Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

Resumo

São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.

Resumo

A morfologia compacta dos neurônios ganglionares isolados e cultivados da orelha interna permite caracterizações detalhadas dos canais iônicos e receptores de neurotransmissores que contribuem para a diversidade celular nesta população. Este protocolo descreve os passos necessários para o sucesso da dissecação, dissociação e cultura em curto prazo da somata de neurônios bipolares da orelha interna para fins de gravações de patch-clamp. Instruções detalhadas para a preparação dos neurônios do gânglio vestibular são fornecidas com as modificações necessárias para o plaqueamento dos neurônios do gânglio espiral. O protocolo inclui instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras na configuração de patch perfurado. Resultados de exemplo que caracterizam os registros de clamp de tensão de correntes mediadas por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN) destacam a estabilidade da configuração de gravação de patch perfurado em comparação com a configuração mais padrão de patch rompido. A combinação desses métodos, somata isolada mais registros perfurados de patch-clamp, pode ser usada para estudar processos celulares que requerem registros longos e estáveis e a preservação do meio intracelular, como a sinalização através de receptores acoplados à proteína G.

Introdução

Os neurônios bipolares do nervo vestibulococlear conectam as células ciliadas sensoriais da orelha interna ao tronco encefálico. São os principais portadores de informações sobre sons e movimentos da cabeça; Danos a essas células importantes levam à surdez e distúrbios do equilíbrio. As porções vestibular e auditiva do nervo são compostas, cada uma, por tipos celulares distintos e morfologicamente^diversos1,2. No sistema vestibular, duas subpopulações aferentes disparam espontaneamente em intervalos regulares ou^irregulares2. Acredita-se que o tempo da espícula aferente reflita uma diversidade subjacente na composição dos canais^{iônicos 3,4}. No sistema auditivo, existem duas subpopulações principais de neurônios do gânglio espiral (GNG); enquanto os GNC Tipo I entram em contato com células ciliadas internas individuais⁵, os GNs Tipo II entram em contato com múltiplas células ciliadas externas⁵. Registros in vitro de culturas semi-intactas e organotípicas sugerem diferenças nas propriedades de membrana dos SGNs Tipo I e Tipo^{II 6,7}.

Muitos canais iônicos e receptores de neurotransmissores encontrados nos terminais desses neurônios também são encontrados em seus corpos celulares. Dessa forma, culturas do somato vestibular isolado e do gânglio espiral podem ser estudadas in vitro para entender como canais iônicos e receptores de neurotransmissores contribuem para a resposta desses neurônios. A morfologia compacta dos corpos celulares isolados permite registros elétricos de alta qualidade, adequados para a caracterização detalhada de canais iônicos dependentes de voltagem e receptores de neurotransmissores. O fácil acesso a uma variedade representativa de subtipos de neurônios permite a análise de alto rendimento da diversidade celular.

Este artigo apresenta um método para isolar e cultivar corpos de células ganglionares dissociadas da porção superior do gânglio vestibular em ratos no dia pós-natal (P)9 a P20. Também são apresentadas sugestões para estender esses métodos ao gânglio espiral, além das etapas necessárias para extrair, dissociar e plaquear com sucesso as células ganglionares. Esses métodos são uma evolução daqueles desenvolvidos em publicações de diversos laboratórios8,9,10. Também está incluída neste artigo a orientação para a seleção de células saudáveis para gravações de patch-clamp.

Finalmente, o protocolo descreve o procedimento para o registro de patch-clamp usando a configuração de patch perfurado¹¹. Embora a configuração de patch perfurado seja mais demorada e tecnicamente mais desafiadora do que a configuração de patch rompido mais comum, ela é melhor para manter o meio citoplasmático que permite sessões de gravação longas e estáveis. Os benefícios dessa configuração de gravação são ilustrados aqui através da estabilidade melhorada das correntes catiônicas ativadas por hiperpolarização em remendo-perfurado em relação aos registros de mancha-rompida.

Este protocolo está organizado em cinco seções. As seções 1 a 3 descrevem soluções e ferramentas que podem ser preparadas e armazenadas com antecedência. A seção 4 descreve os passos para dissecar e plaquear os vestibulares e SGNs. A seção 5 descreve os passos para o registro dos neurônios após um período em cultura. Em nossas mãos, a seção 4 e a seção 5 são realizadas durante um período de 2 dias consecutivos.

