Выделение и культивирование вестибулярных и спиральных ганглионарных сомат у неонатальных грызунов для записи с помощью патч-клэмпа

Резюме

Здесь представлены методы, содержащие подробные инструкции по препарированию, диссоциации, культивированию и записи патчей-зажимов из нейронов вестибулярного ганглия и спирального ганглия внутреннего уха.

Аннотация

Компактная морфология изолированных и культивируемых ганглионарных нейронов внутреннего уха позволяет детально охарактеризовать ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, которые вносят свой вклад в разнообразие клеток в этой популяции. В этом протоколе описаны шаги, необходимые для успешного препарирования, диссоциации и кратковременного культивирования сомат биполярных нейронов внутреннего уха с целью записи патч-зажимов. Подробная инструкция по подготовке нейронов вестибулярного ганглия снабжена необходимыми модификациями, необходимыми для нанесения покрытия нейронов спиральных ганглиозов. Протокол включает в себя инструкции по выполнению записи с коммутационными зажимами всей ячейки в конфигурации перфорированного патча. Примеры результатов, характеризующих записи токов, опосредованных гиперполяризационными циклическими нуклеотидно-зависимыми (HCN)-опосредованными токами, подчеркивают стабильность конфигурации записи с перфорированным патчем по сравнению с более стандартной конфигурацией с разорванным патчем. Комбинация этих методов, изолированная сомата плюс перфорированные записи с заплатками-зажимами, может быть использована для изучения клеточных процессов, требующих длительных, стабильных записей и сохранения внутриклеточной среды, таких как передача сигналов через рецепторы, связанные с G-белком.

Введение

Биполярные нейроны вестибулокохлеарного нерва соединяют сенсорные волосковые клетки внутреннего уха со стволом мозга. Они являются основными носителями информации о звуках и движениях головы; Повреждение этих важных клеток приводит к глухоте и нарушениям равновесия. Вестибулярная и слуховая части нерва состоят из различных типов клеток, которые морфологически и функционально разнообразны ^1,2. В вестибулярном аппарате две афферентные субпопуляции спонтанно возбуждаются с интервалами, которые являются либо регулярными, либо нерегулярными^. Считается, что время афферентного спайка отражает основное разнообразие в составе ионных каналов ^3,4. В слуховой системе выделяют две основные субпопуляции нейронов спиральных ганглиозов (СГН); в то время как SGN типа I контактируют с отдельными внутренними волосковыми клетками⁵, SGN типа II контактируют с несколькими внешними волосковыми клетками⁵. Записи in vitro из полуинтактных и органотипических культур свидетельствуют о различиях в мембранных свойствах SGN I и II типов ^6,7.

Многие ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, обнаруженные на концах этих нейронов, также находятся в их клеточных телах. Таким образом, культуры изолированных вестибулярных и спиральных ганглиозных сомат могут быть изучены in vitro , чтобы понять, как ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров способствуют ответу этих нейронов. Компактная морфология изолированных клеточных тел позволяет получать высококачественные электрические записи, подходящие для детальной характеристики потенциал-зависимых ионных каналов и рецепторов нейротрансмиттеров. Легкий доступ к репрезентативному разнообразию подтипов нейронов позволяет проводить высокопроизводительный анализ разнообразия клеток.

В данной статье представлен метод выделения и культивирования диссоциированных тел ганглиозных клеток из верхней части вестибулярного ганглия у крыс на постнатальные сутки (Р)9–Р20. Также предлагаются варианты распространения этих методов на спиральный ганглий в дополнение к шагам, необходимым для успешного извлечения, диссоциации и покрытия ганглиозных клеток. Эти методы являются эволюцией методов, разработанных в публикациях различных лабораторий ^8,9,10. Кроме того, в этот документ включено руководство по выбору здоровых клеток для записи с помощью патч-клэмпа.

Наконец, протокол описывает процедуру записи с использованием конфигурации 11 с использованием конфигурации¹¹ с перфорированным патчем. Несмотря на то, что конфигурация с перфорированным пластырем является более трудоемкой и технически сложной, чем более распространенная конфигурация с разорванным пластырем, она лучше подходит для поддержания цитоплазматической среды, которая позволяет проводить длительные и стабильные сеансы записи. Преимущества этой конфигурации записи проиллюстрированы здесь улучшенной стабильностью гиперполяризационно-активированных катионных токов в перфорированном пластыре по сравнению с разорванным патчем.

