리

참고: 추출 중 최적의 수율을 유지하고 우수한 세포 생존율을 보장하려면 신속한 해개가 중요합니다. 췌장 격리에 필요한 시간을 단축하려면 쥐를 안락사시키기 전에 모든 기구와 장비를 얼음 위에 준비해야 합니다.

1. CO₂ 질식으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 사용하여 확인합니다. 이 단계부터 모든 절차는 멸균 해부 기구를 사용하여 수행해야 합니다.
2. 마우스를 고정하고 복부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위와 집게로 생식기 부위를 2.5cm의 V자 모양으로 절개하고 위쪽으로 진행하여 복강을 완전히 엽니다.
3. 마우스의 왼쪽에서 위를 찾습니다. 비장 근처에 있는 췌장을 찾습니다. 두 개의 집게를 사용하여 위와 십이지장에서 췌장을 분리합니다(찢지 않음). 계속해서 췌장을 소장, 장, 회장에서 분리합니다.
4. 췌장을 마우스의 오른쪽으로 이동합니다. 췌장과 흉강 사이의 나머지 연결부를 겸자로 분리하여 췌장과 부착된 비장을 완전히 분리합니다.
5. 췌장을 제거하고 얼음 위의 페트리 접시에 펼쳐 검사를 받으십시오.
   알림: 이 단계에서는 세포 오염을 방지하기 위해 췌장만 제거하고 장간막 지방 조직 또는 췌장과 함께 기타 인접 조직을 제거하지 않도록 주의해야 합니다.

2. 췌장의 효소 및 기계적 해리

1. 다음 버퍼를 미리 준비합니다.
   1. 해리 완충액 1: 각 샘플에 대해 트립신 C 4mL + 인산염 완충 식염수(PBS) 6mL( 표 1 참조).
   2. 해리 완충액 2: Hanks의 균형 염 용액(HBSS) 9mL 1x; 4% 소 혈청 알부민(BSA); 콜라겐분해효소 P 1mL(10mg/mL); 트립신 억제제 200μL(10mg/mL); 및 200μL의 DNase I(10mg/mL)을 사용합니다( 표 1 참조).
   3. 세척 완충액: HBSS 1x 50mL; BSA 2g; 트립신 억제제 1mL(10mg/mL); 및 DNase 1 1 (10 mg/mL) 1 mL.
   4. 효소 활성 정지 용액: 5% 소 태아 혈청(FBS) 및 150g의 DNase I(0.2mg/mL)을 함유한 HBSS 1x.
2. 얼음 위의 50mL 튜브에 췌장을 넣습니다. HBSS 1x의 10% FBS로 췌장을 헹굽니다. 지방 조직이 떠오르고 췌장이 가라앉습니다. 이것은 췌장에 여전히 붙어 있는 오염된 백색 지방 조직을 시각화하고 신속하게 제거하는 쉬운 방법입니다.
3. 생쥐의 췌장 조직을 얼음 위에 5mL의 HBSS 1x가 들어 있는 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. Noyes 가위와 메스를 사용하여 췌장을 1-3mm3의 작은 조각으로 자릅니다(그림 2A). 두 개 이상의 샘플이 있는 경우 샘플은 10% FBS/HBSS 1x의 얼음 위에 보관해야 합니다.
4. 조직을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 원심분리기 상층액을 흡인하고 폐기하여 세포 조각과 혈액 세포를 제거합니다.
5. 교반(180rpm)으로 37°C에서 10분 동안 0.02% 트립신 C-0.05% EDTA를 포함하는 해리 완충액 1에 조각을 재현탁시킵니다. 즉시 10% FBS/Dulbecco의 변형 Eagle's medium(DMEM)으로 씻으십시오. 4°C에서 350g에서 5분 동안 원심 분리합니다.
6. 펠릿을 10mL의 세척 완충액에 다시 현탁시키고 다음 해리 단계 전에 4°C에서 5분 동안 350 x g 에서 원심분리하여 다시 세척합니다.
7. 췌장을 해리 완충액 2에서 37°C에서 15분 동안 교반(180rpm)하여 배양합니다.
8. 15분 후 크기가 줄어드는 멸균 피펫(25, 10 및 5mL 혈청학적 피펫)에서 췌장 절편을 위아래로 세게 피펫팅하여 기계적 해리를 10회 수행하고 37°C로 되돌립니다.
   1. 추가 5분 후 기계적 해리를 반복하고 광학 현미경을 사용하여 단일 셀 현탁액의 양에 따라 해리를 모니터링합니다. 일반적으로 이 단계에서 현탁액의 90% 미만이 분리된 단일 세포로 구성된 경우 더 긴 배양 시간이 필요합니다. 트리판 블루를 사용하여 세포 생존율을 모니터링하십시오.
   2. 배양을 계속하고 샘플을 채취하여 5분마다 해리를 감지합니다.
      참고: 총 배양 시간은 조직에 따라 다르며 샘플마다 다를 수 있습니다. 배양 및 조직 해리는 세포의 90%가 단일 세포로 분리되거나 생존율의 감소가 감지될 때 종료되어야 합니다.
9. 췌장 조직이 잘 해리된 후(췌장 조각의 소실 및 용액의 탁도 증가에 해당)(그림 2), 4°C에서 5분 동안 효소 활성 정지 용액으로 두 번 세척하여 효소 반응을 중지합니다. 이 단계에서 셀 서스펜션을 얼음 위에 유지하십시오.
10. 세포 현탁액을 70μm 나일론 메쉬에 통과시키고 현미경으로 세포 생존율을 확인합니다. 나일론 메쉬의 크기가 작을수록 세포 생존율이 감소할 수 있습니다.
11. 펠릿을 재현탁하고 5-10mL의 얼음처럼 차가운 완충 세척액으로 세척합니다. 셀을 셉니다.
12. 여러 적혈구가 관찰되면 적혈구 용해 완충액으로 실온에서 2분 동안 치료합니다. 덩어리가 관찰되는 경우 2.5단계에서 설명한 대로 샘플을 트립신으로 다시 처리해야 합니다. 현미경으로 트리판 블루로 생존율을 검출하고, 생존율이 80% 미만인 경우 MACS MS 컬럼이 있는 MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting) 죽은 세포 제거 키트를 사용하여 살아있는 세포를 분리해야 합니다( 표 1 참조).

결과

최근 발표된 연구⁵에서는 위에서 설명한 프로토콜을 적용하여 마우스 모델을 사용하여 PDAC 개발의 초기 단계를 탐색했습니다. 마우스는 타목시펜 주입 후 아시나 세포에서 구성적으로 활성화된 KRAS의 발현을 허용하는 카세트 Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷을 포함하도록 유전자 조작되었습니다.

자궁경?...

토론

이 글에서는 췌장 조직 해리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 간단하고 사용하기 쉬우며 고형 종양을 포함한 악성 종양 과정의 여러 단계에서 췌장 조직에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 도구를 제공합니다. 이전 연구에서는 췌장을 소화하기 위해 다양한 유형의 콜라겐 분해 효소가 사용되었습니다 ^8,9. 콜라겐분해효소 D와 같은 매우 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or Resource
70 µm nylon mesh	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Experimental Models: Organisms/Strains
Fetal Bovine Serum South American	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D mice	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS dead cells removal kit	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsin C-EDTA 0.05%	Biological industries	cat# 03-053-1A
Trypsin inhibitor	Roche	cat#T6522