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요약

여기에 제시된 방법은 내이의 전정 신경절 및 나선형 신경절 뉴런에서 해부, 해리, 배양 및 패치 클램프 기록에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

초록

분리되고 배양된 내이 신경절 뉴런의 조밀한 형태는 이 집단의 세포 다양성에 기여하는 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체의 상세한 특성을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 패치 클램프 기록을 위해 내이 양극성 뉴런의 소마타를 성공적으로 해부, 해리 및 단기 배양하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다. 전정신경절 뉴런을 준비하기 위한 자세한 지침은 나선형 신경절 뉴런을 도금하는 데 필요한 수정과 함께 제공됩니다. 이 프로토콜에는 천공 패치 구성에서 전체 셀 패치 클램프 기록을 수행하기 위한 지침이 포함되어 있습니다. 과분극 활성화 순환 뉴클레오티드 개폐(HCN) 매개 전류의 전압 클램프 기록을 특성화하는 예제 결과는 보다 표준적인 파열 패치 구성과 비교하여 천공 패치 기록 구성의 안정성을 강조합니다. 이러한 방법의 조합인 분리된 소마타와 천공된 패치 클램프 기록은 길고 안정적인 기록과 G-단백질 결합 수용체를 통한 신호 전달과 같은 세포 내 환경의 보존이 필요한 세포 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

전정 신경의 양극성 뉴런은 내이의 감각 유모 세포를 뇌간에 연결합니다. 그들은 소리와 머리 움직임에 대한 정보의 주요 운반자입니다. 이러한 중요한 세포가 손상되면 난청과 균형 장애가 발생합니다. 신경의 전정 및 청각 부분은 각각 형태학적으로나 기능적으로 다양한 뚜렷한 세포 유형으로 구성되어 있습니다 1,2. 전정계(vestibular system)에서는 두 개의 구심성 하위집단(afferent subpopulation)이 규칙적이거나 불규칙한 간격으로 자발적으로 발화한다2. 구심성 스파이크 타이밍은 이온 채널 조성 3,4의 근본적인 다양성을 반영하는 것으로 생각됩니다. 청각 시스템에는 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 두 가지 주요 하위 집단이 있습니다. 반면, I형 SGN은 개별적인 내모세포5와 접촉하는 반면, II형 SGN은 다수의 외유모세포5와 접촉한다. 반원형 및 유기형 배양에서 얻은 시험관 내 기록은 유형 I 및 유형 II SGN의 막 특성의 차이를 시사합니다 6,7.

이러한 뉴런의 말단에서 발견되는 많은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체는 세포체에서도 발견됩니다. 따라서 고립된 전정 및 나선형 신경절 소마타의 배양은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체가 이러한 뉴런의 반응에 어떻게 기여하는지 이해하기 위해 시험관 내에서 연구할 수 있습니다. 분리된 세포체의 조밀한 형태는 고품질 전기 기록이 가능하며, 전압 개폐 이온 채널 및 신경 전달 물질 수용체의 상세한 특성 분석에 적합합니다. 대표적인 다양한 뉴런 아형에 쉽게 접근할 수 있어 세포 다양성에 대한 고처리량 분석이 가능합니다.

이 논문은 출생 후 (P)9에서 P20까지 쥐의 전정 신경절의 상부에서 해리된 신경절 세포체를 분리하고 배양하는 방법을 제시합니다. 또한 이러한 방법을 나선형 신경절로 확장하기 위한 제안과 함께 신경절 세포를 성공적으로 추출, 해리 및 도금하는 데 필요한 단계가 제공됩니다. 이러한 방법은 다양한 실험실 8,9,10의 간행물에서 고안된 방법의 진화입니다. 또한 이 문서에는 패치 클램프 기록을 위한 건강한 세포를 선택하기 위한 지침이 포함되어 있습니다.

마지막으로, 프로토콜은 천공-패치 구성(perforated-patch configuration)(11)을 이용한 패치-클램프 기록에 대한 절차를 개략적으로 설명한다. 천공 패치 구성은 일반적인 파열 패치 구성보다 시간이 많이 걸리고 기술적으로 더 까다롭지만 길고 안정적인 기록 세션을 허용하는 세포질 환경을 유지하는 데 더 좋습니다. 이 기록 구성의 이점은 파열 패치 기록에 비해 천공 패치에서 과분극 활성화 양이온 전류의 향상된 안정성을 통해 설명됩니다.

이 프로토콜은 5개의 섹션으로 구성되어 있습니다. 섹션 1-3에서는 미리 준비하고 저장할 수 있는 솔루션과 도구에 대해 설명합니다. 섹션 4는 전정 및 SGN을 해부하고 도금하는 단계를 설명합니다. 섹션 5는 배양 기간 후 뉴런에서 기록하는 단계를 설명합니다. 우리 손에서 섹션 4와 섹션 5는 연속 2 일 동안 수행됩니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 사용은 University of Southern California의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜의 동물은 Charles River Laboratories에서 얻은 남녀 모두의 P3 내지 P25 연령의 Long Evans 쥐이지만, 이러한 방법은 다른 설치류 균주에 적용될 수 있습니다. 모든 절차 중에 실험실 가운과 장갑을 착용해야 하며 용액을 만들 때는 물 튀김 방지 고글을 착용해야 합니다.

