عزل وزراعة العقدة الدهليزية والحلزونية من القوارض الوليدية لتسجيلات المشبك الرقعي

Summary

تظهر هنا طرق توفر تعليمات مفصلة لتشريح وفصل وزراعة وتسجيل المشبك التصحيحي من العقدة الدهليزية والخلايا العصبية العقدية الحلزونية في الأذن الداخلية.

Abstract

يسمح التشكل المضغوط للخلايا العصبية العقدية المعزولة والمستزرعة في الأذن الداخلية بتوصيف مفصل للقنوات الأيونية ومستقبلات الناقل العصبي التي تساهم في تنوع الخلايا عبر هذه الفئة من السكان. يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لنجاح تشريح وفصل وزراعة قصيرة الأجل للسوماتا من الخلايا العصبية ثنائية القطب في الأذن الداخلية لغرض تسجيلات المشبك الرقعة. يتم توفير تعليمات مفصلة لإعداد الخلايا العصبية العقدة الدهليزية مع التعديلات اللازمة اللازمة لطلاء الخلايا العصبية العقدية الحلزونية. يتضمن البروتوكول تعليمات لإجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية بالكامل في تكوين التصحيح المثقوب. مثال على النتائج التي تميز تسجيلات مشبك الجهد للتيارات بوساطة النيوكليوتيدات الحلقية المنشطة بفرط الاستقطاب (HCN) تسلط الضوء على استقرار تكوين تسجيل التصحيح المثقوب مقارنة بتكوين الرقعة الممزقة القياسية. يمكن استخدام مزيج من هذه الطرق ، سوماتا معزولة بالإضافة إلى تسجيلات مشبك رقعة مثقبة ، لدراسة العمليات الخلوية التي تتطلب تسجيلات طويلة ومستقرة والحفاظ على البيئة داخل الخلايا ، مثل الإشارات من خلال مستقبلات البروتين G.

Introduction

تربط الخلايا العصبية ثنائية القطب في العصب الدهليزي القوقعي خلايا الشعر الحسية للأذن الداخلية بجذع الدماغ. هم الناقلون الرئيسيون للمعلومات حول الصوت وحركات الرأس. الأضرار التي لحقت هذه الخلايا الهامة يؤدي إلى الصمم واضطرابات التوازن. تتكون الأجزاء الدهليزية والسمعية من العصب من أنواع خلايا متميزة متنوعة شكليا ووظيفيا ^1,2. في النظام الدهليزي ، تطلق مجموعتان فرعيتان واردتان تلقائيا على فترات منتظمة أو غير منتظمة². يعتقد أن توقيت ارتفاع الوارد يعكس تنوعا أساسيا في تكوين القناة الأيونية ^3,4. في النظام السمعي ، هناك نوعان من المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) ؛ في حين أن النوع الأول من SGNs يتصل بخلايا الشعر الداخلية الفردية⁵ ، فإن النوع الثاني من SGNs يتصل بخلايا شعرية خارجية متعددة⁵. تشير التسجيلات في المختبر من الثقافات شبه السليمة والأنماط العضوية إلى اختلافات في خصائص الغشاء للنوع الأول والنوع الثاني SGNs ^6,7.

توجد أيضا العديد من القنوات الأيونية ومستقبلات الناقلات العصبية الموجودة في أطراف هذه الخلايا العصبية في أجسامها الخلوية. على هذا النحو ، يمكن دراسة ثقافات العقدة الجسدية الدهليزية والحلزونية المعزولة في المختبر لفهم كيفية مساهمة القنوات الأيونية ومستقبلات الناقل العصبي في استجابة هذه الخلايا العصبية. يسمح التشكل المضغوط لأجسام الخلايا المعزولة بتسجيلات كهربائية عالية الجودة ، ومناسبة للتوصيف التفصيلي للقنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي ومستقبلات الناقل العصبي. يسمح الوصول السهل إلى مجموعة متنوعة تمثيلية من الأنواع الفرعية للخلايا العصبية بإجراء تحليل عالي الإنتاجية لتنوع الخلايا.

تقدم هذه المقالة طريقة لعزل وزراعة أجسام الخلايا العقدية المنفصلة عن الجزء العلوي من العقدة الدهليزية في الفئران في يوم ما بعد الولادة (P) 9 إلى P20. كما يتم تقديم اقتراحات لتوسيع هذه الطرق لتشمل العقدة الحلزونية ، بالإضافة إلى الخطوات المطلوبة لاستخراج الخلايا العقدية وفصلها وطلائها بنجاح. هذه الأساليب هي تطور لتلك التي تم ابتكارها في المنشورات من مختلف المختبرات^8،9،10. تتضمن هذه الورقة أيضا إرشادات لاختيار الخلايا السليمة لتسجيلات المشبك الرقعي.