Этот протокол состоит из пяти разделов. В разделах 1-3 описываются решения и инструменты, которые могут быть подготовлены и сохранены заранее. В разделе 4 описаны этапы препарирования и покрытия вестибулярного аппарата и СГН. В разделе 5 описаны этапы регистрации нейронов после определенного периода культивирования. В наших руках разделы 4 и 5 выполняются в течение 2 дней подряд.

протокол

Все виды использования животных, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Калифорнии. Животными в этом протоколе являются крысы Лонг Эванс обоих полов в возрасте от P3 до P25, полученные из лабораторий Чарльз Ривер, но эти методы могут быть применены и к другим линиям грызунов. Во время всех процедур необходимо надевать лабораторный халат и перчатки, а также брызгозащитные очки при приготовлении растворов.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы и инструменты, описанные в этом разделе, могут быть изготовлены заблаговременно для использования в день вскрытия и записи.

1. Приготовьте среду Liebovitz с добавлением 10 мМ HEPES (раствор L-15). Следующие шаги описывают приготовление 1 л раствора L-15.
   1. Налейте 990 мл деионизированного_H2Oв один стакан. Отмерьте и добавьте 2,386 г (10 мМ) HEPES. Добавьте один флакон 1 л порошка раствора L-15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Порошкообразный L-15 имеет более длительный срок хранения и занимает меньше места при хранении. В качестве альтернативы приобретите раствор L-15 и дополните его HEPES. В последнем варианте также есть возможность использовать раствор без фенола, что полезно для флуоресцентной визуализации.
   2. Перемешайте раствор на тарелке для перемешивания. С помощью рН-метра медленно добавьте 1 Н гидроксида натрия (NaOH), чтобы получить рН от 7,34 до 7,36.
   3. Добавляйте деионизированный_H2Oдо тех пор, пока раствор не достигнет объема 1000 мл. Отфильтруйте раствор с помощью мембраны с размером пор 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор L-15 можно хранить при температуре 4 °C около 1-2 недель. При использовании L-15, приготовленного с фенол-красным, раствор станет розовым, если он слишком щелочной (рН > 7,4), или оранжевым, если он слишком кислый (рН < 7,34).
2. Подготовьте питательную среду для нейронов вестибулярного ганглия (ВГН) (с модификацией для СГН). Выполните следующие действия, чтобы получить 50 мл питательной среды:
   1. Добавьте 47,5 мл минимальной необходимой среды GluMAX-I в чистый стеклянный стакан.
   2. Отмерьте и добавьте 0,1194 г (10 мМ) HEPES. Этот дополнительный буфер сопротивляется изменениям pH, пока клетки оседают, прежде чем их переместить в инкубатор.
   3. Добавьте 2,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS). Это составляет 5% по объему ФБС в общем объеме 50 мл среды. Для препаратов СГН 2,5 мл ФБС заменяют 0,5 мл раствора N2 и 1 мл раствора В27.
   4. Перемешайте раствор на тарелке для перемешивания. Используя рН-метр, медленно добавляйте 1 Н NaOH, чтобы получить рН от 7,38 до 7,4.
   5. Добавьте 0,5 мл пенициллина-стрептомицина. Процеживают раствор через стерильный фильтр 0,22 мкм. Хранить раствор при температуре 4 °C.
   6. Не менее чем за 30 мин до использования переложите питательную среду в колбу для тканевых культур с вентилируемым колпачком. Поместите колбу с питательными средами в инкубатор с концентрацией_СО2 5% при температуре 37 °C.
3. Приготовьте перфорированный внутренний раствор
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для регистрации всей клетки используется 100 мл внутреннего раствора перфорированного пластыря (рецепт обобщен в таблице 1). Эти растворы можно приготовить заблаговременно и хранить при температуре -20 °C. Аликвоты можно хранить неограниченное время при температуре -20 °C, если они не подвергаются повторному циклу замораживания и оттаивания.
   1. За 6 месяцев до начала производства и хранения на складе растворы следующих веществ: 1 М KCl, 0,5 М Mg₂Cl (гексагидрат) и 0,5 M CaCl₂. Хранить в герметичных бутылках до 6 месяцев при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверить осмоляльность исходных растворов (2 000 мОсм для исходного раствора 1 М KCl; 1 500 мОсм для растворов_Mg2Cl и CaCl₂ ), чтобы убедиться, что целевая концентрация достигнута. Не используйте, если раствор мутнеет или образует осадок. Это может быть возможной точкой паузы.
4. В день приготовления внутреннего раствора выполните следующие действия, используя исходные растворы из шага 1.3.
   1. Отмерьте 100 мл milli-Q (MQ)H₂O. Вылейте 40 мл из 100 мл и отложите в чистую чашку.
   2. Добавьте оставшиеся 60 мл_H2Oв чистый и стерильный стакан объемом 100 мл. Добавьте 2,5 мл 1 М KCl, 1 мл 0,5 М мг₂гексагидрата и 0,02 мл 0,5 М CaCl₂.
   3. Добавьте перемешиватель и поместите стакан на тарелку для перемешивания. Перемешайте до полного растворения. Добавить 1,307 г_К2СО₄. Перемешивайте, пока K₂SO₄ не растворится.
   4. Взвесьте 0,1192 г HEPES (целевая концентрация 5 мМ в конечном объеме 100 мл) и добавьте в раствор. Перемешайте до полного растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все компоненты полностью растворены, так как иногда для растворения K₂SO₄ требуется время.
   5. Взвесьте 0,1902 г этиленгликоль-бис(β-аминоэтилового эфира)-N,N,N′,N′-тетрауксусной кислоты (EGTA) (целевая 5 мМ в конечном объеме 100 мл) и добавьте в раствор. Поскольку EGTA не полностью растворяется в кислом растворе, поместите стакан на пластину для перемешивания и вставьте датчик pH.
   6. Помешивая, медленно титруйте 1 М КОН до полного растворения ЭГТА. Ожидайте, что это произойдет, когда pH будет между 6 и 7. Продолжайте медленно добавлять KOH до тех пор, пока окончательный pH не станет 7,35 (примерно от 1,2 до 1,3 мл KOH в общей сложности).
   7. Добавьте MQH₂O, доведите раствор до конечного объема 100 мл и перемешайте. Осмоляльность раствора (целевая концентрация 270 мОсм/кг для раствора с перфорированным пластырем) проверяют с помощью осмометра.
   8. Отфильтруйте внутренний раствор перфорированного пластыря с помощью стерильного фильтра 0,22 мкм. Хранить в аликвотах по 5 мл при температуре -20 °C. Используйте новую аликвоту для каждого нового сеанса записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть возможной точкой паузы.