1. 준비

알림: 이 섹션에 설명된 솔루션과 도구는 해부 및 기록 당일에 사용할 수 있도록 미리 만들 수 있습니다.

  1. 10mM HEPES(L-15 용액)가 보충된 Liebovitz 배지를 준비합니다. 다음 단계는 1L의 L-15 용액을 만드는 방법을 설명합니다.
    1. 990mL의 탈이온화된 H2O를 하나의 비커에 붓습니다. 2.386g(10mM)의 HEPES를 측정하고 추가합니다. L-15 용액 분말 1L 한 병을 추가합니다.
      알림: 분말 L-15는 유통 기한이 길고 저장 공간을 덜 차지합니다. 또는 L-15 용액을 구입하고 HEPES를 보충하십시오. 후자의 옵션에는 형광 이미징에 유용한 페놀 프리 용액을 사용할 수 있는 옵션도 있습니다.
    2. 교반 접시에 용액을 저어줍니다. pH 측정기를 사용하여 1N 수산화나트륨(NaOH)을 천천히 첨가하여 7.34에서 7.36 사이의 pH를 얻습니다.
    3. 용액이 1,000mL의 부피에 도달할 때까지 탈이온화된 H2O를 첨가합니다. 0.22μm 공극 크기의 멤브레인을 사용하여 용액을 여과합니다.
      참고: L-15 용액은 4°C에서 약 1-2주 동안 보관할 수 있습니다. 페놀-레드로 만든 L-15를 사용하는 경우 용액이 너무 염기성(pH > 7.4)이면 분홍색으로 변하고 너무 산성이면 주황색(pH < 7.34)으로 변합니다.
  2. 전정신경절 뉴런(VGN)에 대한 배양 배지를 준비합니다(SGN에 대한 변형 포함). 아래 단계에 따라 50mL의 배양 배지를 만드십시오.
    1. 깨끗한 유리 비커에 GluMAX-I 최소 필수 배지 47.5mL를 추가합니다.
    2. 0.1194g(10mM)의 HEPES를 측정하고 추가합니다. 이 추가 완충액은 세포가 인큐베이터로 이동하기 전에 안정되는 동안 pH 변화에 저항합니다.
    3. 소 태아 혈청(FBS) 2.5mL를 추가합니다. 이것은 50mL의 배지 총 부피에서 5 부피 기준 FBS를 만듭니다. SGN 제제의 경우 FBS 2.5mL를 N2 0.5mL 및 B27 용액 1mL로 대체합니다.
    4. 교반 접시에 용액을 저어줍니다. pH 측정기를 사용하여 1N NaOH를 천천히 첨가하여 7.38에서 7.4 사이의 pH를 얻습니다.
    5. 페니실린-스트렙토마이신 0.5mL를 추가합니다. 0.22μm 제균 필터를 통해 용액을 여과합니다. 용액을 4°C에서 보관합니다.
    6. 사용하기 최소 30분 전에 배양 배지를 통풍 캡이 있는 조직 배양 플라스크에 옮깁니다. 배양 배지가 있는 플라스크를 37°C에서 5%CO2 농도의 인큐베이터에 넣습니다.
  3. 구멍이 뚫린 패치 내부 용액을 준비합니다
    참고: 여기서는 100mL의 천공 패치 내부 용액이 전체 세포 기록에 사용됩니다(레시피는 표 1에 요약되어 있음). 이러한 용액은 미리 준비하여 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 분취액은 동결 및 해동을 반복하지 않는 경우 -20°C에서 무기한 보관할 수 있습니다.
    1. 최대 6개월 전에 1 M KCl, 0.5 M Mg2Cl(헥사하이드레이트) 및 0.5 M CaCl2 의 스톡 용액을 만들고 보관하십시오. 밀폐된 병에 담아 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
      알림: 원액의 삼투압(1M KCl 원액의 경우 2,000mOsm, Mg2Cl및 CaCl2 용액의 경우 1,500mOsm)을 확인하여 목표 농도에 도달했는지 확인하는 것이 좋습니다. 용액이 탁해지거나 침전된 경우에는 사용하지 마십시오. 이는 가능한 일시 중지 지점이 될 수 있습니다.
  4. 내부 솔루션 제작 당일에는 1.3단계의 스톡 솔루션을 사용하여 아래 단계를 따르십시오.
    1. 100mL의 milli-Q (MQ)H2O를 측정합니다. 100mL에서 40mL를 꺼내 깨끗한 비커에 따로 보관합니다.
    2. 나머지 60mL의H2O를 깨끗하고 멸균된 100mL 비커에 넣습니다. 1 M KCl 2.5 mL, 0.5 M Mg2Cl-헥사하이드레이트 1 mL, 0.5 M CaCl2 0.02 mL 첨가.
    3. 교반 막대를 추가하고 비커를 교반 접시에 놓습니다. 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 1.307g의K2SO4를 추가합니다. K2SO4가 녹을 때까지 저어줍니다.
    4. 0.1192g의 HEPES(100mL 최종 부피에서 목표 5mM)를 칭량하고 용액에 추가합니다. 녹을 때까지 저어줍니다.
      알림: K2SO4 가 용해되는 데 시간이 걸리는 경우가 있으므로 모든 구성 요소가 완전히 용해되었는지 확인하십시오.
    5. 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 0.1902g을 칭량하고(100mL 최종 부피에서 목표 5mM) 용액에 첨가합니다. EGTA는 산성 용액에 완전히 용해되지 않으므로 비커를 교반 플레이트에 놓고 pH 프로브를 삽입합니다.
    6. 교반하면서 EGTA가 완전히 용해될 때까지 1M KOH를 천천히 적정합니다. pH가 6에서 7 사이일 때 발생할 것으로 예상합니다. 최종 pH가 7.35(총 약 1.2 - 1.3mL의 KOH)가 될 때까지 KOH를 천천히 계속 첨가합니다.
    7. MQH2O를 첨가하여 용액을 최종 부피 100mL로 만들고 저어줍니다. 삼투압계로 용액의 삼투압(천공 패치 용액의 경우 목표 270mOsm/kg)을 확인합니다.
    8. 0.22μm 제균 필터를 사용하여 천공 패치 내부 용액을 여과합니다. -20°C에서 5mL 부분 표본으로 보관합니다. 각각의 새로운 기록 세션에 대해 새로운 부분 표본을 사용하십시오.
      참고: 이것은 가능한 일시 중지 지점일 수 있습니다.