أخيرا ، يحدد البروتوكول إجراء تسجيل مشبك التصحيح باستخدام تكوين التصحيح^{المثقب 11}. على الرغم من أن تكوين التصحيح المثقوب يستغرق وقتا أطول وأكثر تحديا من الناحية الفنية من تكوين التصحيح الممزق الأكثر شيوعا ، إلا أنه أفضل للحفاظ على بيئة السيتوبلازم التي تسمح بجلسات تسجيل طويلة ومستقرة. تتضح فوائد تكوين التسجيل هذا هنا من خلال تحسين استقرار التيارات الكاتيونية المنشطة بفرط الاستقطاب في الرقعة المثقبة بالنسبة إلى تسجيلات التصحيح الممزق.

تم تنظيم هذا البروتوكول في خمسة أقسام. تصف الأقسام 1-3 الحلول والأدوات التي يمكن إعدادها وتخزينها مسبقا. يصف القسم 4 خطوات تشريح وطلاء الدهليزي و SGNs. يصف القسم 5 خطوات التسجيل من الخلايا العصبية بعد فترة في الثقافة. في أيدينا ، يتم تنفيذ القسم 4 والقسم 5 على مدى 2 أيام متتالية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع استخدامات الموصوفة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة جنوب كاليفورنيا. في هذا البروتوكول هي فئران Long Evans التي تتراوح أعمارها بين P3 و P25 من كلا الجنسين والتي تم الحصول عليها من مختبرات Charles River ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطرق على سلالات القوارض الأخرى. يجب ارتداء معطف وقفازات المختبر أثناء جميع الإجراءات ، بالإضافة إلى نظارات واقية من الرذاذ عند صنع الحلول.

1. الاستعدادات

ملاحظة: يمكن إجراء الحلول والأدوات الموضحة في هذا القسم في وقت مبكر لاستخدامها في يوم التشريح والتسجيل.

1. إعداد وسائل الإعلام Liebovitz تستكمل مع 10 mM HEPES (حل L-15). تصف الخطوات التالية صنع 1 لتر من محلول L-15.
   1. صب 990 mL من H₂O منزوع الأيونات في كأس زجاجية واحدة. قم بقياس وإضافة 2.386 جم (10 مللي مول) من HEPES. أضف زجاجة واحدة من 1 لتر من مسحوق محلول L-15.
      ملاحظة: يتمتع مسحوق L-15 بعمر افتراضي أطول ويشغل مساحة تخزين أقل. بدلا من ذلك ، قم بشراء محلول L-15 ومكمل مع HEPES. يحتوي الخيار الأخير أيضا على خيار استخدام محلول خال من الفينول ، وهو مفيد للتصوير الفلوري.
   2. حرك المحلول على طبق التحريك. باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، أضف ببطء 1 N هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) للحصول على درجة حموضة بين 7.34 و 7.36.
   3. أضف H₂O منزوع الأيونات حتى يصل حجم المحلول إلى 1000 مل. قم بتصفية المحلول باستخدام غشاء بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول L-15 عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع تقريبا. في حالة استخدام L-15 المصنوع من الفينول الأحمر ، سيتحول المحلول إلى اللون الوردي إذا كان قاعديا جدا (الرقم الهيدروجيني > 7.4) أو برتقاليا إذا كان حمضيا جدا (الرقم الهيدروجيني < 7.34).
2. تحضير وسط الاستزراع للخلايا العصبية العقدية الدهليزية (VGNs) (مع تعديل ل SGNs). اتبع الخطوات أدناه لجعل 50 مل من وسط الثقافة:
   1. أضف 47.5 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي GluMAX-I إلى دورق زجاجي نظيف.
   2. قم بقياس وإضافة 0.1194 جم (10 مللي مول) من HEPES. يقاوم هذا المخزن المؤقت الإضافي تغيرات الأس الهيدروجيني أثناء استقرار الخلايا ، قبل نقلها إلى الحاضنة.
   3. أضف 2.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS). هذا يجعل 5٪ من حيث الحجم FBS في حجم إجمالي 50 مل من الوسط. بالنسبة لاستعدادات SGN ، يتم استبدال 2.5 مل من FBS ب 0.5 مل من N2 و 1 مل من حلول B27.
   4. حرك المحلول على طبق التحريك. باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، أضف ببطء 1 N NaOH للحصول على درجة حموضة بين 7.38 و 7.4.
   5. أضف 0.5 مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح معقم 0.22 ميكرومتر. يخزن المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   6. قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستخدام ، انقل وسائط المزرعة إلى دورق زراعة الأنسجة مع غطاء تنفيس. ضع القارورة مع وسائط الاستزراع في حاضنة بتركيز 5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية.
3. تحضير الحل الداخلي المثقب
   ملاحظة: هنا ، يتم استخدام 100 مل من المحلول الداخلي المثقوب لتسجيل الخلية بأكملها (يتم تلخيص الوصفة في الجدول 1). يمكن تحضير هذه المحاليل مسبقا وتخزينها عند -20 درجة مئوية. يمكن تخزين القسامات إلى أجل غير مسمى عند -20 درجة مئوية إذا لم تخضع لدورة متكررة من التجميد والذوبان.
   1. قبل 6 أشهر من الموعد المحدد ، قم بصنع وتخزين حلول المخزون لما يلي: 1 M KCl ، 0.5 M Mg₂Cl (سداسي الهيدرات) ، و 0.5 M CaCl₂. يخزن في زجاجات محكمة الإغلاق لمدة تصل إلى 6 أشهر عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: من الجيد التحقق من أسمولية محاليل المخزون (2000 مللي متر لمحلول مخزون 1 مليون كيلولتر ؛ 1500 مللي متر لمحاليل Mg₂Cl و CaCl₂ ) للتأكد من الوصول إلى التركيز المستهدف. لا تستخدمه إذا أصبح المحلول غائما أو تشكل ترسبات. يمكن أن تكون هذه نقطة توقف محتملة.
4. في يوم صنع الحل الداخلي ، اتبع الخطوات التالية باستخدام حلول المخزون من الخطوة 1.3.
   1. قم بقياس 100 mL من milli-Q (MQ) H₂O. اسحب 40 مل من 100 مل واتركه جانبا في كأس زجاج نظيف.
   2. أضف ال 60 مل المتبقية من H₂O إلى دورق نظيف ومعقم سعة 100 مل. أضف 2.5 مل من 1 M KCl ، و 1 مل من 0.5 M Mg₂Cl-hexahydrate ، و 0.02 mL من 0.5 M CaCl₂.
   3. أضف قضيب تقليب وضع الدورق على طبق التقليب. يقلب حتى يذوب تماما. أضف 1.307 جم من K₂SO₄. يقلب حتى يذوب K₂SO₄ .
   4. تزن 0.1192 جم من HEPES (الهدف 5 mM في الحجم النهائي 100 mL) وتضاف إلى المحلول. يقلب حتى يذوب.
      ملاحظة: تأكد من إذابة جميع المكونات بالكامل ، حيث يستغرق الأمر أحيانا وقتا حتى يذوب K₂SO₄ .
   5. تزن 0.1902 جم من جلايكول الإيثيلين مكرر (β-أمينو إيثيل الأثير)-N,N,N′,N′-حمض رباعي الخليك (EGTA) (الهدف 5 mM في الحجم النهائي 100 mL) وأضفه إلى المحلول. نظرا لأن EGTA لا يذوب تماما في محلول حمضي ، ضع الكأس الزجاجية على طبق تقليب وأدخل مسبار الأس الهيدروجيني.
   6. أثناء التقليب، قم بمعايرة 1 M KOH ببطء حتى يذوب EGTA تماما. توقع أن يحدث هذا عندما يكون الرقم الهيدروجيني بين 6 و 7. استمر في إضافة KOH ببطء حتى يصبح الرقم الهيدروجيني النهائي 7.35 (حوالي 1.2 إلى 1.3 مل من KOH في المجموع).
   7. أضف MQH₂O لإحضار المحلول إلى حجم نهائي يبلغ 100 مل وحركه. تحقق من أسمولية المحلول (الهدف 270 mOsm / kg لمحلول الرقعة المثقبة) باستخدام مقياس الأسموزي.
   8. قم بتصفية المحلول الداخلي المثقوب باستخدام مرشح معقم 0.22 ميكرومتر. يحفظ في 5 مل من القسامات عند -20 درجة مئوية. استخدم قسمة جديدة لكل جلسة تسجيل جديدة.
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه نقطة توقف محتملة.