2. Изготовление тритурационных пипеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетки для растирания можно повторно использовать для нескольких экспериментов. Промывайте пипетки этанолом, водой и раствором L-15 перед каждым использованием и очищайте их водой и этанолом после каждого использования. Тщательно храните между использованиями.

1. Чтобы подготовить тритурационные пипетки для диссоциации клеток, поднесите стеклянную пипетку Пастера к пламени горелки Бунзена. Как только стеклянный наконечник начнет плавиться, растяните стекло до желаемого диаметра. Оттяните один конец пипетки от пламени, чтобы создать небольшой изгиб.
2. Поднесите согнутую пипетку к микроскопу. С помощью подрезной плитки надрежьте и разбейте стекло нужного диаметра.
3. Проведите кончиком пипетки над пламенем горелки Бунзена. Это позволит быстро отполировать шероховатые края возле кончика. Убедитесь, что наконечник не запечатан пламенем.
4. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будут подготовлены четыре или пять пипеток разного размера.

3. Изготовление патч-пипеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте набор пластырных пипеток перед сеансом записи, но после рассечения ганглия и бактериологического исследования. Несмотря на то, что электроды, изготовленные по одному во время сеанса записи, являются оптимальными по производительности, разумный успех был достигнут, когда они были изготовлены партиями накануне вечером. Храните пипетки в закрытом стеклянном контейнере, чтобы защитить наконечники от пыли.