2. 분쇄 피펫 제작

참고: 분쇄 피펫은 여러 실험에 재사용할 수 있습니다. 매번 사용하기 전에 피펫을 에탄올, 물 및 L-15 용액으로 세척하고 사용 후에는 물과 에탄올로 세척하십시오. 사용 사이에 조심스럽게 보관하십시오.

  1. 세포 해리를 위한 분쇄 피펫을 준비하려면 유리 파스퇴르 피펫을 분젠 버너의 불꽃에 갖다 댑니다. 유리 팁이 녹기 시작하면 유리를 원하는 팁 직경으로 늘립니다. 피펫의 한쪽 끝을 화염에서 당겨 약간 구부립니다.
  2. 구부러진 피펫을 현미경 가까이로 가져옵니다. 점수 타일을 사용하여 원하는 직경으로 유리에 점수를 매기고 깨뜨립니다.
  3. 피펫 끝을 Bunsen 버너 불꽃 위에 통과시킵니다. 이렇게 하면 팁 근처의 거친 가장자리가 빠르게 연마됩니다. 팁이 화염에 의해 밀봉되지 않았는지 확인하십시오.
  4. 다양한 크기의 피펫 4개 또는 5개가 준비될 때까지 이 과정을 반복합니다.

3. 패치 피펫 제작

알림: 녹음 세션 전에 패치 피펫 세트를 준비하지만 신경절 절개 및 배양 후에 준비하십시오. 녹음 세션 중에 한 번에 하나씩 만들어지는 전극이 성능면에서 최적이지만, 전날 밤에 배치로 만들 때 합리적인 성공을 거두었습니다. 팁을 먼지로부터 보호하기 위해 피펫을 덮인 유리 용기에 보관하십시오.

  1. 수직 전극 풀러와 1.5mm 외경/1.17mm 내경 필라멘트 붕규산 유리 피펫을 사용합니다. 유리에 항상 먼지와 지문이 묻지 않도록 하십시오.
  2. 제조업체에서 패치 피펫에 권장하는 대로 2단계 프로그램을 사용하여 8-10개의 기록 피펫을 당깁니다.
  3. 마이크로포지(microforge)로 모든 기록 피펫 팁을 검사하고 열 연마합니다. 열 연마는 더 나은 밀봉을 촉진합니다. 목표 피펫 저항은 4 - 8 MΩ입니다.
  4. 광택이 나는 피펫을 뚜껑이 있는 용기에 보관하십시오. 이는 실험에서 일시 중지 지점으로 처리될 수 있습니다.
    참고: 목표 저항 범위에 도달하기 위해 피펫 직경을 최적화하려면 3.2 및 3.3 단계에서 약간의 시행착오가 필요합니다. 대부분의 상용 패치 클램프 시스템에는 수조 용액의 전극 저항을 측정하기 위한 멤브레인 테스트 기능이 내장되어 있습니다. 저항은 적용된 5mV 스텝 자극에 대한 응답으로 정상 상태 출력 전류의 비율로 계산됩니다. 3.1단계의 당김 설정과 3.2단계의 연마는 시험용 피펫의 저항이 4-8MΩ 범위 내로 떨어질 때까지 시험용 피펫을 사용하여 먼저 조정해야 합니다.
  5. 기록 당일에는 피펫 커패시턴스와 기록 소음을 줄이기 위해 피펫 팁을 코팅합니다. 이렇게하려면 피펫 샤프트에 작은 파라핀 필름 스트립을 감쌉니다. 끝까지 감쌀 필요는 없습니다.
    알림: 다른 전략은 피펫12의 샤프트에 실리콘 엘라스토머를 코팅하고 가열하는 것입니다.