2. تصنيع ماصات التثليج

ملاحظة: يمكن إعادة استخدام ماصات التثليج لإجراء تجارب متعددة. اغسل الماصات بالإيثانول والماء ومحلول L-15 قبل كل استخدام ونظفها بالماء والإيثانول بعد كل استخدام. يخزن بعناية بين الاستخدامات.

1. لتحضير ماصات التثليج لتفكك الخلايا ، أمسك ماصة باستور الزجاجية بلهب موقد بنسن. بمجرد أن يبدأ الطرف الزجاجي في الذوبان ، قم بتمديد الزجاج للخارج إلى قطر الطرف المطلوب. اسحب أحد طرفي الماصة بعيدا عن اللهب لإنشاء انحناء صغير.
2. اجعل الماصة المنحنية بالقرب من المجهر. باستخدام بلاط التهديف ، سجل وكسر الزجاج بالقطر المطلوب.
3. مرر طرف الماصة فوق الجزء العلوي من لهب موقد بنسن. سيؤدي ذلك إلى تلميع الحواف الخشنة بالقرب من الحافة بسرعة. تحقق للتأكد من أن الطرف غير مغلق باللهب.
4. كرر العملية حتى يتم تحضير أربع أو خمس ماصات بأحجام مختلفة.

3. تصنيع ماصات التصحيح

ملاحظة: قم بإعداد مجموعة من ماصات التصحيح قبل جلسة التسجيل ، ولكن بعد تشريح العقدة والثقافة. على الرغم من أن الأقطاب الكهربائية التي يتم تصنيعها واحدة تلو الأخرى أثناء جلسة التسجيل هي الأمثل في الأداء ، فقد تم تحقيق نجاح معقول عندما يتم تصنيعها كدفعة في الليلة السابقة. قم بتخزين الماصات في وعاء زجاجي مغطى لحماية الأطراف من الغبار.