Protocolo

Todo o uso de animais descrito aqui foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Sul da Califórnia. Os animais deste protocolo são ratos Long Evans de ambos os sexos com idade P3 a P25 obtidos do Charles River Laboratories, mas estes métodos podem ser aplicados a outras linhagens de roedores. Um jaleco de laboratório e luvas devem ser usados durante todos os procedimentos, bem como óculos de proteção contra respingos ao fazer soluções.

1. Preparações

NOTA: As soluções e ferramentas descritas nesta seção podem ser feitas com bastante antecedência para serem usadas no dia da dissecção e gravação.

1. Preparar o meio Liebovitz suplementado com 10 mM HEPES (solução L-15). As etapas a seguir descrevem a fabricação de 1 L de solução L-15.
   1. Despeje 990 mL de H₂O deionizado em um copo. Meça e adicione 2.386 g (10 mM) de HEPES. Adicione um frasco de 1 L de solução de L-15 em pó.
      NOTA: O L-15 em pó tem uma vida útil mais longa e ocupa menos espaço de armazenamento. Alternativamente, comprar solução L-15 e suplemento com HEPES. Esta última opção também tem a opção de usar uma solução livre de fenol, que é útil para imagens de fluorescência.
   2. Mexa a solução num prato agitado. Usando um medidor de pH, adicione lentamente 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) para obter um pH entre 7,34 e 7,36.
   3. Adicionar H₂O deionizado até que a solução atinja um volume de 1.000 mL. Filtrar a solução utilizando uma membrana de 0,22 μm de tamanho de poros.
      NOTA: A solução de L-15 pode ser armazenada a 4 °C durante cerca de 1-2 semanas. Se usar L-15 feito com fenol-vermelho, a solução ficará rosa se muito básica (pH > 7,4) ou laranja se muito ácida (pH < 7,34).
2. Preparar o meio de cultura para neurônios ganglionares vestibulares (GNVs) (com modificação para SGNs). Siga os passos abaixo para fazer 50 mL de meio de cultura:
   1. Adicionar 47,5 mL de meio essencial mínimo GluMAX-I a um copo de vidro limpo.
   2. Medir e adicionar 0,1194 g (10 mM) de HEPES. Este tampão adicional resiste às mudanças de pH enquanto as células se acomodam, antes de serem movidas para a incubadora.
   3. Adicionar 2,5 mL de soro fetal bovino (SFB). Isso faz 5% em volume FBS em um volume total de 50 mL de meio. Para preparações de SGN, 2,5 mL de FBS são substituídos por 0,5 mL de N2 e 1 mL de soluções B27.
   4. Mexa a solução num prato agitado. Usando um medidor de pH, adicione lentamente 1 N de NaOH para obter um pH entre 7,38 e 7,4.
   5. Adicionar 0,5 mL de penicilina-estreptomicina. Filtrar a solução através de um filtro estéril de 0,22 μm. Conservar a solução a 4 °C.
   6. Pelo menos 30 minutos antes do uso, transferir o meio de cultura para um frasco de cultura de tecidos com tampa ventilada. Colocar o balão com meios de cultura numa estufa com concentração de 5% de CO₂ a 37 °C.
3. Preparar a solução interna de patch perfurado
   NOTA: Aqui, 100 mL de solução interna de remendo perfurado é usado para registro de células inteiras (a receita está resumida na Tabela 1). Estas soluções podem ser preparadas com bastante antecedência e armazenadas a -20 °C. As alíquotas podem ser armazenadas indefinidamente a -20 °C se não passarem por um ciclo repetido de congelamento e descongelamento.
   1. Até 6 meses antes do tempo, faça e armazene soluções de estoque das seguintes formas: 1 M KCl, 0,5 M Mg₂Cl (hexahidratado) e 0,5 M CaCl₂. Conservar em frascos herméticos até 6 meses a 4 °C.
      NOTA: É uma boa ideia verificar a osmolalidade das soluções-estoque (2.000 mOsm para a solução estoque de KCl 1 M; 1.500 mOsm para as soluções de Mg₂Cl e CaCl₂ ) para garantir que a concentração alvo seja atingida. Não utilize se a solução ficar turva ou se formar precipitados. Este pode ser um possível ponto de pausa.
4. No dia da fabricação da solução interna, siga as etapas abaixo usando as soluções de estoque da etapa 1.3.
   1. Meça 100 mL de milli-Q (MQ)H₂O. Retire 40 mL dos 100 mL e reserve em um copo limpo.
   2. Adicionar os restantes 60 ml de H₂O a um copo limpo e estéril de 100 ml. Adicionar 2,5 mL de KCl 1 M, 1 mL de 0,5 M Mg₂Cl-hexahidratado e 0,02 mL de CaCl₂ 0,5 M.
   3. Adicione uma barra de agitação e coloque o copo em um prato agitado. Mexa até dissolver completamente. Adicionar 1,307 g de K₂SO₄. Mexa até dissolver o K₂SO₄ .
   4. Pesar 0,1192 g de HEPES (alvo de 5 mM num volume final de 100 ml) e adicionar à solução. Mexa até dissolver.
      NOTA: Certifique-se de que todos os componentes estão totalmente dissolvidos, pois às vezes leva tempo para o K₂SO₄ se dissolver.
   5. Pesar 0,1902 g de ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-tetracético (EGTA) (alvo de 5 mM num volume final de 100 ml) e adicionar à solução. Como o EGTA não se dissolve completamente em uma solução ácida, coloque o copo em uma placa de agitação e insira a sonda de pH.
   6. Ao mexer, titule lentamente 1 M KOH até que o EGTA se dissolva completamente. Espere que isso ocorra quando o pH estiver entre 6 e 7. Continue a adicionar lentamente KOH até que o pH final seja 7,35 (aproximadamente 1,2 a 1,3 mL de KOH no total).
   7. Adicione MQH₂O para levar a solução a um volume final de 100 mL e mexa. Verifique a osmolalidade da solução (alvo de 270 mOsm/kg para a solução perfurada) com um osmômetro.
   8. Filtrar a solução interna com adesivo perfurado utilizando um filtro estéril de 0,22 μm. Conservar em alíquotas de 5 ml a -20 °C. Use uma nova alíquota para cada nova sessão de gravação.
      Observação : isso pode ser um possível ponto de pausa.

