Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen

Zusammenfassung

Hier werden Methoden vorgestellt, die detaillierte Anweisungen zum Sezieren, Dissoziieren, Kultivieren und Patch-Clamp-Aufzeichnen von vestibulären Ganglion- und Spiralganglienneuronen des Innenohrs liefern.

Zusammenfassung

Die kompakte Morphologie der isolierten und kultivierten Innenohrganglienneuronen ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung der Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die zur Zellvielfalt in dieser Population beitragen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für eine erfolgreiche Sezierung, Dissoziation und Kurzzeitkultivierung der Somata von bipolaren Neuronen des Innenohrs zum Zwecke der Patch-Clamp-Aufnahme erforderlich sind. Detaillierte Anweisungen zur Präparation von vestibulären Ganglienneuronen werden mit den notwendigen Modifikationen bereitgestellt, die für die Beschichtung von Spiralganglienneuronen erforderlich sind. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in der perforierten Patch-Konfiguration. Beispielhafte Ergebnisse, die die Spannungsklemmenaufzeichnungen von hyperpolarisationsaktivierten zyklischen Nukleotid-gesteuerten (HCN)-vermittelten Strömen charakterisieren, unterstreichen die Stabilität der perforierten Patch-Aufzeichnungskonfiguration im Vergleich zur Standardkonfiguration mit gerissenen Patches. Die Kombination dieser Methoden, isolierte Somata und perforierte Patch-Clamp-Ableitungen, kann verwendet werden, um zelluläre Prozesse zu untersuchen, die lange, stabile Aufzeichnungen und die Erhaltung des intrazellulären Milieus erfordern, wie z. B. die Signalübertragung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.

Einleitung

Die bipolaren Neuronen des Nervus vestibulocochlearis verbinden die sensorischen Haarzellen des Innenohrs mit dem Hirnstamm. Sie sind Hauptträger von Informationen über Schall und Kopfbewegungen; Eine Schädigung dieser wichtigen Zellen führt zu Taubheit und Gleichgewichtsstörungen. Die vestibulären und auditiven Anteile des Nervs bestehen jeweils aus unterschiedlichen Zelltypen, die morphologisch und funktionell vielfältig sind ^1,2. Im vestibulären System feuern zwei afferente Subpopulationen spontan in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen². Es wird angenommen, dass das afferente Spike-Timing eine zugrundeliegende Diversität in der Zusammensetzung der Ionenkanäle widerspiegelt ^3,4. Im auditorischen System gibt es zwei Hauptsubpopulationen von Spiralganglienneuronen (SGNs); Während Typ-I-SGNs mit einzelnen Innenhaarzellen⁵ in Kontakt treten, kontaktieren Typ-II-SGNs mehrere Außenhaarzellen⁵. In-vitro-Ableitungen von semi-intakten und organotypischen Kulturen deuten auf Unterschiede in den Membraneigenschaften von Typ I und Typ II SGNs hin ^6,7.

Viele Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die sich an den Enden dieser Neuronen befinden, befinden sich auch in ihren Zellkörpern. So können Kulturen des isolierten vestibulären und des Spiralganglion-Somata in vitro untersucht werden, um zu verstehen, wie Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren zur Reaktion dieser Neuronen beitragen. Die kompakte Morphologie der isolierten Zellkörper ermöglicht qualitativ hochwertige elektrische Ableitungen, die sich für eine detaillierte Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen und Neurotransmitterrezeptoren eignen. Der einfache Zugang zu einer repräsentativen Vielfalt von Neuronen-Subtypen ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse der Zelldiversität.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von dissoziierten Ganglienzellkörpern aus dem oberen Teil des vestibulären Ganglions bei Ratten am postnatalen Tag (P)9 bis P20 vorgestellt. Es werden auch Vorschläge für die Erweiterung dieser Methoden auf das Spiralganglion gegeben, zusätzlich zu den Schritten, die für die erfolgreiche Extraktion, Dissoziation und Plattierung der Ganglienzellen erforderlich sind. Diese Methoden sind eine Weiterentwicklung derjenigen, die in Veröffentlichungen verschiedener Laboratorien entwickelt wurden ^8,9,10. Dieses Dokument enthält auch eine Anleitung zur Auswahl gesunder Zellen für Patch-Clamp-Aufnahmen.

Schließlich umreißt das Protokoll das Verfahren für die Patch-Clamp-Aufzeichnung unter Verwendung der perforierten Patch-Konfiguration¹¹. Obwohl die Konfiguration mit perforiertem Pflaster zeitaufwändiger und technisch anspruchsvoller ist als die gebräuchlichere Konfiguration mit gerissenem Pflaster, ist sie besser für die Aufrechterhaltung des zytoplasmatischen Milieus, das lange und stabile Aufnahmesitzungen ermöglicht. Die Vorteile dieser Aufzeichnungskonfiguration werden hier durch die verbesserte Stabilität von Hyperpolarisations-aktivierten kationischen Strömen in perforierten Patches im Vergleich zu ruptured-Patch-Aufnahmen veranschaulicht.