4. 전정신경절의 적출 및 전정 뉴런의 도금

  1. 해부 준비
    1. 0.05% 콜라겐분해효소와 0.25% 트립신이 함유된 L-15 용액의 효소 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, 0.001g의 콜라겐분해효소와 0.005g의 트립신을 2mL의 L-15 용액에 넣고 작은 자석 교반기를 넣고 완전히 섞일 때까지 저어줍니다. 실온에 보관하십시오.
    2. 단두대 측면과 아래에 종이 타월을 놓아 상업적으로 얻은 단두대를 준비하여 벤치탑 및 기타 표면이 혈액 및 기타 생물학적 물질에 노출되는 것을 최소화합니다.
    3. 큰 스테인리스 스틸 가위, 큰 집게 및 큰 스프링 가위를 배치하십시오. 머리 청소를 위해 70% 에탄올이 든 큰 스프레이 병을 가까이에 두십시오.
    4. 100mL 비커에 L-15 용액을 채우고 얼음 위에 놓습니다. L-15 용액에 산소를 공급하십시오.
    5. 스프링 가위, 수술용 가위, 집게, 메스 및 전사 피펫을 배치합니다( 재료 표 참조).
    6. 60mm 페트리 접시(총 해부용)와 35mm 페트리 접시 2개(신경절 세척/미세 해부용)를 준비합니다. 0.22μm 필터 팁이 있는 30mL 주사기를 사용하여 60mm 접시에 산소가 함유된 L-15 용액을 채웁니다.
  2. 안락사, 머리 청소, 반절부
    1. 복강내로 투여할 치명적 희석액의 적절한 복용량을 계산하기 위해 새끼의 무게를 잰다(10g당 ~0.01mL).
    2. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 평가되는 깊은 마취 상태에 도달하면 단두대를 사용하여 목을 베십시오.
    3. 70% 에탄올로 머리를 철저히 헹군 다음 L-15 용액으로 완전히 헹굽니다.
    4. 두개골에서 피부를 완전히 제거합니다. 큰 스프링 가위를 사용하여 척수의 뇌 진입 지점에서 시작하여 머리를 두 번 자르는데, 첫 번째는 두개골 상단을 관통하고 두 번째는 턱 하단을 절개합니다. 수술용 가위를 사용하여 머리를 이등분합니다.
    5. 머리의 양쪽 반쪽을 아래로 향하게 하여 L-15 용액을 채운 60mm 페트리 접시에 넣습니다. 현재 해부되지 않은 신선한 조직을 얼음 위에 놓습니다.
  3. 상전정신경절 추출
    1. 닫힌 수술용 가위를 사용하여 뇌를 퍼냅니다. 뇌신경을 절단하고 제거하여 두개골에서 뇌를 완전히 분리합니다.
      알림: 이 시점에서 귀 캡슐(숫자 8 모양)이 머리 뒤쪽에 보여야 합니다.
    2. 집게를 사용하여 머리 뒤쪽에서 시작하여 투명한 막질 물질을 잡아당깁니다.
    3. 수술용 가위를 사용하여 두개골 상단을 잘라냅니다. 머리와 목 뒤쪽의 여분의 조직을 제거하여 해부 부위와 귀 캡슐을 더 깨끗하고 접근하기 쉽게 만듭니다.
      알림: 절차 내내 여분의 조직을 버려 접시를 너무 흐리게 만들지 마십시오.
    4. 조직을 신선한 L-15 용액이 있는 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 귀 캡슐과 청각, 상전정 및 하부 전정 신경을 찾습니다. 청각 신경을 잘라내고 작은 스프링 가위로 상신경절과 하신경절을 분리합니다.
      참고: 전정 신경의 소마타는 하부(얇은) 신경절과 상부(두꺼운) 신경절 모두에서 발견되지만 상신경절에서 추출한 세포는 생존율이 더 높습니다.
    5. 메스를 사용하여 뼈 융기를 부드럽게 깎아 뼈 부위를 약화시키면 그 아래에서 신경이 뼈 캡슐로 잠수합니다. 미세한 집게로 조심스럽게 부스러기를 제거하여 신경절의 부풀어 오른 부분 전체를 노출시킵니다.
    6. 가는 스프링 가위를 사용하여 요실을 향해 잠수하는 말초 신경 가지에서 신경절을 자르고 분리합니다.
    7. 미세한 집게를 사용하여 신경절을 제거하고 신경절 조직에 너무 가까이 끼이지 않도록 합니다. 신선한 L-35 용액과 함께 15mm 페트리 접시로 옮깁니다.
    8. 계속하기 전에 효소 용액을 예열하십시오 : 효소 혼합물을 35mm 페트리 접시에 붓고 37 ° C 인큐베이터에 10-15 분 동안 놓습니다.
    9. 미세한 집게와 작은 스프링 가위를 사용하여 뼈(하얗고 구조가 결정화되어 있음), 과도한 조직, 신경 섬유 및 기타 불필요한 구조를 제거하여 신경절을 청소합니다. 신경절 조직의 제거를 최소화하도록 주의하십시오.
  4. 조직 해리 및 도금