1. استخدم مجتذب قطب كهربائي عمودي وقطر خارجي 1.5 مم / ماصات زجاجية من البورسليكات ذات القطر الداخلي 1.17 مم. تأكد من أن الزجاج خال دائما من الغبار وبصمات الأصابع.
2. اسحب 8-10 ماصات تسجيل باستخدام برنامج من خطوتين ، على النحو الموصى به لماصات التصحيح من قبل الشركة المصنعة.
3. افحص وتلميع كل طرف ماصة تسجيل بالحرارة باستخدام microforge ؛ يعزز التلميع الحراري إحكاما أفضل. تتراوح مقاومة الماصة المستهدفة بين 4 و 8 MΩ.
4. قم بتخزين الماصات المصقولة في حاوية مغطاة. يمكن التعامل مع هذا كنقطة توقف في التجربة.
   ملاحظة: يتطلب تحسين قطر الماصة للوصول إلى نطاق المقاومة المستهدف بعض التجربة والخطأ في الخطوتين 3.2 و 3.3. تحتوي معظم أنظمة المشبك التصحيحي التجارية على ميزة اختبار غشاء مدمجة لقياس مقاومة القطب في محلول الحمام. يتم حساب المقاومة كنسبة من تيار خرج الحالة المستقرة استجابة لمحفز خطوة 5 mV المطبق. يجب أولا ضبط إعدادات السحب في الخطوة 3.1 والتلميع في الخطوة 3.2 باستخدام الماصات التجريبية ، حتى تقع مقاومة الماصات التجريبية ضمن نطاق 4 إلى 8 MΩ.
5. في يوم التسجيل ، قم بتغطية أطراف الماصة لتقليل سعة الماصة وضوضاء التسجيل. للقيام بذلك ، لف شريطا صغيرا من فيلم البارافين على عمود الماصة. ليس من الضروري التفاف على طول الطريق إلى الحافة.
   ملاحظة: تتمثل الإستراتيجية البديلة في طلاء وتسخين مطاط صناعي من السيليكون على عمود الماصة¹².