Dieses Protokoll ist in fünf Abschnitte unterteilt. In den Abschnitten 1-3 werden Lösungen und Werkzeuge beschrieben, die im Voraus vorbereitet und gespeichert werden können. Abschnitt 4 beschreibt die Schritte zur Dissektion und Beschichtung der vestibulären und SGNs. Abschnitt 5 beschreibt die Schritte zur Aufzeichnung von den Neuronen nach einer Periode in Kultur. In unseren Händen werden Abschnitt 4 und Abschnitt 5 über einen Zeitraum von 2 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierverwendungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Southern California genehmigt. Bei den Tieren in diesem Protokoll handelt es sich um Long-Evans-Ratten beiderlei Geschlechts im Alter von P3 bis P25, die von den Charles River Laboratories bezogen wurden, aber diese Methoden können auch auf andere Nagetierstämme angewendet werden. Bei allen Eingriffen müssen Laborkittel und Handschuhe sowie bei der Herstellung von Lösungen eine Spritzschutzbrille getragen werden.

1. Vorbereitungen

HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Lösungen und Werkzeuge können lange im Voraus so hergestellt werden, dass sie am Tag der Sektion und Aufzeichnung verwendet werden können.

1. Bereiten Sie Liebovitz-Medien vor, die mit 10 mM HEPES (L-15-Lösung) ergänzt wurden. In den folgenden Schritten wird die Herstellung von 1 l L-15-Lösung beschrieben.
   1. Gießen Sie 990 ml deionisiertes_H2Oin ein Becherglas. 2,386 g (10 mM) HEPES abmessen und hinzufügen. Fügen Sie eine Flasche mit 1 l L-15-Lösungspulver hinzu.
      HINWEIS: Pulverisiertes L-15 ist länger haltbar und benötigt weniger Lagerplatz. Alternativ können Sie L-15-Lösung kaufen und mit HEPES ergänzen. Bei letzterer Option besteht auch die Möglichkeit, eine phenolfreie Lösung zu verwenden, die für die Fluoreszenzbildgebung nützlich ist.
   2. Die Lösung auf einer Rührplatte umrühren. Mit einem pH-Messgerät langsam 1 N Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen, um einen pH-Wert zwischen 7,34 und 7,36 zu erhalten.
   3. Fügen Sie deionisiertes_H2Ohinzu, bis die Lösung ein Volumen von 1.000 ml erreicht. Filtrieren Sie die Lösung mit einer Membran mit einer Porengröße von 0,22 μm.
      HINWEIS: L-15-Lösung kann bei 4 °C etwa 1-2 Wochen gelagert werden. Bei Verwendung von L-15 mit Phenolrot färbt sich die Lösung rosa, wenn sie zu basisch ist (pH > 7,4) oder orange, wenn sie zu sauer ist (pH < 7,34).
2. Bereiten Sie das Nährmedium für vestibuläre Ganglienneuronen (VGNs) vor (mit Modifikation für SGNs). Befolgen Sie die folgenden Schritte, um 50 ml Nährmedium herzustellen:
   1. Geben Sie 47,5 ml GluMAX-I Minimum an essentiellem Medium in ein sauberes Glasbecherglas.
   2. Messen Sie 0,1194 g (10 mM) HEPES ab und fügen Sie sie hinzu. Dieser zusätzliche Puffer widersteht pH-Änderungen, während sich die Zellen absetzen, bevor sie in den Inkubator gebracht werden.
   3. Fügen Sie 2,5 ml fötales Kälberserum (FBS) hinzu. Dies ergibt 5 Vol.-% FBS in einem Gesamtvolumen von 50 ml Medium. Bei SGN-Präparaten werden 2,5 ml FBS durch 0,5 ml N2 und 1 ml B27-Lösungen ersetzt.
   4. Die Lösung auf einer Rührplatte umrühren. Geben Sie mit einem pH-Messgerät langsam 1 N NaOH hinzu, um einen pH-Wert zwischen 7,38 und 7,4 zu erhalten.
   5. Fügen Sie 0,5 ml Penicillin-Streptomycin hinzu. Die Lösung wird durch einen 0,22 μm Sterilfilter filtriert. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
   6. Mindestens 30 Minuten vor Gebrauch das Nährmedium in einen Gewebekulturkolben mit belüfteter Kappe überführen. Der Kolben mit den Nährmedien wird in einen Inkubator mit einer CO₂ -Konzentration von 5 % bei 37 °C gestellt.
3. Bereiten Sie die interne Lösung mit perforiertem Pflaster vor
   HINWEIS: Hier werden 100 ml perforierte Pflaster-Innenlösung für die Ganzzellaufzeichnung verwendet (das Rezept ist in Tabelle 1 zusammengefasst). Diese Lösungen können lange im Voraus zubereitet und bei -20 °C gelagert werden. Aliquots können unbegrenzt bei -20 °C gelagert werden, wenn sie nicht wiederholt eingefroren und aufgetaut werden.
   1. Stellen Sie bis zu 6 Monate im Voraus Stammlösungen der folgenden Sorten her und lagern Sie sie: 1 M KCl, 0,5 M Mg₂Cl (Hexahydrat) und 0,5 M CaCl₂. In luftdichten Flaschen bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Es ist eine gute Idee, die Osmolalität der Stammlösungen (2.000 mOsm für die 1 M KCl-Stammlösung; 1.500 mOsm für die Mg₂Cl- und CaCl_2-Lösungen ) zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zielkonzentration erreicht wird. Nicht verwenden, wenn die Lösung trüb wird oder Ausfällungen bildet. Dies kann ein möglicher Pausenpunkt sein.
4. Führen Sie am Tag der internen Lösungserstellung die folgenden Schritte mit den Standardlösungen aus Schritt 1.3 aus.
   1. 100 ml milli-Q (MQ)_H2O abmessen. Aus den 100 ml 40 ml entnehmen und in einem sauberen Becherglas beiseite stellen.
   2. Die restlichen 60 ml_H2Oin ein sauberes und steriles 100-ml-Becherglas geben. 2,5 ml 1 M KCl, 1 ml 0,5 M_Mg2Cl-Hexahydrat und 0,02 ml 0,5 M CaCl2_zugeben.
   3. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und stellen Sie das Becherglas auf eine Rührplatte. Umrühren, bis es sich vollständig aufgelöst hat. 1.307 g re2 SO₄ zugeben. Umrühren, bis sich das_K2SO4 aufgelöst hat.
   4. 0,1192 g HEPES (Zielwert 5 mM in einem 100-ml-Endvolumen) werden eingewogen und in die Lösung gegeben. Umrühren, bis es sich aufgelöst hat.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten vollständig aufgelöst sind, da es manchmal einige Zeit dauert, bis sich dasK2 SO₄ aufgelöst hat.
   5. 0,1902 g Ethylenglykol-Bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure (EGTA) (Ziel 5 mM in einem 100-ml-Endvolumen) werden eingewogen und zur Lösung gegeben. Da sich EGTA in einer sauren Lösung nicht vollständig auflöst, stellen Sie das Becherglas auf eine Rührplatte und setzen Sie die pH-Sonde ein.
   6. Unter Rühren wird 1 M KOH langsam titriert, bis sich das EGTA vollständig aufgelöst hat. Erwarte, dass dies geschieht, wenn der pH-Wert zwischen 6 und 7 liegt. Fügen Sie KOH langsam hinzu, bis der endgültige pH-Wert 7,35 beträgt (insgesamt ca. 1,2 bis 1,3 ml KOH).
   7. Fügen Sie MQH₂O hinzu, um die Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml zu bringen, und rühren Sie um. Die Osmolalität der Lösung (Zielwert 270 mOsm/kg für die perforierte Pflasterlösung) wird mit einem Osmometer überprüft.
   8. Filtrieren Sie die interne Lösung des perforierten Pflasters mit einem 0,22 μm Sterilfilter. In 5-ml-Aliquoten bei -20 °C lagern. Verwenden Sie für jede neue Aufnahmesitzung ein neues Aliquot.
      HINWEIS: Dies kann ein möglicher Pausenpunkt sein.