    1. 세척된 신경절을 예열된 효소 용액에 옮기고 10-40분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 효소 치료는 조직이 분해되기 시작하지만 한 조각으로 남으면 완료됩니다. 효소로 조직을 과잉 처리하면 삼중 전에 신경절이 완전히 용해됩니다.
      참고: 조직이 효소 치료를 받는 시간은 동물의 나이에 따라 다릅니다. 예를 들어, P9 쥐의 신경절은 25분 동안 효소로 처리되고, P15 쥐의 신경절은 35분 동안 효소로 처리됩니다.
    2. 신경절을 신선한 L-15 용액과 함께 35mm 페트리 접시로 옮기고 2-3분 동안 배양합니다.
    3. 신경절을 여과된 배양 배지로 채워진 다른 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.
    4. 200 μL 마이크로피펫을 사용하여 ~150 μL 방울의 여과된 배양 배지를 코팅된 유리 바닥 접시에 피펫팅합니다. 유리 커버슬립 위에 남아 있는 용액 기포를 형성하기 위해 표면 장력을 유지하는 것이 중요하므로 용액을 너무 많이 추가하지 마십시오.
    5. 원하는 수의 신경절(1-4개)을 커버슬립에 옮깁니다.
    6. 배양 접시에서 소량의 배양 배지를 꺼내 분쇄 피펫을 배지로 헹구어 조직이 유리 피펫의 측면에 달라붙는 것을 방지합니다. 신경절이 충분히 해리될 때까지 피펫을 통해 조직을 부드럽고 반복적으로 통과시켜 삼중 작용합니다.
      알림: 단일 세포 현탁액을 시도하기 위해 조직을 과도하게 사용하거나 과도한 양압을 사용하여 세포가 접시 바닥으로 충돌하도록 하지 마십시오. 또한 기포를 형성하면 세포 생존이 감소하므로 피하십시오. 부드러운 분쇄는 성공적인 세포 생존을 달성하는 열쇠입니다.
    7. 세포를 5분 동안 그대로 둡니다. 광학 현미경으로 세포가 커버슬립에 가라앉았는지 확인합니다.
    8. 배양 접시를 37°C 인큐베이터에 12-24시간 동안 조심스럽게 넣습니다. 다시 말하지만, 용액 거품을 그대로 유지하십시오.
      알림: 24시간 이상 배양할 때는 매일 배양 배지를 새로 고치십시오. 이는 가능한 일시 중지 지점이 될 수 있습니다.
  5. SGN 도금
    1. 전정 신경절 지침의 4.2.1-4.2.5단계에 따라 머리를 이등분합니다.
    2. 귀 캡슐(숫자 8 모양)을 찾아 뭉툭한 집게로 가장자리를 깎아 두개골에서 추출합니다.
    3. L-15 용액을 변경하십시오. 귀 캡슐의 나선형 부분에는 코르티 기관이 있는 달팽이관이 있습니다. 미세한 집게가 뼈의 곡선과 평행을 이루는 미세한 집게를 사용하여 밑에 있는 조직을 손상시키지 않고 달팽이관 회전 위에 있는 뼈를 깎아냅니다.
    4. 달팽이관 회전의 전체 범위를 드러낼 수 있을 만큼 충분한 뼈가 제거되면 작은 스프링 가위를 사용하여 달팽이관 기저부에 있는 모디올러스(SGN의 중앙 축삭돌기를 포함하는 두껍고 흰색의 섬유질 조직)를 절단하여 달팽이관의 나머지 부분에서 분리합니다.
    5. 미세한 집게로 밑부분의 줄무늬를 꼬집어 선조체 혈관을 제거합니다. 나선형과 정점 주위로 긴장을 풀어 코르티 기관에서 벗겨냅니다.
    6. 코르티의 오르간을 작은 스프링 가위를 사용하여 두세 바퀴로 잘라 평평하게 놓습니다.
    7. 작은 봄 가위로 각 턴에서 modiolus를 절제하십시오.
    8. SGN 섬유관이 유모 세포를 향해 돌출된 부분의 가장자리를 절단하여 나선형 신경절을 제거합니다.
    9. 미세한 집게를 사용하여 뼈(하얗고 구조가 결정화되어 있음), modiolus(흰색이고 섬유질로 보임) 및 기타 불필요한 구조를 제거하여 신경절을 청소합니다. 신경절 조직의 제거를 최소화하도록 주의하십시오.
    10. 섹션 4.4의 전정 신경절에 사용된 나선형 신경절을 효소로 치료하는 것과 동일한 절차를 따르십시오. 효소 시간은 일반적으로 전정 신경절보다 더 긴 나선형 신경절에서 더 짧습니다. 전정 신경절에 비해 나선형 신경절에 더 작은 직경의 trituration 피펫을 사용하십시오.
    11. 배양 배지 레시피에 표시된 N2 및 B27이 보충된 배양 배지에서 나선형 신경절을 삼각화합니다.
    12. 해리된 신경절이 포함된 배양 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 12-24시간 동안 놓습니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