1. Используйте вертикальный съемник электродов и пипетки из боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 1,17 мм. Следите за тем, чтобы на стекле всегда не было пыли и отпечатков пальцев.
2. Вытащите 8–10 записывающих пипеток с помощью двухступенчатой программы, рекомендованной производителем для патч-пипеток.
3. Осмотрите и отполируйте каждый наконечник пипетки с помощью микрокузницы; Термическая полировка способствует лучшей герметизации. Целевое сопротивление пипетки составляет от 4 до 8 МОм.
4. Храните полированные пипетки в закрытом контейнере. Это можно рассматривать как точку паузы в эксперименте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация диаметра пипетки для достижения целевого диапазона сопротивления требует некоторых проб и ошибок на этапах 3.2 и 3.3. Большинство коммерческих систем с накладными зажимами имеют встроенную функцию тестирования мембраны для измерения сопротивления электродов в растворе ванны. Сопротивление вычисляется как отношение установившегося выходного тока в ответ на приложенный импульс с шагом 5 мВ. Настройки тяги на этапе 3.1 и полировки на шаге 3.2 должны быть сначала отрегулированы с помощью пробных пипеток до тех пор, пока сопротивление пробных пипеток не упадет в диапазоне от 4 до 8 МОм.
5. В день записи покройте наконечники пипеток, чтобы уменьшить емкость пипетки и шум при записи. Для этого оберните небольшую полоску парафиновой пленки на стержень пипетки. Не обязательно заворачивать до самого кончика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативная стратегия заключается в нанесении покрытия и нагревании силиконового эластомера на стержне пипетки¹².