2. Fabricação de pipetas de trituração

NOTA: As pipetas de trituração podem ser reutilizadas para múltiplos experimentos. Lave as pipetas com etanol, água e solução L-15 antes de cada uso e limpe-as com água e etanol após cada uso. Guarde cuidadosamente entre os usos.

1. Para preparar pipetas de trituração para dissociação celular, segure uma pipeta de vidro Pasteur na chama de um queimador de Bunsen. Quando a ponta de vidro começar a derreter, estique o vidro até o diâmetro desejado da ponta. Puxe uma extremidade da pipeta para longe da chama para criar uma pequena curva.
2. Leve a pipeta dobrada para perto de um microscópio. Usando uma telha de pontuação, marque e quebre o vidro no diâmetro desejado.
3. Passe a ponta da pipeta por cima da chama do queimador de Bunsen. Isso irá polir rapidamente as bordas ásperas perto da ponta. Verifique se a ponta não está selada pela chama.
4. Repita o processo até que quatro ou cinco pipetas tenham sido preparadas com tamanhos variados.

3. Fabricação de pipetas de remendo

NOTA: Prepare um conjunto de pipetas de remendo antes da sessão de gravação, mas após a dissecção e cultura dos gânglios. Embora os eletrodos que são feitos um de cada vez durante a sessão de gravação sejam ótimos em desempenho, um sucesso razoável foi alcançado quando estes são feitos em lote na noite anterior. Guarde as pipetas em um recipiente de vidro coberto para proteger as pontas da poeira.