2. Herstellung von Verreibungspipetten

HINWEIS: Reibungspipetten können für mehrere Experimente wiederverwendet werden. Spülen Sie die Pipetten vor jedem Gebrauch mit Ethanol, Wasser und L-15-Lösung und reinigen Sie sie nach jedem Gebrauch mit Wasser und Ethanol. Zwischen den Anwendungen sorgfältig aufbewahren.

1. Um Reibungspipetten für die Zelldissoziation vorzubereiten, halten Sie eine Pasteurpipette aus Glas an die Flamme eines Bunsenbrenners. Sobald die Glasspitze zu schmelzen beginnt, dehnen Sie das Glas auf den gewünschten Spitzendurchmesser aus. Ziehen Sie ein Ende der Pipette von der Flamme weg, um eine kleine Biegung zu erzeugen.
2. Bringen Sie die gebogene Pipette in die Nähe eines Mikroskops. Ritzen und zerbrechen Sie das Glas mit einer Ritzfliese im gewünschten Durchmesser.
3. Führen Sie die Spitze der Pipette über die Flamme des Bunsenbrenners. Dadurch werden die rauen Kanten in der Nähe der Spitze schnell poliert. Vergewissern Sie sich, dass die Spitze nicht durch die Flamme versiegelt wird.
4. Wiederholen Sie den Vorgang, bis vier oder fünf Pipetten mit unterschiedlichen Größen vorbereitet sind.

3. Herstellung von Patch-Pipetten

HINWEIS: Bereiten Sie vor der Aufnahmesitzung, aber nach der Gangliendissektion und -kultur einen Satz Patchpipetten vor. Obwohl die Elektroden, die während der Aufnahmesitzung einzeln hergestellt werden, eine optimale Leistung erbringen, wurde ein angemessener Erfolg erzielt, wenn diese am Vorabend als Charge hergestellt wurden. Bewahren Sie die Pipetten in einem abgedeckten Glasbehälter auf, um die Spitzen vor Staub zu schützen.