5. 녹음

참고: 이 절차에서 분리된 신경절의 패치 클램프 기록은 일반적으로 도금 후 12-24시간 후에 수행됩니다. 다른 실험실에서는 배양에서 훨씬 더 오랜 기간 동안 신경 세포의 결과를 보고했습니다10.

  1. 녹음실 준비
    1. 패치 클램프 기록이 가능한 퀵 교환 기록 챔버(또는 이와 동등한 것)를 배양 접시에서 직접 사용할 수 있습니다. 도립 현미경에 챔버를 설정합니다.
    2. 유리 바닥 배양 접시를 챔버에 삽입합니다.
    3. 관류 튜브 시스템을 통해 L-15 용액을 기록 챔버에 공급합니다. 분당 0.5-1mL의 속도로 챔버 내 관류 유입 및 유출을 안정화합니다.
  2. 전극을 로드하기 위한 내부 용액 준비
    1. 구멍이 뚫린 패치 내부 용액의 부분 표본을 해동합니다. 용액 2.5mL를 35mm 배양 접시에 할당합니다. 배양 접시의 뚜껑을 교체하고 "Tip Dip"으로 라벨을 붙입니다. 이 용액을 가능한 한 깨끗하게 유지하는 것이 매우 중요하므로 먼지가 없는 구역에 따로 보관하십시오.
    2. 암포테리신-B 1mg의 무게를 측정하고 디메틸설폭사이드(DMSO) 20μL를 추가합니다. 모든 암포테리신-B가 용액에 포함될 때까지 용액을 소용돌이치고 회전시킵니다. DMSO/amphotericin-B 용액 10μL를 해동된 천공 패치 내부 용액의 나머지 2mL에 추가합니다. DMSO/amphotericin-B가 내부 용액에 균일하게 혼합되도록 피펫으로 용액을 빼내고 두세 번 제거합니다. 용액은 온화한 노란색을 띱니다.
    3. 암포테리신-B 천공 패치 내부 용액을 3mL 주사기에 넣습니다. 주사기에 34G 팁을 추가합니다. 주사기를 알루미늄 호일로 싸서 주사기를 얼음 위에 두십시오.
      참고: 이 용액은 세포막 천공에 대한 암포테리신-B의 효과를 보장하기 위해 2시간마다 다시 만들어야 합니다. 암포테리신-B는 빛에 민감하므로 알루미늄 호일이나 다른 방법을 사용하여 빛으로부터 차폐해야 합니다.
  3. 패치 클램프 기록
    1. 10x 또는 20x 대물렌즈를 사용하여 뉴런을 시각화합니다. 조명을 조정하고 광학 장치를 최적화하여 셀 주변의 경계와 그림자를 확인합니다.
    2. 분리된 뉴런의 품질을 확인합니다. 너무 강하게 대비되지 않고 작고 분산된 분화구만 있는 매끄럽고 균일한 표면을 가진 뉴런만 시도하십시오. 또한 한 쌍의 뉴런, 파편으로 둘러싸인 뉴런 또는 기타 세포를 피해야 합니다.
    3. 100x 배율에서 뉴런 또는 뉴런 필드를 식별하여 패치하고 시야 중앙에 정렬합니다.
    4. 팁을 배양 접시에 넣은 깨끗한 용액에 담가 암포테리신이 포함되지 않은 깨끗한 용액으로 피펫 팁을 채웁니다(~20초 동안). 모세관 작용은 팁에 소량의 용액을 끌어들입니다.
      알림: 스테레오 해부 현미경 아래에서 이 단계를 수행하면 팁이 Tip Dip 용액을 얼마나 잘 고정하는지 확인할 수 있습니다. 용액이 ~ 10-20 초 동안 유지되지 않으면 전극의 모양이 이상적이지 않습니다. 이 경우 더 긴 팁을 생성하도록 전극 당김 프로그램을 재구성하십시오.
    5. 다음으로, 피펫 뒷면에 암포테리신이 함유된 내부 용액을 채웁니다. 피펫 내의 필라멘트는 팁의 깨끗한 용액을 만나기 위해 용액을 아래로 끌어냅니다. 필라멘트가 용액을 부드럽게 아래로 당기도록 하고 암포테리신을 팁에 너무 빨리 밀어 넣을 수 있으므로 기포를 두드리지 마십시오.
    6. 주사기를 사용하여 전극 맨 뒤에 있을 수 있는 용액을 빼냅니다.