4. استخراج العقدة الدهليزية وطلاء الخلايا العصبية الدهليزية

1. التحضير للتشريح
   1. تحضير خليط إنزيم من محلول L-15 مع 0.05 ٪ كولاجيناز و 0.25 ٪ تربسين. على سبيل المثال ، أضف 0.001 جم من كولاجيناز و 0.005 جم من التربسين إلى 2 مل من محلول L-15 في دورق ، وأضف محرك مغناطيسي صغير ، وحركه حتى يمتزج تماما. توضع جانبا في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بإعداد مقصلة تم الحصول عليها تجاريا عن طريق وضع مناشف ورقية على جانب المقصلة وتحتها لتقليل تعرض سطح الطاولة والأسطح الأخرى للدم والمواد البيولوجية الأخرى.
   3. ضع مقصا كبيرا من الفولاذ المقاوم للصدأ وملقط كبير ومقص زنبركي كبير. احتفظ بزجاجة رذاذ كبيرة تحتوي على 70٪ إيثانول في متناول اليد لتنظيف الرأس.
   4. املأ دورق سعة 100 مل بمحلول L-15 وضعه على الثلج. أكسجين محلول L-15.
   5. ضع المقص الزنبركي والمقص الجراحي والملقط والمشرط وماصة النقل (انظر جدول المواد).
   6. قم بإعداد طبق بتري 60 مم (للتشريح الإجمالي) وطبقين بتري 35 مم (لتنظيف / تشريح العقد الدقيقة). املأ الطبق مقاس 60 مم بمحلول L-15 المؤكسج باستخدام حقنة سعة 30 مل بطرف مرشح 0.22 ميكرومتر.
2. القتل الرحيم وتنظيف الرأس والتشريح
   1. وزن الجراء لحساب الجرعة المناسبة من التخفيف المميت زائد لإدارتها داخل الصفاق (~ 0.01 مل لكل 10 غرام).
   2. بمجرد الوصول إلى مستوى عميق من التخدير ، كما تم تقييمه من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم ، قم بقطع الرأس باستخدام المقصلة.
   3. شطف الرأس جيدا مع 70 ٪ من الإيثانول ثم جيدا مع محلول L-15.
   4. تماما إزالة الجلد من الجمجمة. قم بتقسيم الرأس باستخدام مقص زنبركي كبير عن طريق البدء من نقطة دخول الحبل الشوكي إلى الدماغ وإجراء قطعتين ، الأولى تقطع الجزء العلوي من الجمجمة والثانية من خلال أسفل الفك. الانتهاء من تقسيم الرأس باستخدام مقص جراحي.
   5. ضع نصفي الرأس في جانب الدماغ لأسفل في طبق بتري 60 مم مملوء بمحلول L-15. ضع الأنسجة الطازجة التي لا يتم تشريحها حاليا على الجليد.
3. استخراج العقدة الدهليزية العلوية
   1. استخرج الدماغ باستخدام مقص جراحي مغلق. قطع وإزالة العصب القحفي لفصل الدماغ تماما عن الجمجمة.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون الكبسولة الأذنية (على شكل الرقم 8) مرئية في الجزء الخلفي من الرأس.
   2. باستخدام ملقط والبدء من الجزء الخلفي من الرأس ، اسحب المواد الغشائية الشفافة.
   3. قطع الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام مقص جراحي. قم بإزالة الأنسجة الزائدة من مؤخرة الرأس والرقبة لجعل منطقة التشريح والكبسولة الأذنية أنظف ويسهل الوصول إليها.
      ملاحظة: تجنب جعل الطبق غائما جدا عن طريق التخلص من الأنسجة الزائدة طوال العملية.
   4. نقل الأنسجة إلى طبق بتري الثاني مع محلول L-15 الطازج. حدد موقع الكبسولة الأذنية والأعصاب الدهليزية السمعية والعلوية والأعصاب الدهليزية السفلية. قطع العصب السمعي وفصل العقد العلوية والسفلية باستخدام مقص زنبركي صغير.
      ملاحظة: على الرغم من أن سوماتا العصب الدهليزي موجودة في كل من العقد السفلية (الأرق) والعلوية (السميكة) ، إلا أن الخلايا المستخرجة من العقدة العلوية تتمتع ببقاء أفضل.
   5. باستخدام مشرط ، احلق بلطف من الحافة العظمية لإضعاف المنطقة العظمية ، والتي يغوص العصب تحتها في الكبسولة العظمية. قم بإزالة الحطام بعناية باستخدام ملقط ناعم ، وفضح الجزء المتورم بالكامل من العقدة.
   6. استخدم مقص الزنبرك الناعم لقطع العقدة وفصلها عن فرع العصب المحيطي الذي يغوص نحو الرحم.
   7. قم بإزالة العقدة العلوية باستخدام ملقط دقيق ، مع التأكد من عدم الضغط بالقرب من الأنسجة العقدية. انقله إلى طبق بتري 35 مم بمحلول L-15 طازج.
   8. قبل المتابعة ، سخن محلول الإنزيم مسبقا: صب خليط الإنزيم في طبق بتري 35 مم وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
   9. نظف العقدة باستخدام ملقط ناعم ومقص زنبركي صغير عن طريق إزالة العظام (التي تظهر بيضاء ومتبلورة في الهيكل) والأنسجة الزائدة والألياف العصبية وأي هياكل أخرى غير ضرورية. احرص على تقليل إزالة أي نسيج عقدي.
4. تفكك الأنسجة والطلاء