1. Verwenden Sie einen vertikalen Elektrodenzieher und filamentierte Borosilikatglaspipetten mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 1,17 mm. Achten Sie darauf, dass das Glas immer frei von Staub und Fingerabdrücken ist.
2. Entnehmen Sie 8-10 Aufnahmepipetten mit einem zweistufigen Programm, wie es vom Hersteller für Patchpipetten empfohlen wird.
3. Inspektion und Hitzepolieren jeder Aufzeichnungspipettenspitze mit einer Mikroschmiede; Das Hitzepolieren fördert eine bessere Abdichtung. Der angestrebte Pipettenwiderstand liegt zwischen 4 und 8 MΩ.
4. Bewahren Sie die polierten Pipetten in einem abgedeckten Behälter auf. Dies kann als Pausenpunkt im Experiment behandelt werden.
   HINWEIS: Die Optimierung des Pipettendurchmessers, um den Zielwiderstandsbereich zu erreichen, erfordert einige Versuche und Irrtümer mit den Schritten 3.2 und 3.3. Die meisten handelsüblichen Patch-Clamp-Systeme verfügen über eine eingebaute Membrantestfunktion zur Messung des Elektrodenwiderstands in der Badlösung. Der Widerstand wird als Verhältnis des stationären Ausgangsstroms als Reaktion auf einen angelegten 5-mV-Schrittimpuls berechnet. Die Pull-Einstellungen in Schritt 3.1 und das Polieren in Schritt 3.2 müssen zunächst mit Probepipetten angepasst werden, bis der Widerstand der Probepipetten in den Bereich von 4 bis 8 MΩ fällt.
5. Beschichten Sie am Tag der Aufnahme die Pipettenspitzen, um die Pipettenkapazität und das Aufnahmerauschen zu reduzieren. Wickeln Sie dazu einen kleinen Streifen Paraffinfolie auf den Schaft der Pipette. Es ist nicht notwendig, bis zur Spitze zu wickeln.
   HINWEIS: Eine alternative Strategie besteht darin, ein Silikonelastomer auf dem Schaft der Pipette¹² zu beschichten und zu erhitzen.