4. Удаление вестибулярного ганглия и покрытие вестибулярных нейронов

1. Подготовка к вскрытию
   1. Готовят ферментную смесь раствора L-15 с 0,05% коллагеназы и 0,25% трипсина. Например, добавьте в стакан 0,001 г коллагеназы и 0,005 г трипсина на 2 мл раствора L-15, добавьте небольшую магнитную мешалку и перемешайте до полного смешивания. Отложите при комнатной температуре.
   2. Подготовьте коммерческую гильотину, положив бумажные полотенца сбоку и под гильотину, чтобы свести к минимуму воздействие крови и других биологических материалов на столешницу и другие поверхности.
   3. Разложите большие ножницы из нержавеющей стали, большие щипцы и большие пружинные ножницы. Держите под рукой большую бутылку с 70% этанолом для мытья головы.
   4. Наполните стакан объемом 100 мл раствором L-15 и положите на лед. Насыщайте кислородом раствор L-15.
   5. Разложите пружинные ножницы, хирургические ножницы, щипцы, скальпель и пипетку для переноса (см. Таблицу материалов).
   6. Подготовьте чашку Петри диаметром 60 мм (для грубого рассечения) и две чашки Петри диаметром 35 мм (для очистки/тонкого рассечения ганглиесов). Наполните чашку диаметром 60 мм оксигенированным раствором L-15 с помощью шприца объемом 30 мл с фильтрующим наконечником 0,22 мкм.
2. Эвтаназия, чистка головы и гемисекция
   1. Взвесьте щенков, чтобы рассчитать подходящую дозировку разведения fatal-plus для внутрибрюшинного введения (~0,01 мл на 10 г).
   2. После того, как будет достигнута глубокая анестезия, что оценивается по отсутствию реакции на защемление пальца ноги, обезглавьте с помощью гильотины.
   3. Тщательно промойте голову 70% этиловым спиртом, а затем тщательно раствором L-15.
   4. Полностью удалить кожу с черепа. Разделите голову пополам с помощью больших пружинных ножниц, начиная с точки входа спинного мозга в головной мозг и делая два надреза, первый разрез через верхнюю часть черепа, а второй через нижнюю часть челюсти. Закончите разрезать голову пополам хирургическими ножницами.
   5. Поместите обе половины головного мозга стороной вниз в чашку Петри диаметром 60 мм, наполненную раствором L-15. Положите свежую ткань, которая в данный момент не препарируется, на лед.
3. Извлечение верхнего вестибулярного ганглия
   1. Вычерпайте мозг закрытыми хирургическими ножницами. Отрежьте и удалите черепно-мозговой нерв, чтобы полностью отделить мозг от черепа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент ушная капсула (по форме напоминающая цифру 8) должна быть видна на затылке.
   2. Используя щипцы, начиная с затылка, снимите прозрачный мембранный материал.
   3. Вырежьте верхнюю часть черепа хирургическими ножницами. Удалите лишнюю ткань с затылка и шеи, чтобы сделать область рассечения и капсулу ушной раковины более чистой и легкодоступной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не делайте блюдо слишком мутным, выбрасывая лишнюю ткань на протяжении всей процедуры.
   4. Перенесите ткань во вторую чашку Петри со свежим раствором L-15. Определите местоположение ушной капсулы и слухового, верхнего вестибулярного и нижнего вестибулярных нервов. Отрежьте слуховой нерв и отделите верхний и нижний ганглии с помощью маленьких пружинных ножниц.
      Примечание: Хотя соматы вестибулярного нерва обнаруживаются как в нижних (более тонких), так и в верхних (более толстых) ганглиях, клетки, извлеченные из верхнего ганглия, имеют лучшую выживаемость.
   5. С помощью скальпеля аккуратно сбривают костный гребень, чтобы ослабить костный участок, под которым нерв погружается в костную капсулу. Осторожно удалите мусор тонкими щипцами, обнажив всю опухшую часть ганглия.
   6. С помощью тонких пружинных ножниц разрежьте и отделите ганглий от периферической нервной ветви, которая идет к утрикуле.
   7. Удалите верхний ганглий с помощью тонких щипцов, стараясь не зажимать слишком близко к ганглионарной ткани. Переложите в чашку Петри диаметром 35 мм со свежим раствором L-15.
   8. Перед началом работы ферментный раствор подогреть: перелить ферментную смесь в чашку Петри диаметром 35 мм и поместить в инкубатор при температуре 37 °С на 10-15 мин.
   9. Очистите ганглий с помощью тонких щипцов и маленьких пружинных ножниц, удалив кость (которая выглядит белой и кристаллизованной по структуре), лишнюю ткань, нервные волокна и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани.
4. Диссоциация тканей и нанесение покрытий