1. Use um extrator de eletrodo vertical e pipetas de vidro borossilicato filamentado de 1,5 mm de diâmetro externo/1,17 mm de diâmetro interno. Certifique-se de que o vidro é sempre mantido livre de poeira e impressões digitais.
2. Puxe de 8 a 10 pipetas de gravação usando um programa de duas etapas, conforme recomendado pelo fabricante para pipetas de patch.
3. Inspecionar e polir termicamente cada ponta da pipeta de gravação com uma microforja; O polimento térmico promove uma melhor vedação. A resistência da pipeta alvo está entre 4 e 8 MΩ.
4. Guarde as pipetas polidas em um recipiente coberto. Isso pode ser tratado como um ponto de pausa no experimento.
   NOTA: Otimizar o diâmetro da pipeta para atingir a faixa de resistência alvo requer algumas tentativas e erros com as etapas 3.2 e 3.3. A maioria dos sistemas comerciais de patch-clamp tem um recurso de teste de membrana embutido para medir a resistência do eletrodo na solução de banho. A resistência é calculada como uma razão da corrente de saída em estado estacionário em resposta a um estímulo de passo aplicado de 5 mV. As regulagens de tracção no passo 3.1 e o polimento no passo 3.2 devem primeiro ser ajustados utilizando pipetas de ensaio, até que a resistência das pipetas de ensaio se situe dentro da gama de 4 a 8 MΩ.
5. No dia da gravação, cubra as pontas da pipeta para reduzir a capacitância da pipeta e o ruído de gravação. Para isso, enrole uma pequena tira de filme de parafina no eixo da pipeta. Não é necessário enrolar até a ponta.
   NOTA: Uma estratégia alternativa é revestir e aquecer um elastômero de silicone no eixo da pipeta¹².