4. Extraktion des vestibulären Ganglions und Plattierung der vestibulären Neuronen

1. Vorbereitung zum Sezieren
   1. Bereiten Sie eine Enzymmischung aus L-15-Lösung mit 0,05 % Kollagenase und 0,25 % Trypsin vor. Geben Sie beispielsweise 0,001 g Kollagenase und 0,005 g Trypsin zu 2 ml L-15-Lösung in ein Becherglas, fügen Sie einen kleinen Magnetrührer hinzu und rühren Sie, bis alles vollständig vermischt ist. Bei Raumtemperatur beiseite stellen.
   2. Bereiten Sie eine handelsübliche Guillotine vor, indem Sie Papiertücher an die Seite und unter die Guillotine legen, um die Exposition der Arbeitsplatte und anderer Oberflächen gegenüber Blut und anderen biologischen Materialien zu minimieren.
   3. Lege eine große Edelstahlschere, eine große Pinzette und eine große Federschere bereit. Halten Sie eine große Sprühflasche mit 70% Ethanol für die Kopfreinigung bereit.
   4. Füllen Sie ein 100-ml-Becherglas mit L-15-Lösung und legen Sie es auf Eis. Die L-15-Lösung mit Sauerstoff anreichern.
   5. Legen Sie die Federschere, die chirurgische Schere, die Pinzette, das Skalpell und die Transferpipette aus (siehe Materialtabelle).
   6. Bereiten Sie eine 60 mm Petrischale (für die grobe Dissektion) und zwei 35 mm Petrischalen (für die Reinigung/Feindissektion der Ganglien) vor. Füllen Sie die 60-mm-Schale mit einer 30-ml-Spritze mit einer 0,22-μm-Filterspitze mit sauerstoffhaltiger L-15-Lösung.
2. Euthanasie, Kopfreinigung und Hemisektion
   1. Wiegen Sie die Jungtiere, um die geeignete Dosierung der Fatal-Plus-Verdünnung für die intraperitoneale Verabreichung zu berechnen (~0,01 ml pro 10 g).
   2. Sobald eine tiefe Anästhesieebene erreicht ist, die durch eine mangelnde Reaktion auf das Einklemmen der Zehen festgestellt wird, wird mit der Guillotine enthauptet.
   3. Spülen Sie den Kopf gründlich mit 70%igem Ethanol und dann gründlich mit L-15-Lösung.
   4. Entfernen Sie die Haut vollständig vom Schädel. Halbieren Sie den Kopf mit einer großen Federschere, indem Sie an der Eintrittsstelle des Rückenmarks zum Gehirn beginnen und zwei Schnitte machen, den ersten durch die Oberseite des Schädels und den zweiten durch die Unterseite des Kiefers. Beenden Sie die Halbierung des Kopfes mit einer chirurgischen Schere.
   5. Legen Sie beide Kopfhälften mit der Gehirnhälfte nach unten in eine 60 mm Petrischale, die mit L-15-Lösung gefüllt ist. Legen Sie das frische Gewebe, das gerade nicht präpariert wird, auf Eis.
3. Extraktion des Ganglion vestibularis superior
   1. Schöpfen Sie das Gehirn mit einer geschlossenen chirurgischen Schere aus. Durchtrennen und entfernen Sie den Hirnnerv, um das Gehirn vollständig vom Schädel zu lösen.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte die otische Kapsel (in Form der Zahl 8) am Hinterkopf sichtbar sein.
   2. Ziehen Sie mit einer Pinzette beginnend am Hinterkopf klares membranöses Material ab.
   3. Schneiden Sie die Oberseite des Schädels mit einer chirurgischen Schere heraus. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe am Hinterkopf und Hals, um den Sezierbereich und die otische Kapsel sauberer und leichter zugänglich zu machen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Schale zu trüb zu machen, indem Sie überschüssiges Gewebe während des gesamten Eingriffs entfernen.
   4. Übertragen Sie das Gewebe in eine zweite Petrischale mit frischer L-15-Lösung. Lokalisieren Sie die otische Kapsel und die auditiven, oberen vestibulären und unteren vestibulären Nerven. Schneiden Sie den Hörnerv ab und trennen Sie die oberen und unteren Ganglien mit einer kleinen Federschere.
      HINWEIS: Obwohl die Somata des Gleichgewichtsnervs sowohl in den unteren (dünneren) als auch in den oberen (dickeren) Ganglien zu finden sind, haben Zellen, die aus dem oberen Ganglion extrahiert werden, ein besseres Überleben.
   5. Rasieren Sie mit einem Skalpell vorsichtig den knöchernen Kamm ab, um den knöchernen Bereich zu schwächen, unter dem der Nerv in die knöcherne Kapsel eintaucht. Entfernen Sie die Ablagerungen vorsichtig mit einer feinen Pinzette und legen Sie den gesamten geschwollenen Teil des Ganglions frei.
   6. Verwenden Sie die feine Federschere, um das Ganglion von dem peripheren Nervenast zu trennen, der in Richtung Utriculus taucht.
   7. Entfernen Sie das obere Ganglion mit einer feinen Pinzette und achten Sie darauf, nicht zu nah am Gangliengewebe zu kneifen. In eine 35-mm-Petrischale mit frischer L-15-Lösung geben.
   8. Bevor Sie fortfahren, heizen Sie die Enzymlösung vor: Gießen Sie die Enzymmischung in eine 35-mm-Petrischale und legen Sie sie für 10-15 Minuten in einen 37 °C warmen Inkubator.
   9. Reinigen Sie das Ganglion mit einer feinen Pinzette und einer kleinen Federschere, indem Sie Knochen (der weiß und kristallisiert erscheint), überschüssiges Gewebe, Nervenfasern und alle anderen überflüssigen Strukturen entfernen. Achten Sie darauf, die Entfernung von Gangliengewebe zu minimieren.