   1. انقل العقد التي تم تنظيفها إلى محلول الإنزيم المسخن مسبقا وضعه مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 إلى 40 دقيقة. يكتمل العلاج بالإنزيم بمجرد أن يبدأ النسيج في التفكك ولكنه يبقى في قطعة واحدة. سيؤدي الإفراط في معالجة الأنسجة بالإنزيمات إلى الذوبان الكامل للعقد قبل التثليج.
      ملاحظة: يعتمد مقدار الوقت الذي يخضع فيه النسيج للعلاج الأنزيمي على عمر. على سبيل المثال ، يتم التعامل مع العقد من الفئران P9 بالإنزيم لمدة 25 دقيقة ، ويتم التعامل مع العقد من الفئران P15 بالإنزيم لمدة 35 دقيقة.
   2. نقل العقد إلى طبق بتري 35 ملم مع محلول L-15 الطازج واحتضانها لمدة 2-3 دقائق.
   3. انقل العقد إلى طبق بتري آخر مقاس 35 مم مملوء بوسائط استزراع مفلترة.
   4. باستخدام ماصة صغيرة 200 ميكرولتر ، ماصة قطرة ~ 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع المفلترة على طبق زجاجي مطلي. لا تضيف الكثير من المحلول ، حيث من المهم الحفاظ على التوتر السطحي لتشكيل فقاعة من المحلول تبقى فوق الغطاء الزجاجي.
   5. انقل العدد المطلوب من العقد (من واحد إلى أربعة) إلى قسيمة الغطاء.
   6. ارسم كمية صغيرة من وسط الاستزراع من طبق الاستزراع لشطف ماصة التثليج بوسط لمنع الأنسجة من الالتصاق بجوانب الماصة الزجاجية. سحن عن طريق تمرير الأنسجة بلطف وبشكل متكرر من خلال ماصة حتى يتم فصل العقد بما فيه الكفاية.
      ملاحظة: لا تفرط في إرهاق الأنسجة لمحاولة تعليق خلية واحدة أو السماح للخلايا بالانهيار في قاع الطبق باستخدام الضغط الإيجابي المفرط. أيضا ، تجنب تشكيل فقاعات الهواء ، لأن هذا سوف يقلل من بقاء الخلية. التثليج اللطيف هو المفتاح لتحقيق بقاء الخلية بنجاح.
   7. دع الخلايا ترتاح لمدة 5 دقائق. تحقق تحت المجهر الضوئي لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد استقرت على الغطاء.
   8. ضع طبق الاستزراع بعناية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة. مرة أخرى ، تأكد من الحفاظ على فقاعة المحلول سليمة.
      ملاحظة: عند الزراعة لمدة تزيد عن 24 ساعة ، قم بتحديث وسائط الثقافة يوميا. يمكن أن تكون هذه نقطة توقف محتملة.
5. تصفيح SGNs
   1. اتبع الخطوات من 4.2.1 إلى 4.2.5 من تعليمات العقدة الدهليزية لتقسيم الرأس إلى شطرين.
   2. حدد موقع الكبسولة الأذنية (على شكل الرقم 8) ، واستخرج من الجمجمة عن طريق تقطيع الحواف باستخدام ملقط حاد.
   3. قم بتغيير حل L-15. يضم الجزء الحلزوني من الكبسولة الأذنية القوقعة مع عضو كورتي. قم بتقطيع العظم الذي يغطي دوران القوقعة دون الإضرار بالأنسجة الكامنة ، مع ملقط دقيق مواز لمنحنى العظم.
   4. بمجرد إزالة ما يكفي من العظام للكشف عن المدى الكامل لمنعطفات القوقعة ، استخدم مقص زنبركي صغير لقطع modiolus (نسيج ليفي سميك أبيض يحتوي على محاور مركزية من SGNs) في قاعدة القوقعة لتحريرها من بقية الكبسولة الأذنية.
   5. إزالة الأوعية الدموية السطور عن طريق الضغط على السطور في القاعدة مع ملقط غرامة. استرخ حول اللولب وحتى القمة لتقشيره من عضو كورتي.
   6. قطع عضو كورتي إلى دورتين أو ثلاث دورات باستخدام مقص زنبركي صغير بحيث يكون مسطحا.
   7. قم باستئصال modiolus من كل منعطف بمقص زنبركي صغير.
   8. قم بإزالة العقدة الحلزونية عن طريق القطع عند حافة المكان الذي تبرز فيه مساحات ألياف SGN باتجاه خلايا الشعر.
   9. نظف العقدة باستخدام ملقط دقيق عن طريق إزالة العظام (التي تظهر بيضاء ومتبلورة في الهيكل) ، و modiolus (التي تظهر بيضاء وليفية) ، وأي هياكل أخرى غير ضرورية. احرص على تقليل إزالة أي نسيج عقدي.
   10. اتبع نفس الإجراء المستخدم في العلاج الإنزيمي للعقدة الحلزونية كما هو مستخدم للعقدة الدهليزية في القسم 4.4. عادة ما تكون الأوقات الأنزيمية أقصر في العقدة الحلزونية ، وهي أكثر استطالة من العقدة الدهليزية. استخدم ماصات تثليج ذات قطر أصغر للعقدة الحلزونية مقارنة بالعقدة الدهليزية.
   11. سحن العقدة الحلزونية في وسط الثقافة المكمل ب N2 و B27 ، المشار إليه في وصفة وسائط الثقافة.
   12. ضع طبق الاستزراع الذي يحتوي على العقد المنفصلة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ لمدة 12-24 ساعة.
       ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