   1. Очищенные ганглии переложить в предварительно подогретый раствор фермента и поместить обратно в инкубатор на 10-40 мин. Лечение ферментами завершается, как только ткань начинает распадаться, но остается целой. Чрезмерная обработка ткани ферментами приведет к полному растворению ганглиев перед трением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени, в течение которого ткань подвергается ферментативной обработке, зависит от возраста животного. Например, ганглии крыс Р9 обрабатывают ферментом в течение 25 мин, а ганглии крыс Р15 обрабатывают ферментом в течение 35 мин.
   2. Переложить ганглии в чашку Петри диаметром 35 мм со свежим раствором L-15 и инкубировать 2-3 мин.
   3. Переносят ганглии в другую чашку Петри диаметром 35 мм, заполненную отфильтрованной питательной средой.
   4. С помощью микропипетки объемом 200 мкл капните ~150 мкл отфильтрованной питательной среды на чашку со стеклянным дном, покрытую покрытием. Не добавляйте слишком много раствора, так как важно поддерживать поверхностное натяжение, чтобы образовался пузырь раствора, который остается над стеклянным покровным стеклом.
   5. Перенесите нужное количество ганглиев (от одного до четырех) на покровное стекло.
   6. Наберите небольшое количество питательной среды из чашки для культивирования, чтобы промыть пипетку для растирания средой, чтобы предотвратить прилипание ткани к стенкам стеклянной пипетки. Растирайте, осторожно и многократно пропуская ткань через пипетку до тех пор, пока ганглии не будут достаточно диссоциированы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не переусердствуйте с тканями, чтобы попытаться получить одноклеточную суспензию, и не позволяйте клеткам падать на дно чашки при чрезмерном положительном давлении. Кроме того, избегайте образования пузырьков воздуха, так как это снизит выживаемость клеток. Щадящее растирание является ключом к успешному выживанию клеток.
   7. Дайте клеткам отдохнуть в течение 5 минут. Проверьте под световым микроскопом, осели ли клетки на покровном стекле.
   8. Осторожно поместите чашку с культурой в инкубатор с температурой 37 °C на 12-24 ч. Опять же, убедитесь, что пузырь раствора не поврежден.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При культивировании более 24 часов ежедневно обновляйте питательные среды. Это может быть возможной точкой паузы.
5. Гальваническое покрытие SGN
   1. Выполните шаги 4.2.1 - 4.2.5 инструкций по вестибулярному ганглию, чтобы разделить голову пополам.
   2. Найдите ушную капсулу (по форме похожую на цифру 8) и извлеките ее из черепа, отколов края тупыми щипцами.
   3. Замените раствор L-15. В спиральной части ушной капсулы находится улитка с органом Корти. Откалывайте кость, лежащую над кохлеарными витками, не повреждая подлежащие ткани, тонкими щипцами, параллельными изгибу кости.
   4. После того, как будет удалено достаточное количество кости, чтобы полностью обнажить кохлеарные повороты, используйте маленькие пружинные ножницы, чтобы разрезать модиол (толстая, белая, волокнистая ткань, содержащая центральные аксоны SGN) у основания улитки, чтобы освободить ее от остальной части ушной капсулы.
   5. Удалите сосудистую полосу, защипнув ее у основания тонкими щипцами. Раскрутите спираль и поднимитесь к вершине, чтобы освободить ее от органа Корти.
   6. Разрежьте орган корти на два-три витка маленькими пружинными ножницами так, чтобы он лежал ровно.
   7. Удалите модиол с каждого оборота маленькими пружинными ножницами.
   8. Удалите спиральный ганглий, разрезав по краю, где волокна SGN выступают в сторону волосковых клеток.
   9. Очистите ганглий с помощью тонких щипцов, удалив кость (которая кажется белой и кристаллизованной по структуре), модиол (который выглядит белым и волокнистым) и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани.
   10. Следуйте той же процедуре, что и для ферментативной обработки спирального ганглия, используемой для вестибулярного ганглия в разделе 4.4. Ферментативное время, как правило, короче в спиральном ганглии, который более удлинен, чем вестибулярный ганглий. Используйте тритурационные пипетки меньшего диаметра для спирального ганглия по сравнению с вестибулярным ганглием.
   11. Растирают спиральный ганглий в питательной среде с добавлением N2 и B27, указанных в рецептуре питательных сред.
   12. Поместите чашку для культивирования, содержащую диссоциированные ганглии, в инкубатор с 5%_СО2 при температуре 37 °C на 12-24 ч.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.