4. Dissoziation und Plattierung von Gewebe
   1. Die gereinigten Ganglien in die vorgewärmte Enzymlösung geben und für 10 bis 40 Minuten wieder in den Inkubator geben. Die Enzymbehandlung ist abgeschlossen, sobald das Gewebe beginnt, auseinanderzubrechen, aber in einem Stück bleibt. Eine Überbehandlung des Gewebes mit Enzymen führt zu einer vollständigen Auflösung der Ganglien vor der Verreibung.
      HINWEIS: Wie lange das Gewebe enzymatisch behandelt wird, hängt vom Alter des Tieres ab. Zum Beispiel werden Ganglien von P9-Ratten 25 Minuten lang mit Enzym behandelt, und Ganglien von P15-Ratten werden 35 Minuten lang mit Enzym behandelt.
   2. Die Ganglien in die 35 mm Petrischale mit frischer L-15-Lösung überführen und 2-3 min inkubieren.
   3. Übertragen Sie die Ganglien in eine andere 35-mm-Petrischale, die mit gefilterten Nährmedien gefüllt ist.
   4. Pipettieren Sie mit einer 200-μl-Mikropipette einen ~150 μl-Tropfen gefiltertes Nährmedium auf eine beschichtete Glasbodenschale. Fügen Sie nicht zu viel Lösung hinzu, da es wichtig ist, die Oberflächenspannung aufrechtzuerhalten, um eine Blase der Lösung zu bilden, die über dem Deckglas verbleibt.
   5. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Ganglien (eins bis vier) auf das Deckglas.
   6. Ziehen Sie eine kleine Menge Nährmedium aus der Kulturschale, um die Reibungspipette mit Medium zu spülen, um zu verhindern, dass das Gewebe an den Seiten der Glaspipette klebt. Trituieren Sie, indem Sie das Gewebe vorsichtig und wiederholt durch die Pipette führen, bis die Ganglien ausreichend dissoziiert sind.
      HINWEIS: Überlasten Sie das Gewebe nicht, um Einzelzellsuspensionen zu versuchen, oder lassen Sie die Zellen mit übermäßigem Überdruck auf den Boden der Schale krachen. Vermeiden Sie auch die Bildung von Luftblasen, da dies das Überleben der Zellen verringert. Sanftes Verreiben ist der Schlüssel zum erfolgreichen Überleben der Zellen.
   7. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten ruhen. Prüfen Sie unter dem Lichtmikroskop, ob sich die Zellen auf dem Deckglas abgesetzt haben.
   8. Eine Kulturschale vorsichtig für 12-24 h in einen 37 °C warmen Inkubator stellen. Achte auch hier darauf, dass die Blase der Lösung intakt bleibt.
      HINWEIS: Wenn Sie länger als 24 Stunden kultivieren, aktualisieren Sie die Nährmedien täglich. Dies kann ein möglicher Pausenpunkt sein.
5. Beschichtung von SGNs
   1. Befolgen Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.5 der Anweisungen für das Vestibularganglion, um den Kopf zu halbieren.
   2. Lokalisiere die Kapsel (in Form der Zahl 8) und entferne sie aus dem Schädel, indem du die Ränder mit einer stumpfen Zange abschneidest.
   3. Wechseln Sie die L-15-Lösung. Der spiralförmige Teil der otischen Kapsel beherbergt die Cochlea mit dem Corti-Organ. Den Knochen über den Cochlea-Drehungen abtragen, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen, mit einer feinen Pinzette, die parallel zur Krümmung des Knochens verläuft.
   4. Sobald genügend Knochen entfernt wurde, um das volle Ausmaß der Cochlea-Drehungen freizulegen, trennen Sie mit einer kleinen Federschere den Modiolus (dickes, weißes, faseriges Gewebe mit zentralen Axonen von SGNs) an der Basis der Cochlea ab, um ihn vom Rest der otischen Kapsel zu befreien.
   5. Entfernen Sie die Stria vascularis, indem Sie die Stria an der Basis mit einer feinen Pinzette zusammendrücken. Wickeln Sie sich um die Spirale herum und bis zum Scheitelpunkt ab, um sie vom Corti-Organ zu lösen.
   6. Schneiden Sie das Corti-Organ mit einer kleinen Federschere in zwei bis drei Umdrehungen, so dass es flach aufliegt.
   7. Den Modiolus mit einer kleinen Federschere aus jeder Umdrehung herausschneiden.
   8. Entfernen Sie das spiralförmige Ganglion, indem Sie an der Kante schneiden, an der die SGN-Faserbahnen in Richtung der Haarzellen ragen.
   9. Reinigen Sie das Ganglion mit einer feinen Pinzette, indem Sie Knochen (der weiß und kristallisiert erscheint), den Modiolus (der weiß und faserig erscheint) und alle anderen überflüssigen Strukturen entfernen. Achten Sie darauf, die Entfernung von Gangliengewebe zu minimieren.
   10. Für die enzymatische Behandlung des Ganglions Spiralgang ist das gleiche Verfahren anzuwenden wie für das Ganglion vestibularis in Abschnitt 4.4. Die enzymatischen Zeiten sind im Ganglion spiralis, das länglicher ist als das Ganglion vestibularis, typischerweise kürzer. Verwenden Sie Reibungspipetten mit kleinerem Durchmesser für das Spiralganglion im Vergleich zum vestibulären Ganglion.
   11. Das Spiralganglion wird in einem mit N2 und B27 angereicherten Nährmedium verreimt, das im Rezept für Nährmedien angegeben ist.
   12. Die Kulturschale mit den dissoziierten Ganglien wird für 12-24 h in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ gestellt.
       HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