4. Extração do gânglio vestibular e plaqueamento dos neurônios vestibulares

1. Preparo para dissecção
   1. Preparar uma mistura enzimática de solução L-15 com colagenase a 0,05% e tripsina a 0,25%. Por exemplo, adicione 0,001 g de colagenase e 0,005 g de tripsina a 2 mL de solução de L-15 em um copo, adicione um pequeno agitador magnético e mexa até ficar totalmente misturado. Reserve à temperatura ambiente.
   2. Prepare uma guilhotina obtida comercialmente colocando toalhas de papel ao lado e embaixo da guilhotina para minimizar a exposição da bancada e outras superfícies ao sangue e outros materiais biológicos.
   3. Coloque tesouras grandes de aço inoxidável, pinças grandes e tesouras de mola grandes. Mantenha um borrifador grande com etanol 70% à mão para a limpeza da cabeça.
   4. Encha um copo de 100 mL com solução de L-15 e coloque no gelo. Oxigenar a solução L-15.
   5. Coloque a tesoura de mola, tesoura cirúrgica, pinça, bisturi e pipeta de transferência (consulte Tabela de Materiais).
   6. Prepare uma placa de Petri de 60 mm (para a dissecção grosseira) e duas placas de Petri de 35 mm (para a limpeza/dissecção fina dos gânglios). Encher a placa de 60 mm com solução oxigenada de L-15 usando uma seringa de 30 mL com uma ponta de filtro de 0,22 μm.
2. Eutanásia, limpeza da cabeça e hemissecção
   1. Pesar os filhotes para calcular a dose apropriada de diluição fatal-plus para administrar por via intraperitoneal (~0,01 mL por 10 g).
   2. Uma vez atingido um plano profundo de anestesia, avaliado pela falta de resposta ao pinçamento do dedo, decapitar com a guilhotina.
   3. Enxaguar bem a cabeça com etanol a 70% e, em seguida, completamente com solução de L-15.
   4. Remova completamente a pele do crânio. Separe a cabeça usando uma tesoura de mola grande, começando no ponto de entrada da medula espinhal para o cérebro e fazendo dois cortes, o primeiro cortando a parte superior do crânio e o segundo através da parte inferior da mandíbula. Termine de bissetriz da cabeça usando tesoura cirúrgica.
   5. Coloque as duas metades do cérebro da cabeça de lado para baixo em uma placa de Petri de 60 mm cheia com solução de L-15. Colocar o tecido fresco que não está sendo dissecado no gelo.
3. Extração do gânglio vestibular superior
   1. Retirar o cérebro usando uma tesoura cirúrgica fechada. Sever e remover o nervo craniano para separar completamente o cérebro do crânio.
      NOTA: Neste ponto, a cápsula ótica (em forma de número 8) deve ser visível na parte de trás da cabeça.
   2. Usando pinças e começando na parte de trás da cabeça, puxe o material membranoso claro.
   3. Corte a parte superior do crânio usando uma tesoura cirúrgica. Remova o excesso de tecido da parte de trás da cabeça e pescoço para tornar a área de dissecção e a cápsula ótica mais limpas e fáceis de acessar.
      OBS: Evite deixar o prato muito turvo, descartando o excesso de tecido durante todo o procedimento.
   4. Transfira o tecido para uma segunda placa de Petri com solução fresca de L-15. Localizar a cápsula ótica e os nervos auditivo, vestibular superior e vestibular inferior. Cortar o nervo auditivo e separar os gânglios superior e inferior usando uma pequena tesoura de mola.
      OBS: Embora os somatas do nervo vestibular sejam encontrados tanto nos gânglios inferior (mais fino) quanto superior (mais espesso), as células extraídas do gânglio superior têm melhor sobrevida.
   5. Usando um bisturi, raspe suavemente a crista óssea para enfraquecer a área óssea, sob a qual o nervo mergulha na cápsula óssea. Remova cuidadosamente os detritos com pinças finas, expondo toda a porção inchada do gânglio.
   6. Use a tesoura fina de mola para cortar e separar o gânglio do ramo nervoso periférico que está mergulhando em direção ao utrículo.
   7. Remova o gânglio superior usando pinça fina, certificando-se de não beliscar muito perto do tecido ganglionar. Transfira para uma placa de Petri de 35 mm com solução fresca de L-15.
   8. Antes de prosseguir, pré-aqueça a solução enzimática: despeje a mistura enzimática em uma placa de Petri de 35 mm e coloque em uma incubadora de 37 °C por 10-15 min.
   9. Limpe o gânglio usando pinças finas e pequenas tesouras de mola, removendo o osso (que parece branco e cristalizado na estrutura), excesso de tecido, fibras nervosas e quaisquer outras estruturas supérfluas. Tome cuidado para minimizar a remoção de qualquer tecido ganglionar.