5. Запись

ПРИМЕЧАНИЕ: При этой процедуре запись с помощью патч-зажима из изолированного ганглия обычно выполняется через 12-24 ч после нанесения покрытия. Другие лаборатории сообщили о результатах исследования нейронов после гораздо более длительных периодов в культуре¹⁰.

1. Подготовьте записывающую камеру
   1. Используйте быстросменную записывающую камеру (или аналогичную), которая позволяет записывать с помощью патч-клэмпа непосредственно в чашке для культивирования. Установите камеру на инвертированный микроскоп.
   2. Вставьте в камеру чашки для культур со стеклянным дном.
   3. Подайте раствор L-15 через систему перфузионных трубок в регистрирующую камеру. Стабилизируйте входящий и исходящий поток перфузии в камере со скоростью 0,5-1 мл в минуту.
2. Приготовьте внутренний раствор для загрузки электродов
   1. Разморозьте аликвоту перфорированного внутреннего раствора. Выделите 2,5 мл раствора на чашку для культуры диаметром 35 мм. Закройте чашку для культур крышкой и пометьте надписью «Tip Dip». Отложите в сторону, свободную от пыли, так как очень важно, чтобы этот раствор был как можно более чистым.
   2. Взвесьте 1 мг амфотерицина-В и добавьте 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Вихрь и вращайте раствор до тех пор, пока весь амфотерицин-В не окажется в растворе. Добавьте 10 мкл раствора ДМСО/амфотерицина-В к оставшимся 2 мл размороженного внутреннего раствора перфорированного пластыря. Удалите и рассейте раствор пипеткой два или три раза, чтобы убедиться, что ДМСО/амфотерицин-Б равномерно смешался с внутренним раствором. Раствор будет иметь слабо-желтоватый оттенок.
   3. Наберите внутренний раствор амфотерицина-В с перфорированным пластырем в шприц объемом 3 мл. Добавьте в шприц наконечник 34 г. Заверните шприц в алюминиевую фольгу и держите шприц на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор необходимо переваривать каждые 2 ч, чтобы обеспечить эффективность амфотерицина-B в перфорации клеточной мембраны. Амфотерицин-В чувствителен к свету, и его необходимо экранировать от света с помощью алюминиевой фольги или другими методами.
3. Запись с помощью патч-зажима
   1. Визуализируйте нейроны с помощью объектива 10x или 20x. Отрегулируйте освещение и оптимизируйте оптику, чтобы увидеть границы и тени вокруг ячейки.
   2. Проверьте качество изолированных нейронов. Пробуйте только нейроны с гладкими и ровными поверхностями, которые не слишком сильно контрастируют и имеют только небольшие, рассеянные кратеры. Кроме того, избегайте пар нейронов, нейронов, окруженных мусором, или других клеток.
   3. При 100-кратном увеличении определите нейрон или поле нейронов, которые нужно заплатить, и выровняйте их в центре поля зрения.
   4. Наполните кончик пипетки чистым раствором, не содержащим амфотерицина, окунув наконечник (на ~20 с) в чистый раствор, помещенный в чашку для культивирования. Капиллярное действие втягивает небольшое количество раствора в наконечник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг под стерео диссекционным микроскопом, который позволяет определить, насколько хорошо наконечник удерживает раствор Tip Dip. Если раствор не держится ~10-20 с, форма электрода не идеальна. В этом случае перенастройте программу вытягивания электрода, чтобы получить более длинный наконечник.
   5. Затем заполните заднюю часть пипетки внутренним раствором, содержащим амфотерицин. Нить накаливания внутри пипетки будет втягивать раствор вниз, чтобы встретиться с чистым раствором в наконечнике. Позвольте нити плавно потянуть раствор вниз и не пытайтесь выстукивать пузырьки, так как это приведет к слишком быстрому присоединению амфотерицина к кончику.
   6. С помощью шприца вычеркните раствор, который может находиться в самой задней части электрода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно работать быстро с этой точки, чтобы приземлиться и сформировать высокопрочное уплотнение на нужной ячейке.
   7. Вставьте пипетку в держатель дозатора. Убедитесь, что пипетка плотно прилегает к держателю, чтобы предотвратить скольжение пипетки. Если пипетка неустойчива, замените уплотнительные кольца спереди и сзади держателя дозатора, чтобы свести к минимуму дрейф и обеспечить сильное всасывание. Замените пипетку свежезаполненной.
   8. Опустите пипетку в ванну записывающей камеры.
   9. Расположите наконечник пипетки в центре поля зрения. Убедитесь, что на наконечнике нет пузырьков воздуха или другого мусора.
   10. Примените шаг напряжения (5 мВ) при испытании мембраны, чтобы контролировать сопротивление пипетки. Продолжайте контролировать входное сопротивление на протяжении всего процесса формирования уплотнения на ячейке.
   11. Погасите потенциал смещения пипетки таким образом, чтобы ток пипетки показывал ноль в режиме тестирования мембраны pClamp.
   12. Отрегулируйте емкость пипетки с помощью функции быстрой компенсации емкости на усилителе с патч-клеммами (быстрые наборы Cp на программной панели Multiclamp Commander).
   13. Переместите пипетку вниз в ячейку.
   14. Как только пипетка окажется достаточно близко к нейрону, переключитесь на объектив с большим увеличением и отправьте изображение через камеру на монитор (используйте 40-кратный объектив, общее 400-кратное увеличение). Отрегулируйте пипетку и отцентрируйте нейрон.
   15. Переместите регистрирующий электрод ближе к соме. Найдите центр нейрона на мониторе и расположите регистрирующий электрод над нейроном.
   16. Подойдите к нейрону сверху так, чтобы электрод приземлился в центр сферической ячейки. Отрегулируйте смещение пипетки до нуля постоянных потенциалов постоянного тока в системе.
   17. Расположите пипетку близко к мембране. Приземляйтесь плотно по центру клетки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При приземлении произойдет небольшое углубление на поверхности нейрона и удвоение/утроение входного сопротивления.
   18. Применяют отрицательное давление (всасывание) с помощью шприца или ротовой пипетки. Включите удерживающий потенциал -60 мВ. Сопротивление уплотнения должно увеличиваться до тех пор, пока оно не пройдет гигаом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы сократить время между заполнением электрода и посадкой на ячейку. Существует ограниченное время, прежде чем амфотерицин, добавленный во внутренний раствор перфорированного пластыря на этапе 5.3.5, достигнет кончика электрода. После того, как наконечник загрязнен амфотерицином, трудно сформировать высокопрочные уплотнения, и сопротивление часто выходит на плато до ~200 мегаом.
   19. Как только образуется гигаомное уплотнение, сбросьте отрицательное давление. Как только сформируется уплотнение, примените быструю компенсацию емкости, чтобы максимально уменьшить амплитуду переходных процессов емкости пипетки в режиме мембранного теста.
   20. Когда амфотерицин начинает действовать, наблюдайте, как входное сопротивление медленно уменьшается, а ток, протекающий в ответ на шаг напряжения 5 мВ, постепенно увеличивается по мере того, как амфотерицин входит в мембрану. Внезапное снижение последовательного сопротивления вместо постепенной стабилизации говорит о том, что произошел спонтанный разрыв.
   21. Оцените емкость всей ячейки и последовательное сопротивление с помощью функции обнуления емкостных переходных процессов усилителя. Документируйте и контролируйте последовательное сопротивление в начале и во время эксперимента.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизация последовательного сопротивления может занять от 5 до 20 минут, в зависимости от размера электрода и количества чистого раствора, втягиваемого в пипетку. Режимы «напряжение-клещи» и «токоизмерительные клещи» можно использовать, как только последовательное сопротивление стабилизируется ниже 30 МОм. Иногда наблюдается набухание или сжатие нейронов во время записи, но редко при правильной настройке осмолярности и рН растворов.