5. Aufnahme

HINWEIS: Bei diesem Verfahren werden Patch-Clamp-Aufnahmen vom isolierten Ganglion in der Regel 12-24 Stunden nach der Plattierung durchgeführt. Andere Labore haben Ergebnisse von Neuronen nach viel längeren Perioden in Kultur berichtet¹⁰.

1. Bereiten Sie die Aufnahmekammer vor
   1. Verwenden Sie die Schnellwechsel-Aufnahmekammer (oder eine gleichwertige Kammer), die Patch-Clamp-Aufnahmen direkt in der Kulturschale ermöglicht. Richten Sie die Kammer auf dem inversen Mikroskop ein.
   2. Setzen Sie die Kulturschalen mit Glasboden in die Kammer ein.
   3. Führen Sie die L-15-Lösung durch ein Perfusionsschlauchsystem in die Aufzeichnungskammer. Stabilisieren Sie den Perfusionsein- und -ausfluss in der Kammer mit einer Rate von 0,5-1 ml pro Minute.
2. Vorbereiten der internen Lösung für das Laden von Elektroden
   1. Tauen Sie ein Aliquot der internen Lösung des perforierten Pflasters auf. Geben Sie 2,5 ml der Lösung auf eine 35-mm-Kulturschale. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Kulturschale und beschriften Sie ihn mit "Tip Dip". In einer staubfreien Zone aufbewahren, da es sehr wichtig ist, diese Lösung so sauber wie möglich zu halten.
   2. Wiegen Sie 1 mg Amphotericin-B ab und fügen Sie 20 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu. Wirbeln Sie die Lösung vor und schleudern Sie sie herunter, bis sich das gesamte Amphotericin-B in der Lösung befindet. 10 μl der DMSO/Amphotericin-B-Lösung zu den restlichen 2 ml der aufgetauten perforierten Pflaster-Innenlösung geben. Ziehen Sie die Lösung zwei- oder dreimal mit einer Pipette zurück und vertreiben Sie sie, um sicherzustellen, dass sich das DMSO/Amphotericin-B gleichmäßig mit der inneren Lösung vermischt hat. Die Lösung hat einen leichten gelblichen Schimmer.
   3. Ziehen Sie die interne Lösung des perforierten Amphotericin-B-Pflasters in eine 3-ml-Spritze. Geben Sie eine 34-g-Spitze in die Spritze. Wickeln Sie die Spritze in Aluminiumfolie ein und halten Sie die Spritze auf Eis.
      HINWEIS: Diese Lösung muss alle 2 Stunden erneuert werden, um die Wirksamkeit des Amphotericin-B bei der Perforation der Zellmembran zu gewährleisten. Amphotericin-B ist lichtempfindlich und muss mit Aluminiumfolie oder anderen Methoden vor Licht geschützt werden.
3. Patch-Clamp-Aufnahmen
   1. Visualisieren Sie die Neuronen mit einem 10x- oder 20x-Objektiv. Passen Sie die Beleuchtung an und optimieren Sie die Optik, um die Grenzen und Schatten um die Zelle herum zu sehen.
   2. Überprüfen Sie die Qualität der isolierten Neuronen. Versuchen Sie es nur mit Neuronen mit glatten und ebenen Oberflächen, die nicht zu stark kontrastiert sind und nur kleine, verstreute Krater haben. Achten Sie auch darauf, Neuronenpaare, Neuronen, die von Trümmern umgeben sind, oder andere Zellen zu vermeiden.
   3. Identifizieren Sie unter 100-facher Vergrößerung ein Neuron oder ein Feld von Neuronen, die gepatcht werden sollen, und richten Sie sie in der Mitte des Sichtfelds aus.
   4. Füllen Sie die Spitze der Pipette mit einer sauberen Lösung, die kein Amphotericin enthält, indem Sie die Spitze (~20 s lang) in die saubere Lösung tauchen, die in eine Kulturschale gegeben wurde. Durch die Kapillarwirkung wird eine kleine Menge Lösung in die Spitze gezogen.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop durch, mit dem Sie feststellen können, wie gut die Spitze die Tip-Dip-Lösung hält. Wenn die Lösung ~10-20 s nicht hält, ist die Form der Elektrode nicht ideal. Konfigurieren Sie in diesem Fall das Elektrodenziehprogramm neu, um eine längere Spitze zu erhalten.
   5. Füllen Sie dann die Rückseite der Pipette mit der internen Lösung, die Amphotericin enthält. Das Filament in der Pipette zieht die Lösung nach unten, um auf die saubere Lösung in der Spitze zu treffen. Lasse das Filament die Lösung sanft nach unten ziehen und versuche nicht, Blasen herauszuklopfen, da dies das Amphotericin zu schnell an die Spitze drückt.
   6. Verwenden Sie eine Spritze, um die Lösung herauszuziehen, die sich möglicherweise ganz hinten an der Elektrode befindet.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, von diesem Punkt aus schnell zu arbeiten, um zu landen und eine hochbeständige Dichtung auf der gewünschten Zelle zu bilden.
   7. Setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter ein. Vergewissern Sie sich, dass die Pipette fest in der Halterung sitzt, um ein Abdriften der Pipette zu verhindern. Wenn die Pipette nicht stabil ist, tauschen Sie die Dichtungs-O-Ringe an der Vorder- und Rückseite des Pipettenhalters aus, um die Abdrift zu minimieren und eine starke Saugleistung aufrechtzuerhalten. Ersetzen Sie die Pipette durch eine frisch gefüllte.
   8. Senken Sie die Pipette in das Bad der Aufnahmekammer.
   9. Platzieren Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Sichtfeldes. Stellen Sie sicher, dass die Spitze frei von Luftblasen oder anderen Ablagerungen ist.
   10. Wenden Sie einen Spannungsschritt (5 mV) im Membrantest an, um den Pipettenwiderstand zu überwachen. Überwachen Sie den Eingangswiderstand während des gesamten Prozesses der Bildung einer Dichtung auf der Zelle.
   11. Heben Sie das Pipetten-Offset-Potenzial auf, so dass der Pipettenstrom im Membrantestmodus von pClamp Null anzeigt.
   12. Korrigieren Sie die Pipettenkapazität mit der schnellen Kapazitätskompensationsfunktion am Patch-Clamp-Verstärker (Cp-Schnellwahlschalter im Multiclamp Commander-Softpanel).
   13. Bewegen Sie die Pipette nach unten in die Zelle.
   14. Sobald die Pipette nahe genug am Neuron ist, wechseln Sie zum Objektiv mit höherer Vergrößerung und senden Sie das Bild durch eine Kamera an einen Monitor (verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, insgesamt 400-fache Vergrößerung). Stellen Sie die Pipette ein und zentrieren Sie das Neuron neu.
   15. Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode in die Nähe des Somas. Lokalisieren Sie die Mitte des Neurons auf dem Monitor und positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode über dem Neuron.
   16. Nähern Sie sich dem Neuron von oben, so dass die Elektrode in der Mitte der kugelförmigen Zelle landet. Stellen Sie den Pipettenversatz so ein, dass die konstanten DC-Potentiale im System auf Null gesetzt werden.
   17. Positionieren Sie die Pipette in der Nähe der Membran. Landen Sie fest in der Mitte der Zelle.
       HINWEIS: Bei der Landung kommt es zu einer kleinen Vertiefung auf der Oberfläche des Neurons und zu einer Verdopplung/Verdreifachung des Eingangswiderstands.
   18. Üben Sie Unterdruck (Absaugung) mit einer Spritze oder Mundpipette aus. Schalten Sie das Haltepotenzial von -60 mV ein. Der Dichtungswiderstand sollte sich erhöhen, bis er ein Giga-Ohm überschreitet.
       HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, um die Zeit zwischen dem Befüllen einer Elektrode und der Landung auf einer Zelle zu verkürzen. Es gibt eine begrenzte Zeit, bevor das Amphotericin, das in Schritt 5.3.5 zu der internen Lösung des perforierten Pflasters hinzugefügt wurde, die Elektrodenspitze erreicht. Sobald die Spitze mit Amphotericin verunreinigt ist, ist es schwierig, hochbeständige Dichtungen zu bilden, und der Widerstand stagniert oft bei ~200 Megaohm.
   19. Sobald sich eine Giga-Ohm-Dichtung gebildet hat, lassen Sie den Unterdruck ab. Sobald sich die Dichtung gebildet hat, wenden Sie eine schnelle Kapazitätskompensation an, um die Amplitude der Pipettenkapazitätstransienten im Membrantestmodus so weit wie möglich zu reduzieren.
   20. Wenn Amphotericin zu wirken beginnt, beobachten Sie, wie der Eingangswiderstand langsam abnimmt und der Strom, der als Reaktion auf den 5-mV-Spannungsschritt fließt, allmählich zunimmt, wenn das Amphotericin in die Membran eintritt. Eine plötzliche Abnahme des Serienwiderstands anstelle einer allmählichen Stabilisierung deutet darauf hin, dass eine spontane Ruptur aufgetreten ist.
   21. Schätzen Sie die Gesamtzellenkapazität und den Serienwiderstand mit der kapazitiven Transienten-Null-Funktion des Verstärkers. Dokumentieren und überwachen Sie den Serienwiderstand zu Beginn und regelmäßig während des Experiments.
       HINWEIS: Die Stabilisierung des Serienwiderstands kann zwischen 5 und 20 Minuten dauern, abhängig von der Größe der Elektrode und der Menge der sauberen Lösung, die in die Pipette gezogen wird. Die Modi Voltage-clamp und current-clamp können verwendet werden, sobald sich der Serienwiderstand unter 30 Megaohm stabilisiert hat. Manchmal wird ein Anschwellen oder Schrumpfen der Neuronen während der Aufzeichnung beobachtet, aber selten, wenn die Osmolarität und der pH-Wert der Lösungen richtig eingestellt sind.