4. Dissociação tecidual e plaqueamento
   1. Transfira os gânglios limpos para a solução enzimática pré-aquecida e coloque-a de volta na incubadora por 10 a 40 min. O tratamento enzimático é concluído quando o tecido começa a se separar, mas permanece em um pedaço. O tratamento excessivo do tecido com enzimas resultará na dissolução completa dos gânglios antes da trituração.
      OBS: O tempo que o tecido passa por tratamento enzimático depende da idade do animal. Por exemplo, os gânglios de ratos P9 são tratados com enzima por 25 min, e os gânglios de ratos P15 são tratados com enzima por 35 min.
   2. Transfira os gânglios para a placa de Petri de 35 mm com solução fresca de L-15 e incube por 2-3 min.
   3. Transfira os gânglios para outra placa de Petri de 35 mm preenchida com meios de cultura filtrados.
   4. Usando uma micropipeta de 200 μL, pipetar uma gota de ~150 μL de meio de cultura filtrado em um prato de fundo de vidro revestido. Não adicione muita solução, pois é importante manter a tensão superficial para formar uma bolha de solução que permanece sobre a tampa de vidro.
   5. Transfira o número desejado de gânglios (um a quatro) para a lamínula.
   6. Retirar uma pequena quantidade de meio de cultura da placa de cultura para enxaguar a pipeta de trituração com meio para evitar que o tecido grude nas laterais da pipeta de vidro. Triturar passando suave e repetidamente o tecido através da pipeta até que os gânglios estejam suficientemente dissociados.
      NOTA: Não sobrecarregue o tecido para tentar suspensões de célula única ou permita que as células caiam para o fundo do prato usando pressão positiva excessiva. Além disso, evite formar bolhas de ar, pois isso reduzirá a sobrevivência celular. A trituração suave é a chave para alcançar a sobrevivência celular bem-sucedida.
   7. Deixe as células descansarem por 5 min. Verifique sob um microscópio de luz para ver se as células se acomodaram na lamínula.
   8. Coloque cuidadosamente um prato de cultura em uma incubadora de 37 °C por 12-24 h. Novamente, certifique-se de manter a bolha de solução intacta.
      OBS: Ao cultivar por mais de 24 h, atualize os meios de cultura diariamente. Este pode ser um possível ponto de pausa.
5. Chapeamento SGNs
   1. Seguir os passos 4.2.1 a 4.2.5 das instruções do gânglio vestibular para bissetriz da cabeça.
   2. Localize a cápsula ótica (em forma de número 8) e extraia do crânio lascando as bordas usando pinças rombas.
   3. Troque a solução L-15. A porção espiral da cápsula ótica abriga a cóclea com o órgão de Corti. Lascar o osso que recobre as espiras cocleares sem danificar o tecido subjacente, com pinças finas paralelas à curva do osso.
   4. Uma vez que o osso tenha sido removido o suficiente para revelar toda a extensão das espiras cocleares, use uma pequena tesoura de mola para cortar o modíolo (tecido fibroso espesso e branco contendo axônios centrais de SGNs) na base da cóclea para liberá-lo do resto da cápsula ótica.
   5. Remova a estria vascular pinçando a estria na base com pinças finas. Relaxe ao redor da espiral e até o ápice para descascá-la livre do órgão de Corti.
   6. Corte o órgão de Corti em duas ou três voltas usando uma pequena tesoura de mola para que ele fique plano.
   7. Excique o modíolo de cada volta com uma pequena tesoura de mola.
   8. Remova o gânglio espiral cortando na borda de onde os tratos de fibra SGN se projetam em direção às células ciliadas.
   9. Limpe o gânglio usando pinças finas, removendo o osso (que parece branco e cristalizado na estrutura), o modíolo (que aparece branco e fibroso) e quaisquer outras estruturas supérfluas. Tome cuidado para minimizar a remoção de qualquer tecido ganglionar.
   10. Seguir o mesmo procedimento utilizado para o tratamento enzimaticamente do gânglio espiral utilizado para o gânglio vestibular na secção 4.4. Os tempos enzimáticos são tipicamente mais curtos no gânglio espiral, que é mais alongado do que o gânglio vestibular. Utilizar pipetas de trituração de menor diâmetro para o gânglio espiral em relação ao gânglio vestibular.
   11. Triturar o gânglio espiral em meio de cultura suplementado com N2 e B27, indicado na receita para meios de cultura.
   12. Colocar a placa de cultura contendo os gânglios dissociados em uma incubadora de 37 °C, 5% CO₂ por 12-24 h.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