Результаты

Запуск протоколов напряжения-подавления с применением семейств ступеней напряжения выявляет зависимую от напряжения активацию множества различных семейств токов. Репрезентативные примеры токов всей ячейки, вызванных VGN и адаптированных из опубликованных записей¹³, пока...

Обсуждение

Методы, представленные здесь, специфичны для записей изолированных нейронов; Предыдущие исследования были сосредоточены на записях с окончаний аксонов в полуинтактном препарате. По сравнению с существующими методами терминальной записи, изолированные записи обеспечивают превосход?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	For perforated patch recordings.
ATP di-sodium	Sigma-Aldrich	A7699	Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044	additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge	USA Scientific	2641-0016
Bunsen burner
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	Additive to internal solution
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5318	one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40	Warner Instruments	64-0707
DMSO	Biotium	90082
Dnase I,from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	11284932001	one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt)	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11255-20
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Additive to internal solution
Electrode Puller	Narashige	PC-10
Epi-illumination light source	Zeiss	CL 1500 ECO
Ethanol	Decon Labs	2716	for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes	Sutter Instruments	BF140-117-10
Fine-edged dissection blade	Fine Science Tools	10010-00
Glass Pasteur Pipettes	VWR	14673-010	to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16140063	additive to culture medium
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers	VWR	76549-914
Insulated bucket filled with ice			to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additive to internal solution
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	Additive to internal solution
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors	Fine Science Tools	14133-13
Leibovitz medium	Sigma Aldrich	L4386	dissection and bath solutions
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes	Warner Instruments	64-0236
luer-lok syringes, 30 ml	BD	302832	for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement	Fisher Scientific	41-090-101	base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M1028	Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge	World Precision Instruments	MF34G
Microforge	Narashige	MF-90	For electrode polishing.
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502-048	additiive to culture medium, for SGN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Additive to internal solution
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	for titration pH
Osmometer	Advanced Instruments Inc.	3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing	USC Material Management	MEDOX200 (Identifier: 00015)	for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm	Bemis	PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml)	Fisher Scientific	03-448-25	bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)	MWI Animal Health	15199	for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer	Nalgene	566-0020	for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm	Genessee Scientific	32-103	for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm	Midland Scientific	P7455	for gross dissection
pH Meter	Mettler Toledo	Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter	USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish	Mattek	P35GC-0-10-C	to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes	Warner Instruments	64-0375
Reference Cell	World Precision Instruments	RC1T
Scalpel blade	Miltex	4-315
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
Scientific Scale	Mettler Toledo	XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter	Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)	Warner Instruments	64-0378
Small Animal Guillotine	Kent Scientific	DCAP
Small animal guillotine	Kent Scientific	DCAP	for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Straight surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin	Sigma Aldrich	T1426	one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe	Covidien	8881500105	for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex	VWR	945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)	Millipore-Sigma	CDUFBI001