5. التسجيل

ملاحظة: في هذا الإجراء ، يتم إجراء تسجيلات المشبك التصحيحي من العقدة المعزولة عادة بعد 12-24 ساعة من الطلاء. أبلغت مختبرات أخرى عن نتائج من الخلايا العصبية بعد فترات أطول بكثير في الثقافة¹⁰.

1. تحضير غرفة التسجيل
   1. استخدم غرفة تسجيل التبادل السريع (أو ما يعادلها) التي تسمح بتسجيلات مشبك التصحيح مباشرة في طبق الاستزراع. قم بإعداد الغرفة على المجهر المقلوب.
   2. أدخل أطباق الثقافة ذات القاع الزجاجي في الغرفة.
   3. قم بتغذية محلول L-15 من خلال نظام أنابيب التروية إلى غرفة التسجيل. تثبيت تدفق التروية والتدفق الخارجي في الغرفة بمعدل 0.5-1 مل في الدقيقة.
2. تحضير الحل الداخلي لتحميل الأقطاب الكهربائية
   1. قم بإذابة حصة من المحلول الداخلي المثقوب. خصص 2.5 مل من المحلول على طبق استزراع 35 مم. استبدل الغطاء الموجود على طبق الاستزراع وقم بتسمية "Tip Dip". توضع جانبا في منطقة خالية من الغبار ، حيث من المهم جدا الحفاظ على هذا الحل نظيفا قدر الإمكان.
   2. تزن 1 ملغ من الأمفوتريسين-B وتضاف 20 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). دوامة وتدور الحل لأسفل حتى كل الأمفوتريسين-B في الحل. أضف 10 ميكرولتر من محلول DMSO / amphotericin-B إلى 2 مل المتبقية من المحلول الداخلي المثقوب المذاب. اسحب المحلول وبدده باستخدام ماصة مرتين أو ثلاث مرات للتأكد من أن DMSO / amphotericin-B قد اختلط بشكل موحد في المحلول الداخلي. سيكون للحل مسحة صفراء خفيفة.
   3. ارسم المحلول الداخلي المثقوب الأمفوتريسين-B في حقنة سعة 3 مل. أضف طرف 34 جم إلى المحقنة. لف المحقنة بورق الألمنيوم واحتفظ بالمحقنة على الجليد.
      ملاحظة: يجب إعادة تشكيل هذا المحلول كل 2 ساعة لضمان فعالية الأمفوتريسين-B في ثقب غشاء الخلية. الأمفوتريسين-B حساس للضوء ، ويجب حمايته من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم أو طرق أخرى.
3. تسجيلات التصحيح المشبك
   1. تصور الخلايا العصبية باستخدام هدف 10x أو 20x. اضبط الإضاءة وقم بتحسين البصريات لرؤية الحدود والظلال حول الخلية.
   2. تحقق من جودة الخلايا العصبية المعزولة. حاول فقط الخلايا العصبية ذات الأسطح الملساء والمتساوية التي لا تتناقض بشدة وتحتوي فقط على حفر صغيرة ومشتتة. تأكد أيضا من تجنب أزواج الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية المحاطة بالحطام أو الخلايا الأخرى.
   3. تحت تكبير 100x ، حدد خلية عصبية أو مجال من الخلايا العصبية لتصحيحها وترتيبها في وسط مجال الرؤية.
   4. املأ طرف الماصة بمحلول نظيف لا يحتوي على الأمفوتريسين عن طريق غمس الطرف (لمدة ~ 20 ثانية) في المحلول النظيف الذي تم وضعه في طبق الاستزراع. سوف يسحب العمل الشعري كمية صغيرة من المحلول إلى الحافة.
      ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت مجهر تشريح ستيريو ، مما يسمح بتحديد مدى جودة تثبيت الطرف لمحلول Tip Dip. إذا لم يستمر المحلول لمدة ~ 10-20 ثانية ، فإن شكل القطب ليس مثاليا. في هذه الحالة ، أعد تكوين برنامج سحب القطب لإنتاج طرف أطول.
   5. بعد ذلك ، املأ الجزء الخلفي من الماصة بالمحلول الداخلي الذي يحتوي على الأمفوتريسين. سوف يسحب الفتيل الموجود داخل الماصة المحلول لأسفل لتلبية المحلول النظيف في الطرف. اسمح للخيوط بسحب المحلول لأسفل بسلاسة ، ولا تحاول الاستفادة من الفقاعات ، لأن هذا سيجبر الأمفوتريسين على الحافة بسرعة كبيرة.
   6. استخدم حقنة لاستخلاص المحلول الذي قد يكون في الجزء الخلفي من القطب.
      ملاحظة: من المهم جدا العمل بسرعة من هذه النقطة إلى الهبوط وتشكيل ختم عالي المقاومة على الخلية المطلوبة.
   7. أدخل الماصة في حامل الماصة. تأكد من أن الماصة محكمة في الحامل لمنع انحراف الماصة. إذا كانت الماصة غير مستقرة ، فقم بتبديل حلقات O المانعة للتسرب في الجزء الأمامي والخلفي من حامل الماصة لتقليل الانجراف والحفاظ على شفط قوي. استبدل الماصة بأخرى مملوءة حديثا.
   8. اخفض الماصة في حمام غرفة التسجيل.
   9. حدد موقع طرف الماصة في منتصف مجال الرؤية. تأكد من خلو الطرف من فقاعات الهواء أو غيرها من الحطام.
   10. قم بتطبيق خطوة جهد (5 مللي فولت) في اختبار الغشاء لمراقبة مقاومة الماصة. استمر في مراقبة مقاومة المدخلات من خلال العملية الكاملة لتشكيل ختم على الخلية.
   11. قم بإلغاء إمكانات إزاحة الماصة ، بحيث يقرأ تيار الماصة صفرا في وضع اختبار الغشاء ل pClamp.
   12. صحيح لسعة الماصة باستخدام وظيفة تعويض السعة السريعة على مضخم المشبك التصحيحي (أقراص Cp السريعة في اللوحة الناعمة Multiclamp Commander).
   13. حرك الماصة لأسفل إلى الخلية.
   14. بمجرد أن تكون الماصة قريبة بدرجة كافية من الخلية العصبية ، قم بالتبديل إلى هدف التكبير الأعلى وأرسل الصورة عبر الكاميرا إلى شاشة (استخدم هدف 40x ، تكبير إجمالي 400x). اضبط الماصة وأعد توسيط الخلية العصبية.
   15. حرك قطب التسجيل بالقرب من سوما. حدد موقع مركز الخلية العصبية على الشاشة وضع قطب التسجيل فوق الخلية العصبية.
   16. اقترب من الخلية العصبية من الأعلى ، بحيث يهبط القطب في وسط الخلية الكروية. اضبط إزاحة الماصة على صفر إمكانات التيار المستمر الثابتة في النظام.
   17. ضع الماصة بالقرب من الغشاء. الأرض بقوة على وسط الخلية.
       ملاحظة: عند الهبوط ، سيحدث تنقير صغير على سطح الخلية العصبية ومضاعفة / ثلاثة أضعاف مقاومة الإدخال.
   18. تطبيق الضغط السلبي (الشفط) باستخدام حقنة أو ماصة الفم. قم بتشغيل إمكانات الاحتفاظ البالغة -60 مللي فولت. يجب أن تزداد مقاومة الختم حتى تمر جيجا أوم.
       ملاحظة: اعمل بسرعة لتقليل الوقت بين ملء قطب كهربائي والهبوط على خلية. هناك وقت محدود قبل أن يصل الأمفوتريسين المضاف إلى المحلول الداخلي المثقوب في الخطوة 5.3.5 إلى طرف القطب. بمجرد تلوث الطرف بالأمفوتريسين ، من الصعب تكوين أختام عالية المقاومة ، وغالبا ما تصل المقاومة إلى ~ 200 ميغا أوم.
   19. بمجرد أن يتشكل ختم جيجا أوم ، حرر الضغط السلبي. بمجرد أن يتشكل الختم ، قم بتطبيق تعويض السعة السريعة لتقليل سعة الماصة العابرة في وضع اختبار الغشاء قدر الإمكان.
   20. عندما يبدأ الأمفوتريسين في العمل ، راقب مقاومة الإدخال تنخفض ببطء ويزداد التيار المتدفق استجابة لخطوة الجهد 5 مللي فولت تدريجيا مع دخول الأمفوتريسين إلى الغشاء. يشير الانخفاض المفاجئ في المقاومة المتسلسلة بدلا من الاستقرار التدريجي إلى حدوث تمزق تلقائي.
   21. قم بتقدير سعة الخلية بأكملها ومقاومة السلسلة باستخدام وظيفة الإلغاء العابر السعوي لمكبر الصوت. قم بتوثيق ومراقبة مقاومة السلسلة في بداية التجربة وأثناءها بانتظام.
       ملاحظة: يمكن أن تستغرق مقاومة السلسلة في أي مكان من 5-20 دقيقة حتى تستقر ، اعتمادا على حجم القطب ومقدار المحلول النظيف المسحوب في الماصة. يمكن استخدام أوضاع مشبك الجهد والمشبك الحالي بمجرد استقرار مقاومة السلسلة إلى أقل من 30 ميجاأوم. يلاحظ أحيانا تورم أو تقلص الخلايا العصبية أثناء التسجيل ، ولكن نادرا ما يتم ضبط الأسمولية ودرجة الحموضة في المحاليل بشكل صحيح.