      알림: 이 지점에서 빠르게 작업하여 원하는 셀에 고저항 밀봉을 형성하는 것이 매우 중요합니다.
    7. 피펫을 피펫 홀더에 삽입합니다. 피펫 비산을 방지하기 위해 피펫이 홀더에 꼭 맞는지 확인하십시오. 피펫이 안정적이지 않은 경우 피펫 홀더의 앞면과 뒷면에 있는 밀봉 O-링을 교체하여 드리프트를 최소화하고 강력한 흡입력을 유지하십시오. 피펫을 갓 채워진 것으로 교체하십시오.
    8. 피펫을 기록 챔버의 욕조로 내립니다.
    9. 시야 중앙에서 피펫 팁을 찾습니다. 팁에 기포나 기타 이물질이 없는지 확인하십시오.
    10. 멤브레인 테스트에서 전압 단계(5mV)를 적용하여 피펫 저항을 모니터링합니다. 셀에 씰을 형성하는 전체 프로세스를 통해 입력 저항을 계속 모니터링합니다.
    11. 피펫 오프셋 전위를 취소하여 피펫 전류가 pClamp의 멤브레인 테스트 모드에서 0을 읽도록 합니다.
    12. 패치 클램프 증폭기의 빠른 커패시턴스 보상 기능을 사용하여 파이펫 커패시턴스를 보정합니다(Multiclamp Commander 소프트 패널의 Cp 고속 다이얼).
    13. 피펫을 셀로 이동합니다.
    14. 피펫이 뉴런에 충분히 가까워지면 더 높은 배율의 대물렌즈로 전환하고 카메라를 통해 이미지를 모니터로 보냅니다(40x 대물렌즈 사용, 총 400x 배율). 피펫을 조정하고 뉴런을 다시 중심에 맞춥니다.
    15. 기록 전극을 소마 가까이로 이동합니다. 모니터에서 뉴런의 중심을 찾고 기록 전극을 뉴런 위에 놓습니다.
    16. 전극이 구형 셀의 중앙에 닿도록 위에서 뉴런에 접근합니다. 피펫 오프셋을 시스템의 일정한 DC 전위를 0으로 조정합니다.
    17. 피펫을 멤브레인 가까이에 놓습니다. 셀 중앙에 단단히 착지합니다.
      알림: 착지할 때 뉴런 표면에 작은 딤플이 생기고 입력 저항이 두 배/세 배로 늘어납니다.
    18. 주사기 또는 구강 피펫을 사용하여 음압(흡입)을 적용합니다. -60mV의 유지 전위를 켭니다. 씰 저항은 기가옴을 통과할 때까지 증가해야 합니다.
      알림: 전극을 채우고 셀에 닿는 시간을 줄이려면 빠르게 작업하십시오. 단계 5.3.5에서 천공 패치 내부 용액에 첨가된 암포테리신이 전극 팁에 도달하기까지는 제한된 시간이 있습니다. 팁이 암포테리신으로 오염되면 고저항 씰을 형성하기 어렵고 저항은 종종 ~200메가옴으로 정체됩니다.
    19. 기가옴 씰이 형성되면 음압을 해제합니다. 씰이 형성되자마자 빠른 커패시턴스 보상을 적용하여 멤브레인 테스트 모드에서 피펫 커패시턴스 과도 전류의 진폭을 최대한 줄입니다.
    20. 암포테리신이 작동하기 시작하면 입력 저항이 서서히 감소하고 5mV 전압 단계에 응답하여 흐르는 전류가 암포테리신이 멤브레인에 들어가면서 점진적으로 증가하는 것을 관찰하십시오. 점진적인 안정화 대신 직렬 저항의 급격한 감소는 자연 파열이 발생했음을 시사합니다.
    21. 증폭기의 용량성 과도 널링 함수를 사용하여 전체 셀 커패시턴스와 직렬 저항을 추정합니다. 실험 시작 시와 실험 중에 정기적으로 직렬 저항을 문서화하고 모니터링합니다.
      알림: 직렬 저항은 전극의 크기와 피펫에 유입되는 깨끗한 용액의 양에 따라 안정화되는 데 5-20분이 소요될 수 있습니다. 전압 클램프 및 전류 클램프 모드는 직렬 저항이 30메가옴 미만으로 안정화되면 사용할 수 있습니다. 기록 중 뉴런의 팽창 또는 수축이 때때로 관찰되지만 용액의 삼투압과 pH가 올바르게 조정되는 경우는 드뭅니다.