5. Gravação

NOTA: Neste procedimento, os registros de patch-clamp do gânglio isolado são tipicamente realizados 12-24 h após o plaqueamento. Outros laboratórios relataram resultados de neurônios após períodos muito mais longos em cultura¹⁰.

1. Preparar a câmara de gravação
   1. Use a câmara de gravação de troca rápida (ou equivalente) que permite gravações de patch-clamp diretamente no prato de cultura. Configure a câmara no microscópio invertido.
   2. Insira as placas de cultura com fundo de vidro na câmara.
   3. Alimentar a solução L-15 através de um sistema de tubos de perfusão para a câmara de registo. Estabilizar o fluxo de entrada e saída de perfusão na câmara a uma taxa de 0,5-1 mL por minuto.
2. Preparar a solução interna para carregar eletrodos
   1. Descongelar uma alíquota da solução interna do remendo perfurado. Alocar 2,5 mL da solução em uma placa de cultura de 35 mm. Substitua a tampa do prato de cultura e rotule como "Tip Dip". Reserve em uma zona livre de poeira, pois é muito importante manter essa solução o mais limpa possível.
   2. Pesar 1 mg de anfotericina B e adicionar 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Vórtice e gire a solução até que toda a anfotericina B esteja na solução. Adicionar 10 μL da solução de DMSO/anfotericina B aos 2 mL restantes da solução interna do remendo perfurado descongelado. Retirar e dissipar a solução com uma pipeta duas ou três vezes para garantir que o DMSO/anfotericina B se misturou uniformemente na solução interna. A solução terá um tom leve-amarelado.
   3. Introduzir a solução interna do adesivo perfurado de anfotericina B numa seringa de 3 ml. Adicione uma ponta de 34 G à seringa. Embrulhe a seringa em papel alumínio e mantenha a seringa no gelo.
      NOTA: Esta solução deve ser refeita a cada 2 h para garantir a eficácia da anfotericina B em perfurar a membrana celular. A anfotericina B é sensível à luz e deve ser protegida da luz usando folha de alumínio ou outros métodos.
3. Gravações de patch-clamp
   1. Visualize os neurônios usando uma objetiva de 10x ou 20x. Ajuste a iluminação e otimize a ótica para ver os limites e sombras ao redor da célula.
   2. Verifique a qualidade dos neurônios isolados. Tente apenas neurônios com superfícies lisas e uniformes que não sejam muito contrastadas e tenham apenas crateras pequenas e dispersas. Além disso, certifique-se de evitar pares de neurônios, neurônios cercados por detritos ou outras células.
   3. Sob ampliação de 100x, identifique um neurônio ou campo de neurônios para remendá-los e alinhá-los no centro do campo de visão.
   4. Encha a ponta da pipeta com uma solução limpa que não contenha anfotericina mergulhando a ponta (por ~20 s) na solução limpa que foi colocada em um prato de cultura. A ação capilar atrairá uma pequena quantidade de solução para a ponta.
      NOTA: Execute esta etapa sob um microscópio de dissecção estéreo, que permite determinar quão bem a ponta segura a solução Tip Dip. Se a solução não se mantiver por ~10-20 s, a forma do eletrodo não é ideal. Nesse caso, reconfigure o programa de tração de eletrodos para produzir uma ponta mais longa.
   5. Em seguida, encha o dorso da pipeta com a solução interna contendo anfotericina. O filamento dentro da pipeta irá puxar a solução para baixo para encontrar a solução limpa na ponta. Deixe o filamento puxar suavemente a solução para baixo e não tente tocar bolhas, pois isso forçará a anfotericina à ponta muito rápido.
   6. Use uma seringa para retirar a solução que pode estar na parte de trás do eletrodo.
      NOTA: É muito importante trabalhar rápido a partir deste ponto para pousar e formar uma vedação de alta resistência na célula desejada.
   7. Insira a pipeta no suporte da pipeta. Verifique se a pipeta está ajustada no suporte para evitar a deriva da pipeta. Se a pipeta não for estável, troque os anéis de vedação na frente e atrás do suporte da pipeta para minimizar a deriva e manter a sucção forte. Substitua a pipeta por uma recém-cheia.
   8. Abaixe a pipeta para o banho da câmara de gravação.
   9. Localize a ponta da pipeta no meio do campo de visão. Certifique-se de que a ponta está livre de bolhas de ar ou outros detritos.
   10. Aplicar um passo de tensão (5 mV) no teste de membrana para monitorar a resistência da pipeta. Continue monitorando a resistência de entrada durante todo o processo de formação de uma vedação na célula.
   11. Cancele o potencial de deslocamento da pipeta, de modo que a corrente da pipeta leia zero no modo de teste de membrana do pClamp.
   12. Corrija a capacitância da pipeta usando a função de compensação rápida de capacitância no amplificador patch-clamp (discadores rápidos Cp no painel macio Multiclamp Commander).
   13. Mova a pipeta para baixo até a célula.
   14. Quando a pipeta estiver perto o suficiente do neurônio, mude para a objetiva de ampliação mais alta e envie a imagem através de uma câmera para um monitor (use uma objetiva de 40x, aumento total de 400x). Ajuste a pipeta e recancifique o neurônio.
   15. Mova o eletrodo de gravação para perto do soma. Localize o centro do neurônio no monitor e posicione o eletrodo de gravação acima do neurônio.
   16. Aproxime-se do neurônio de cima, de modo que o eletrodo pouse no centro da célula esférica. Ajuste o deslocamento da pipeta para zerar os potenciais DC constantes no sistema.
   17. Posicione a pipeta próxima à membrana. Pouse firmemente no centro da célula.
       NOTA: Ao aterrissar, ocorrerá uma pequena ondulação na superfície do neurônio e uma duplicação/triplicação da resistência de entrada.
   18. Aplicar pressão negativa (sucção) usando uma seringa ou pipeta bucal. Ligue o potencial de retenção de -60 mV. A resistência da vedação deve aumentar até passar um giga-ohm.
       NOTA: Trabalhe rápido para reduzir o tempo entre o enchimento de um eletrodo e o pouso em uma célula. O tempo para que a anfotericina adicionada à solução interna do remendo perfurado na etapa 5.3.5 atinja a ponta do eletrodo. Uma vez que a ponta é contaminada com anfotericina, é difícil formar vedações de alta resistência, e a resistência muitas vezes se estabiliza em ~200 megaohms.
   19. Uma vez que uma vedação giga-ohm se forma, libere a pressão negativa. Assim que a vedação se formar, aplique compensação de capacitância rápida para reduzir ao máximo a amplitude dos transientes de capacitância da pipeta no modo de teste de membrana.
   20. À medida que a anfotericina começa a funcionar, observe como a resistência de entrada diminui lentamente e a corrente que flui em resposta ao passo de tensão de 5 mV aumenta progressivamente à medida que a anfotericina entra na membrana. Uma diminuição súbita da resistência em série, em vez de estabilização gradual, sugere que ocorreu ruptura espontânea.
   21. Estimar a capacitância de célula inteira e a resistência em série usando a função de anulação transiente capacitiva do amplificador. Documente e monitore a resistência da série no início e regularmente durante o experimento.
       NOTA: A resistência em série pode levar de 5 a 20 minutos para estabilizar, dependendo do tamanho do eletrodo e da quantidade de solução limpa que é aspirada para a pipeta. Os modos de fixação de tensão e de fixação de corrente podem ser usados uma vez que a resistência da série tenha se estabilizado abaixo de 30 megaohms. Inchaço ou encolhimento dos neurônios durante o registro às vezes é observado, mas raramente quando a osmolaridade e o pH das soluções são ajustados corretamente.