Ergebnisse

Das Ausführen von Spannungsklemmprotokollen durch Anwendung von Familien von Spannungsschritten zeigt die spannungsabhängige Aktivierung einer Vielzahl unterschiedlicher Stromfamilien. Repräsentative Beispiele von Ganzzellenströmen, die von einem VGN hervorgerufen und aus veröffentlichten Aufzeichnungen¹³ adaptiert wurden, sind in 1A, B gezeigt. Durch das Anlegen von Depolarisationsspannungen (Abbildung 1B) wird ein ...

Diskussion

Die hier vorgestellten Methoden sind spezifisch für Aufzeichnungen von isolierten Neuronen; Frühere Studien konzentrierten sich auf Ableitungen von Axonendigungen in einem semi-intakten Präparat. Im Vergleich zu bestehenden Klemmenaufzeichnungstechniken bieten isolierte Aufzeichnungen ein überlegenes Raumklemmen- und Isopotentialverhalten. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll Zugang zu einer breiteren Stichprobe von Neuronen, da nur kelchtragende Subpopulationen in semi-intakten Aufzeichnungen der vestibulären Ep...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	For perforated patch recordings.
ATP di-sodium	Sigma-Aldrich	A7699	Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044	additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge	USA Scientific	2641-0016
Bunsen burner
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	Additive to internal solution
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5318	one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40	Warner Instruments	64-0707
DMSO	Biotium	90082
Dnase I,from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	11284932001	one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt)	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11255-20
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Additive to internal solution
Electrode Puller	Narashige	PC-10
Epi-illumination light source	Zeiss	CL 1500 ECO
Ethanol	Decon Labs	2716	for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes	Sutter Instruments	BF140-117-10
Fine-edged dissection blade	Fine Science Tools	10010-00
Glass Pasteur Pipettes	VWR	14673-010	to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16140063	additive to culture medium
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers	VWR	76549-914
Insulated bucket filled with ice			to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additive to internal solution
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	Additive to internal solution
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors	Fine Science Tools	14133-13
Leibovitz medium	Sigma Aldrich	L4386	dissection and bath solutions
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes	Warner Instruments	64-0236
luer-lok syringes, 30 ml	BD	302832	for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement	Fisher Scientific	41-090-101	base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M1028	Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge	World Precision Instruments	MF34G
Microforge	Narashige	MF-90	For electrode polishing.
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502-048	additiive to culture medium, for SGN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Additive to internal solution
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	for titration pH
Osmometer	Advanced Instruments Inc.	3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing	USC Material Management	MEDOX200 (Identifier: 00015)	for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm	Bemis	PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml)	Fisher Scientific	03-448-25	bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)	MWI Animal Health	15199	for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer	Nalgene	566-0020	for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm	Genessee Scientific	32-103	for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm	Midland Scientific	P7455	for gross dissection
pH Meter	Mettler Toledo	Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter	USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish	Mattek	P35GC-0-10-C	to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes	Warner Instruments	64-0375
Reference Cell	World Precision Instruments	RC1T
Scalpel blade	Miltex	4-315
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
Scientific Scale	Mettler Toledo	XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter	Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)	Warner Instruments	64-0378
Small Animal Guillotine	Kent Scientific	DCAP
Small animal guillotine	Kent Scientific	DCAP	for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Straight surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin	Sigma Aldrich	T1426	one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe	Covidien	8881500105	for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex	VWR	945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)	Millipore-Sigma	CDUFBI001