النتائج

يكشف تشغيل بروتوكولات مشبك الجهد عن طريق تطبيق عائلات خطوات الجهد عن التنشيط المعتمد على الجهد لمجموعة متنوعة من عائلات التيارات المختلفة. يتم عرض أمثلة تمثيلية لتيارات الخلية الكاملة المستثارة من VGN والمقتبسة من التسجيلات المنشورة¹³ في الشكل 1A ، B. ي...

Discussion

الطرق المعروضة هنا خاصة بالتسجيلات من الخلايا العصبية المعزولة. ركزت الدراسات السابقة على التسجيلات من المحطات المحورية في إعداد شبه سليم. عند مقارنتها بتقنيات التسجيل الطرفية الحالية ، توفر التسجيلات المعزولة سلوكا فائقا لمشبك الفضاء وجهدا متساويا. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا البروتوك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	For perforated patch recordings.
ATP di-sodium	Sigma-Aldrich	A7699	Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044	additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge	USA Scientific	2641-0016
Bunsen burner
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	Additive to internal solution
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5318	one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40	Warner Instruments	64-0707
DMSO	Biotium	90082
Dnase I,from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	11284932001	one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt)	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11255-20
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Additive to internal solution
Electrode Puller	Narashige	PC-10
Epi-illumination light source	Zeiss	CL 1500 ECO
Ethanol	Decon Labs	2716	for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes	Sutter Instruments	BF140-117-10
Fine-edged dissection blade	Fine Science Tools	10010-00
Glass Pasteur Pipettes	VWR	14673-010	to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16140063	additive to culture medium
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers	VWR	76549-914
Insulated bucket filled with ice			to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additive to internal solution
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	Additive to internal solution
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors	Fine Science Tools	14133-13
Leibovitz medium	Sigma Aldrich	L4386	dissection and bath solutions
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes	Warner Instruments	64-0236
luer-lok syringes, 30 ml	BD	302832	for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement	Fisher Scientific	41-090-101	base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M1028	Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge	World Precision Instruments	MF34G
Microforge	Narashige	MF-90	For electrode polishing.
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502-048	additiive to culture medium, for SGN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Additive to internal solution
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	for titration pH
Osmometer	Advanced Instruments Inc.	3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing	USC Material Management	MEDOX200 (Identifier: 00015)	for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm	Bemis	PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml)	Fisher Scientific	03-448-25	bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)	MWI Animal Health	15199	for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer	Nalgene	566-0020	for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm	Genessee Scientific	32-103	for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm	Midland Scientific	P7455	for gross dissection
pH Meter	Mettler Toledo	Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter	USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish	Mattek	P35GC-0-10-C	to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes	Warner Instruments	64-0375
Reference Cell	World Precision Instruments	RC1T
Scalpel blade	Miltex	4-315
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
Scientific Scale	Mettler Toledo	XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter	Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)	Warner Instruments	64-0378
Small Animal Guillotine	Kent Scientific	DCAP
Small animal guillotine	Kent Scientific	DCAP	for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Straight surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin	Sigma Aldrich	T1426	one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe	Covidien	8881500105	for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex	VWR	945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)	Millipore-Sigma	CDUFBI001