결과

전압 단계 제품군을 적용하여 전압 클램프 프로토콜을 실행하면 다양한 전류 제품군의 전압 종속 활성화를 알 수 있습니다. VGN으로부터 유발되고 공개된 기록(13)으로부터 적응된 전체 셀 전류의 대표적인 예들이 도 1A,B에 도시되어 있다. 탈분극 전압을 적용하면(그림 1B) 매우 빠르게 활성화 및 비활성화되는 내부 전류(일...

토론

여기에 제시된 방법은 고립된 뉴런의 기록에 특화되어 있습니다. 이전 연구는 반온전한 준비에서 축삭 말단의 기록에 중점을 두었습니다. 기존 터미널 기록 기술과 비교할 때 절연 기록은 우수한 공간 클램프 및 등전위 동작을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 전정 상피의 반온전한 기록에서 꽃받침을 함유한 하위 집단만 접근할 수 있기 때문에 더 광범위한 뉴런 샘플에 대한 접근을 제공합니다....

공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

우리는 이러한 방법에 대한 초기 기여에 대해 Jing Bing Xue 박사와 Ruth Anne Eatock 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH NIDCD R03 DC012652 및 NIH NIDCD DC012653S, R01 DC0155512 RK 및 T32 DC009975 DB, NN 및 KR의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AmphotericinSigma-AldrichA4888-100MGFor perforated patch recordings.
ATP di-sodiumSigma-AldrichA7699Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504044additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifugeUSA Scientific2641-0016
Bunsen burner
CaCl2J.T. Baker1311-01Additive to internal solution
CollagenaseSigma-AldrichC5318one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 Warner Instruments64-0707
DMSOBiotium90082
Dnase I,from bovine pancreasSigma-Aldrich11284932001one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt)Fine Science Tools11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine)Fine Science Tools11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine)Fine Science Tools11255-20
EGTASigma-AldrichE0396Additive to internal solution
Electrode PullerNarashigePC-10
Epi-illumination light source Zeiss CL 1500 ECO
EthanolDecon Labs2716for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodesSutter InstrumentsBF140-117-10
Fine-edged dissection bladeFine Science Tools10010-00
Glass Pasteur PipettesVWR14673-010to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16140063additive to culture medium
HEPESSigma-AldrichH3375-100Gfor pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers VWR76549-914
Insulated bucket filled with iceto keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium SulfateSigma AldrichP9458-250GAdditive to internal solution
KClSigma-AldrichP93333Additive to internal solution
KOH (1 M)Honeywell319376-500MLTo bring internal solution to desired pH.
Large Spring ScissorsFine Science Tools14133-13
Leibovitz medium Sigma AldrichL4386dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishesWarner Instruments64-0236
luer-lok syringes, 30 mlBD302832for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax SupplementFisher Scientific41-090-101base of the culture medium
MgCl2-HexahydrateSigma-AldrichM1028Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge World Precision InstrumentsMF34G
MicroforgeNarashigeMF-90For electrode polishing.
N2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502-048additiive to culture medium, for SGN
NaClSigma-AldrichS7653Additive to internal solution
NaOH (1 M)Thomas Scientific319511-500MLfor titration pH
OsmometerAdvanced Instruments Inc.3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubingUSC Material ManagementMEDOX200 (Identifier: 00015)for dissolving into dissection and bath solutions
ParafilmBemisPM992
Pasteur pipette bulb (3 ml)Fisher Scientific03-448-25bulb for trituration pipettes
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) MWI Animal Health15199for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer Nalgene566-0020for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm CELLTREAT229747for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mmGenessee Scientific32-103for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mmMidland ScientificP7455for gross dissection
pH MeterMettler ToledoModel S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliterUSA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dishMattekP35GC-0-10-Cto plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishesWarner Instruments64-0375
Reference CellWorld Precision InstrumentsRC1T
Scalpel bladeMiltex4-315
Scalpel HandleFine Science Tools10003-12
Scientific ScaleMettler ToledoXS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliterFisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)Warner Instruments64-0378
Small Animal GuillotineKent ScientificDCAP
Small animal guillotineKent ScientificDCAPfor decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope ZeissStemi 2000
Straight surgical scissorsFine Science Tools14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
TrypsinSigma AldrichT1426one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe Covidien8881500105for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting EdgeFine Science Tools15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
VortexVWR945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)Millipore-SigmaCDUFBI001

참고문헌

  1. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  2. Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
  3. Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
  4. Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
  5. Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
  6. Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
  7. Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
  8. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  9. Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
  10. Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
  11. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
  12. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
  13. Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
  14. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
  15. Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
  16. Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
  17. Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
  18. Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
  19. Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
  20. Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
  21. Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
  22. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
  23. Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
  24. Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
  25. Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
  26. Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
  27. Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
  28. Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
  29. Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
  30. Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
  31. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
  32. Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
  33. Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
  34. Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).

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