Resultados

A execução de protocolos de fixação de tensão através da aplicação de famílias de passos de tensão revela a ativação dependente de tensão de uma variedade de diferentes famílias de correntes. Exemplos representativos de correntes de células inteiras evocadas a partir de um VGN e adaptadas de registros publicados¹³ são mostrados na Figura 1A,B. A aplicação de tensões despolarizantes (Figura 1B) ativa uma...

Discussão

Os métodos aqui apresentados são específicos para registros de neurônios isolados; Estudos anteriores se concentraram em gravações de terminais de axônio em uma preparação semi-intacta. Quando comparados com as técnicas de gravação de terminais existentes, os registros isolados oferecem um comportamento de pinça espacial e isopotencial superior. Além disso, esse protocolo fornece acesso a uma amostra mais ampla de neurônios, uma vez que apenas subpopulações portadoras de cálice são acessíveis em regis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	For perforated patch recordings.
ATP di-sodium	Sigma-Aldrich	A7699	Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044	additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge	USA Scientific	2641-0016
Bunsen burner
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	Additive to internal solution
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5318	one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40	Warner Instruments	64-0707
DMSO	Biotium	90082
Dnase I,from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	11284932001	one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt)	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11255-20
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Additive to internal solution
Electrode Puller	Narashige	PC-10
Epi-illumination light source	Zeiss	CL 1500 ECO
Ethanol	Decon Labs	2716	for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes	Sutter Instruments	BF140-117-10
Fine-edged dissection blade	Fine Science Tools	10010-00
Glass Pasteur Pipettes	VWR	14673-010	to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16140063	additive to culture medium
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers	VWR	76549-914
Insulated bucket filled with ice			to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additive to internal solution
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	Additive to internal solution
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors	Fine Science Tools	14133-13
Leibovitz medium	Sigma Aldrich	L4386	dissection and bath solutions
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes	Warner Instruments	64-0236
luer-lok syringes, 30 ml	BD	302832	for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement	Fisher Scientific	41-090-101	base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M1028	Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge	World Precision Instruments	MF34G
Microforge	Narashige	MF-90	For electrode polishing.
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502-048	additiive to culture medium, for SGN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Additive to internal solution
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	for titration pH
Osmometer	Advanced Instruments Inc.	3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing	USC Material Management	MEDOX200 (Identifier: 00015)	for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm	Bemis	PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml)	Fisher Scientific	03-448-25	bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)	MWI Animal Health	15199	for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer	Nalgene	566-0020	for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm	Genessee Scientific	32-103	for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm	Midland Scientific	P7455	for gross dissection
pH Meter	Mettler Toledo	Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter	USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish	Mattek	P35GC-0-10-C	to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes	Warner Instruments	64-0375
Reference Cell	World Precision Instruments	RC1T
Scalpel blade	Miltex	4-315
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
Scientific Scale	Mettler Toledo	XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter	Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)	Warner Instruments	64-0378
Small Animal Guillotine	Kent Scientific	DCAP
Small animal guillotine	Kent Scientific	DCAP	for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Straight surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin	Sigma Aldrich	T1426	one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe	Covidien	8881500105	for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex	VWR	945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)	Millipore-Sigma	CDUFBI001